專利名稱：甜葉甙r1及其衍生物作為制備防治神經退行性疾病的藥物的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及甜葉甙R1及其衍生物作為制備防治神經退行性疾病的藥物的應用。
背景技術：
神經退行性疾病是指人體的神經元發生退行性變化而引起的一系列病癥，多發生在老年人，大大影響了人們的生活質量，例如帕金森病(Parkinson’sdisease，PD)和老年性癡呆癥(Alzheimer’s disease，AD)就是兩種發病率較高的神經退行性疾病；其它神經退行性疾病包括有肌萎縮性側索硬化癥(ALS)、神經纖維瘤病、Huntington病、肌陣攣性癲癇、家族失明性白癡、脫髓鞘性疾病、脊髓損傷等。美國前總統克林頓在其卸任前的述職演說中將神經退行性疾病列為醫學界面臨的迫切任務之一。
證據表明，神經元死亡而導致神經元丟失是神經退行性疾病的主要病理特征。長期以來，人們對大腦中神經退行性疾病的“治本”還束手無策，一般只能采取一些“治標”的方法，使病人通過服用或靜脈注射特定的化學藥物來補充大腦神經元匱乏的物質。如針對PD病人腦內多巴胺不足，用其前體左旋多巴補充，或通過移植胎兒神經細胞以取代已消失的多巴胺神經細胞；又如，針對AD腦內乙酰膽堿不足，用膽堿酯酶抑制劑提高其濃度。但是，這些“治標”的方法，由于不能控制神經元丟失的病理特征，所以，無法控制疾病的發展；同時，由于神經退行性疾病的治療要求藥物在腦內有一定的血藥濃度，而血腦屏障大大降低了該濃度，在腦內血藥濃度可能未達到有效濃度，而在體內其他部位，該濃度卻已產生了一定的毒副作用，因而，現有的藥物的治療效果差。
甜葉甙R1是從茅莓(Rubus parvifollus L)全株植物中提取的化合物，其分子式為C36H56O12·2H2O，分子量為716。茅莓是一味草藥，因其具有散瘀、止痛、解毒、化痰、殺蟲的功效，所以民間常用于治療吐血、痢疾、疥瘡、痔瘡、瘰疬、跌打刀傷、產后淤滯腹痛等，可以增加冠脈流量，增加缺氧耐受力。另外，已發現甜葉甙R1還在以下植物中可以分離提取華東覆盆子(薔薇科)、小葉懸鉤子(薔薇科)、托盤(薔薇科)、覆盆子(薔薇科)、柴胡(傘形科)、熊果(杜鵑花科)、毛泡桐(玄參科)、梔子(茜草科)、濕生篇蕾(龍膽科)、女貞(木樨科)、毛子草，亦即馬桶花(紫威科)。
甜葉甙R1，化學結構如下所示 其系統命名為2α，3β，19α-三羥基-12-烯-23，28-雙羧酸-28-β葡吡喃糖酯-三萜。迄今為止，未有茅莓、甜葉甙R1及其衍生物在神經科學領域應用的具有實質意義的報道。
發明內容
本發明的目的就在于提供茅莓、甜葉甙R1及其衍生物作為防治神經退行性疾病的藥物的應用，這種應用從“治本”的角度作用于神經退行性疾病的神經元死亡，從而達到防治神經退行性疾病的目的。
我們使用薔薇科懸鉤子屬茅莓(Rubus parvifollus L)全株植物成功地使得患有帕金森病的患者的癥狀緩解，進一步研究，我們從茅莓中提取出甜葉甙R1，用MPTP和6-OHDA制備帕金森病動物模型，研究發現甜葉甙R1可明顯緩解帕金森病動物的癥狀。藥理實驗表明，其對神經元死亡具有保護性干預作用，故其對帕金森病具有“治本”的作用。而且，進一步實驗表明，該化合物可用于治療一系列以“神經元死亡”為特征的神經退行性疾病，不僅對PD，而且對其他神經退行性疾病如AD、肌萎縮性側索硬化癥(ALS)、神經纖維瘤病、Huntington病、肌陣攣性癲癇、家族性失明性白癡、脫髓鞘性疾病、脊髓損傷等的預防、治療也具有很高應用價值，同時，實驗表明，其治療指數高，安全性好。
甜葉甙R1是五環三萜類化合物，可以在以下各位發生取代。
式1其中R1，R2，R3＝OH，鹵素，H，-O(CH2)nH， R4＝H，一、二價金屬鹽離子，-(CH2)nH，
R5＝五碳、六碳、七碳單糖或雙糖，n≤5經過初試，上述經取代的化合物均具有與甜葉甙R1相同或相類似的藥理作用。
本發明的甜葉甙R1及其衍生物由于具有一定的水溶性和脂溶性，能夠經過胃腸道吸收，以及通過血腦屏障，因而可以采用口服劑型如制成片劑、顆粒劑、膠囊劑，也可以制成注射劑，還可以制成透皮吸收制劑如膜劑、乳劑、懸浮劑等，通過皮膚吸收進而經過血液循環通過血腦屏障進入靶點。
本發明的甜葉甙R1及其衍生物可以與目前常用的制劑輔料，按照常規的制劑方法制成上述各種制劑。
本發明的甜葉甙R1及其衍生物的使用劑量為口服劑量每天1～10mg/kg體重；注射劑量降低一半。
本發明的甜葉甙R1及其衍生物可以與左旋多巴復方制成復方制劑，以減輕左旋多巴對黑質紋狀體多巴胺能神經元的損害。
以下
具體實施例方式
是對本發明的進一步說明，決非是對本發明的任何限制。
具體實施例方式
實施例1.甜葉甙R1(Suavissimoside R1)的提取我們采用薔薇科懸鉤子屬植物茅莓(Rubus parvifollus L)全株植物，利用其干燥粉末，用乙醇回流提取多次后，提取液回收乙醇。殘渣用石油醚去除脂溶性成分后懸浮于水中，用乙酸乙酯萃取，萃取物溶于甲醇中拌硅膠過層析柱，用石油醚∶乙酸乙酯梯度洗脫，分得無色針狀結晶性成分。我們發現該成分易溶于甲醇、乙醇、堿性水溶液等溶劑；溶于乙酸乙酯、丙酮等溶劑；微溶于水；不溶于氯仿、石油醚、乙醚、二氯甲烷等溶劑。按上述提取方法，得率約1‰，該成分遇香藍醛濃硫酸液加熱變藍色，熔點為247.4-248.8℃。經鑒定，該成分為甜葉甙R1(Suavissimoside R1)。
實施例2.甜葉甙R1對MPTP誘導的帕金森氏病動物的作用1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP)是一種白色粉末狀神經毒素，可特異地破壞多巴胺能神經細胞，從而損害大腦內黑質紋狀體通路，使人與動物出現酷似帕金森氏病的癥狀。MPTP用生理鹽水配成所需濃度。
參照Tatton等實驗方法(Neuroscience，1997；771037-1048)選取雄性C57BL型小黑鼠60只，隨機分為生理鹽水(NS)組、MPTP(M)組和甜葉甙R1+MPTP(CH)三個劑量組，每組20只。實驗第一天，CH組分別灌胃甜葉甙R1 1、3、10mg kg，第二天CH組先灌胃甜葉甙R1(劑量同第一天)，30min后同MPTP組一起腹腔注射MPTP 30mg/kg，NS組腹腔注射等容量的生理鹽水，連續5天。在MPTP末次注射后第7天，每實驗組取兩只小鼠，用10％水合氯醛麻醉后，從左心室進針進入主動脈，順序灌注血管沖洗液和4％PFA各50ml。血管沖洗液成分為PBS 1000ml，1％NaNO2 2ml，肝素0.02g和NaCl 9g。小鼠斷頭取全腦，4％PFA中室溫浸泡2小時后轉移至30％蔗糖溶液中4℃過夜。利用冰凍切片機于黑質致密部切取35μm的腦片，懸浮于24孔板內的PBS液中。每隔5片取一片做酪氨酸羥化酶(TH)的免疫組化，觀察黑質內殘余多巴胺神經元的情況。在MPTP末次注射后第10天，各實驗組的小鼠在完成了行為學的檢測后，頸椎脫臼致死。取全腦，沸水中煮2分鐘后，小心地剝離紋狀體，稱重后保存于-70℃，準備利用高效液相分析紋狀體內多巴胺含量。
觀察指標有黑質殘存多巴胺神經元計數，行為學的評分和紋狀體多巴胺含量。
(1)甜葉甙R1保護了MPTP誘導的黑質多巴胺神經元的丟失
圖1為甜葉甙R1保護了MPTP誘導的黑質多巴胺神經元的丟失的實驗結果圖。其中圖1A為腦冰凍切片的免疫組化實驗后的圖片，圖1B為圖1A的計數圖。
在MPTP末次注射后7天，用ABC法檢測黑質內殘余多巴胺能神經元的數目。結果發現與溶劑對照組相比，MPTP導致黑質內多巴胺能神經元的大量丟失(圖1A.b)，大約只殘留對照組的57.06±6.35(P＜0.01)(圖1.f)；而甜葉甙R1減少了因MPTP毒性所引起的多巴胺能神經元的丟失(圖1A.c-e)。在甜葉甙R1的高濃度組(10mg/kg)，黑質內多巴胺能神經元的數目與溶劑對照組的相近，即達到了正常水平。
多巴胺神經元以酪氨酸羥化酶(TH)的免疫組化來鑒定(圖1A)。MPTP末次注射后7天，各實驗組中腦組織固定后切厚35μm的冰凍切片。(a)溶劑對照組；(b)MPTP處理組；(c)MPTP和1mg/kg甜葉甙R1處理組；(d)MPTP和3mg/kg甜葉甙R1處理組；(e)MPTP和10mg/kg甜葉甙R1處理組。注意MPTP注射后，黑質TH陽性細胞明顯減少(a vs.b)，而甜葉甙R1可濃度依賴性地增加黑質TH-陽性細胞數(c-e)。圖片來源于三次獨立的實驗(放大40×)。(f)黑質TH-陽性細胞數。甜葉甙R1在3和10mg/kg的濃度時可以明顯保護MPTP誘導死亡的TH-陽性細胞(圖1B，P＜0.01，甜葉甙R1組與MPTP組相比)。
(2)甜葉甙R1提高了MPTP降低的紋狀體多巴胺的水平圖2為甜葉甙提高了MPTP降低的紋狀體多巴胺的水平的結果圖。其中圖2A為計數圖，圖2B為對數量效曲線圖。
在MPTP末次注射后十天，我們檢測了紋狀體內多巴胺的濃度。與對照組(7.80±1.07ng/mg)相比，MPTP引起了紋狀體多巴胺濃度的大幅度下降，只有1.47±0.29ng/mg(P＜0.01)；而甜葉甙R1卻能濃度依賴性地提高紋狀體多巴胺的含量(圖2)，甜葉甙R1 1、3、10mg/kg分別使多巴胺濃度上升至2.15±0.18、3.04±0.30和5.05±0.78(P＜0.01)。
圖2.甜葉甙R1提高了MPTP降低的紋狀體多巴胺的水平。在MPTP末次注射后十天，用高效液相測定紋狀體多巴胺濃度。數據以平均值±標準誤的形式表達。*＝P＜0.01，與溶劑對照組相比；**＝P＜0.01，與MPTP處理組相比。回歸方程Y＝2.01+3.02 lg X。r＝0.99(3)甜葉甙R1改善了PD小鼠的行為學異常在MPTP末次注射后十天，對PD小鼠實施行為學檢查。檢查內容為爬桿試驗(pole test)和懸掛實驗(traction test)。
①爬桿試驗(pole test)目的檢測小鼠肢體運動協調情況。
方法將一直徑為2.5厘米的軟木小球固定于一根長50厘米粗1厘米的木桿頂端，木桿上纏上紗布以防打滑，然后將被測小鼠放到小球上，并記錄以下幾個時間小鼠在頂球上停留的時間；小鼠爬完桿子的上半部分所用的時間；小鼠爬完桿子的下半部分所用的時間。然后按以下標準計分3秒內完成上述某一動作的記3分；6秒內完成的記2分；超過6秒的記1分。最后計算三項累計得分情況，并作統計學分析。
②懸掛實驗(traction test)目的檢測小鼠肢體運動協調情況。
方法將受試小鼠兩前爪懸于一水平電線上，如小鼠用兩后爪抓住電線則記3分；如用一后爪抓住電線則記2分。如果小鼠兩后爪均抓不住電線則記1分，最后計算得分情況，并作統計學分析。
實驗結果顯示在MPTP撤離后，我們從爬桿試驗、懸掛試驗和游泳試驗中清楚地觀察到實驗動物肢體運動的不協調性(圖3)。在爬桿試驗中，對照組小鼠爬完桿子的上半部分所用的時間和爬完桿子的下半部分所用的時間要比MPTP組的少得多。其中，對照組小鼠爬完桿子的上半部分和下半部分所用的時間分別為2.61秒和3.94秒；而MPTP組小鼠則分別用了7.21秒和8.63秒(P＜0.01)。與MPTP組相比，甜葉甙R1使所用時間明顯減少，高濃度組(10mg/kg)所用的時間與對照組相仿。
在懸掛試驗中，對照組小鼠用四肢抓住電線，而MPTP組小鼠卻只能用前爪抓住電線，后爪無力；甜葉甙R1處理的小鼠雖然有的后爪仍然運動受阻，但至少可以用一只后爪抓住電線，表明后肢運動有所改善。
圖3.在MPTP末次注射后十天進行實驗鼠的行為學測試。爬桿和懸掛實驗的實施和評分按照方法學介紹的進行。數據以平均值±標準誤的形式表示。(*＝P＜0.01與溶劑對照組相比；**＝P＜0.01與MPTP實驗組相比。
實施例4. 6-羥基多巴(6-OHDA)誘導的帕金森氏病模型雄性Wistar大鼠，200~250g。腹腔注射戊巴比妥鈉(45mg/kg)麻醉后固定于立體定位儀上，于右側兩點注入新配、冷卻保存的6-OHDA生理鹽水溶液(2mg/ml，內含抗壞血酸0.2mg/ml)，損毀中腦紋狀體通路。第一點tooth bar＝-2.4mm，A＝-4.4mm，L＝+1.2mm(右側)，V＝+7.8mm(深度)，注入3μl。第二點tooth bar＝+3.4mm，A＝-4.0mm，L＝+0.75mm(右側)，V＝8.0mm(深度)，注入3μl。留針3min，對側腦區進行無藥的同溶質對照注射。術后一周皮下注射APO 0.5mg/kg誘發其向左側旋轉，每隔5min觀察一次大鼠的旋轉圈數，每次1min，總共記錄40min。平均旋轉圈數超過7次的為成功的PD鼠模型。
從上述成功模型中隨機挑出30只，分成三個實驗組(每組均為10只PD模型)，一組未治療組(口服灌胃等容積雙蒸水，含3％酒精)，另倆組分別灌胃0.5、1.5mg/kg，一天兩次，共五周，觀察APO誘發旋轉行為的改變。實驗結果顯示甜葉甙R1組的每分旋轉次數較未治療組減少(圖4)。
圖4.甜葉甙R1對6-OHDA旋轉模型的改善作用。甜葉甙R1 0.5、1.5mg/kg口服灌胃，一天兩次，維持五周后，高劑量組甜葉甙R1可明顯減少皮下注射0.5mg/kg APO所誘發的實驗鼠旋轉圈數。*P＜0.05。
實施例5.甜葉甙R1的急性毒性實驗按國家藥政管理規定，用昆明種封閉群健康小白鼠，體重20.0±0.5g，雌雄各25只，中山醫科大學動物中心提供。隨機分為五組，雌雄各5只，經口服灌胃一次性給藥，劑量分別為1、10、100、1000、5000mg/kg，記錄小鼠毒性反應情況和死亡動物分布，以Bliss統計法測定LD50值。LD50約為2600mg/kg，95％可信區間為2218~2982mg/kg；治療指數約為80，說明甜葉甙R1毒性低，安全性好。
實施例6.甜葉甙R1的慢性毒性實驗實驗動物Wistar大白鼠，6周齡，100～120g，80只，雌雄各半。
實驗方法隨機將大白鼠分成4組，對照組及三個實驗組(30mg/日，90mg/日，270mg/日，灌胃)。每組各20只，雌雄各半。一次性腹腔注射，連續觀察90天。
檢測方法(1)動物一般表現。(2)血常規及血生化指標。血紅蛋白，紅細胞，白細胞及分類。轉氨酶，尿素氮，肌酐，膽固醇，甘油三酯，血糖，總蛋白，白蛋白。(3)病理學檢查肝，腎，胃，睪丸，卵巢。
其結果表明(1)對大白鼠食欲、生長發育無影響，與對照組一樣，體重增加，生長曲線為遞增狀態，而且毛發光潔，無脫毛，皮膚健康，活動正常，與對照組比較，無組間差異，P值＞0.05。
(2)大白鼠尿液、血液、生化等各項規定指標均在正常值范圍內，與對照組比較，無組間差異，P值＞0.05。
(3)對大白鼠的心、肝、脾、肺、腎等各器官未引起器質性改變。
慢性毒性實驗結果表明甜葉甙R1毒性小，使用安全。
實施例7. 2％濃度的甜葉甙R1注射液的制備稱取甜葉甙R1 20克，9克NaCl溶于1000毫升注射用水中，溶解、超微濾膜過濾，即制成濃度為2克/100毫升(2％)的注射液，滅菌、分裝。
實施例8.茅莓顆粒劑的制備取茅莓干燥全草10kg，經過乙醇提取后，回收乙醇，制成浸膏，加淀粉、蔗糖適量，干法制粒，烘干，制成約0.2kg沖劑，分裝成10包，即得。
取上述茅莓顆粒劑，予已出現帕金森疾病的自愿者服用，每日三次，每次一包，其癥狀得到迅速緩解。
實施例9. 2α，3β，19α-三羥基-12-烯-23-羧酸乙酯-28-β葡吡喃糖酯-三萜的制備在乙醇中，加入少量濃H2SO4，加甜葉甙R1，充分攪拌，甜葉甙R1的23位的羧基發生酯化反應，加堿調至近中性，揮去乙醇，加水振蕩，有懸浮物懸浮于水中，用乙酸乙酯萃取，過層析柱純化，取得2α，3β，19α-三羥基-12-烯-23-羧酸乙酯-28-β葡吡喃糖酯-三萜。
將上述化合物進行實施例2的實驗，取得與實施例2中甜葉甙R1相類似的結果。
實施例10. 2α，3β，19α-三溴-12-烯-23，28-雙羧酸-28-β葡吡喃糖酯-三萜的制備將甜葉甙R1溶于HBr水溶液中，加入Br2水，60℃充分振蕩，經鹵代反應，即制得上述化合物，提取，純化。
將上述化合物進行實施例4的實驗，取得與實施例4中甜葉甙R1相類似的結果。
實施例11.將甜葉甙R1的28位的葡萄糖置換成乳糖即R5＝乳糖。
在甜葉甙R1甲醇溶液中，加入少量NaOH溶液，使之呈堿性，水解，游離葡萄糖；H2SO4調至酸性，加入乳糖，加熱，60℃充分振蕩，即制得上述化合物。
將上述化合物進行實施例2的實驗，取得與實施例2中甜葉甙R1相類似的結果。
本發明的甜葉甙R1的衍生物不限于上述實施例，其它實施例均與上述實施例具有相類似的效果。
權利要求
1.茅莓作為制備防治神經退行性疾病的藥物的應用。
2.式1所示的化合物作為制備防治神經退行性疾病的藥物的應用， 式1式中R1，R2，R3＝OH，鹵素，H，-O(CH2)nH， R4＝H，一、二價金屬鹽離子，-(CH2)nH，R5＝五碳、六碳、七碳單糖或雙糖，n≤5
3.根據權利要求2所述的式1化合物作為制備防治神經退行性疾病的藥物的應用，其特征在于所述的化合物為甜葉甙R1。
4.根據權利要求2或3所述的式1化合物作為制備防治神經退行性疾病的藥物的應用，其特征在于所述的化合物作為防治帕金森氏疾病的藥物的應用。
5.根據權利要求2或3所述的式1化合物作為制備防治神經退行性疾病的藥物的應用，其特征在于所述的化合物作為防治老年性癡呆的藥物的應用。
6.根據權利要求2或3所述的式1化合物作為制備防治神經退行性疾病的藥物的應用，其特征在于所述的化合物與其它輔料配伍制成口服制劑。
7.根據權利要求2或3所述的式1化合物作為制備防治神經退行性疾病的藥物的應用，其特征在于所述的化合物與其它輔料配伍制成注射制劑。
8.根據權利要求2或3所述的式1化合物作為制備防治神經退行性疾病的藥物的應用，其特征在于所述的化合物與其它輔料配伍制成透皮吸收制劑。
9.根據權利要求2或3所述的式1化合物作為制備防治神經退行性疾病的藥物的應用，其特征在于所述的化合物與左旋多巴配伍制成復方制劑。
全文摘要
茅莓、甜葉甙R1及其衍生物作為制備防治神經退行性疾病的藥物的應用，通過動物體及人體試驗，表明其對神經退行性疾病包括帕金森氏病、老年性癡呆等具有良好的治療作用，且其治療指數高，安全性好。
文檔編號A61P25/16GK1608628SQ200310111889
公開日2005年4月27日 申請日期2003年10月24日 優先權日2003年10月24日
發明者陳汝筑, 于占洋 申請人:中山大學