專利名稱：一種包埋抗癌藥物的微膠囊的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種制備層—層組裝微膠囊及用該微膠囊包埋抗癌藥物的方法，尤其是一種具有良好水分散性、儲存穩定性和緩釋性能的微膠囊及其制備技術。
背景技術：
在臨床實踐中，治療腫瘤的一個常規方法是化療，即用化學藥物進行腫瘤的治療。柔紅霉素和阿霉素能嵌入DNA雙螺旋中與DNA結合，使其模板發生改變，抑制DNA和RNA聚合酶，阻止DNA和RNA的合成，為細胞周期非特異性藥物。臨床用于急、慢性白血病，惡性淋巴瘤、胃癌、肝癌等，為廣譜抗癌藥物。然而，這兩種藥物毒性較大，除了能夠殺死癌細胞之外，對正常細胞也有強烈的殺傷作用。因此，給藥時有必要采取一定措施使血藥濃度低于一定水平，并常常采用藥物的緩釋技術來實現。
通常用于藥物緩釋的微囊和微球制劑由乳液方法加以制備。由于有機溶劑和乳化劑的使用，不僅可能造成環境污染，而且不能保證完全除去制劑中對人體有害的有機溶劑和乳化劑。另外，乳液法制備的微囊或微球的通透性以及緩釋性能通常難以在微觀尺度上加以調控。因此，找到一種具備環境友好、緩釋性能可精確調控，并具有良好綜合性能的藥物載體，是極具挑戰性的工作。
采用層—層自組裝方法制備的微膠囊，其制備過程在水中進行，可避免對環境的污染。微膠囊尺寸由模板精確控制，而其壁厚可控制在納米尺度內，通過調整囊壁厚度，即可精確調控微膠囊的滲透性以及緩釋性能。
發明內容
本發明的目的是提供一種包埋抗癌藥物的微膠囊的制備方法，將抗癌藥物包埋于微膠囊內，并具有良好的藥物緩釋性能，制備過程無環境污染。
本發明的包埋抗癌藥物的原理，是利用在形成膠體微粒過程中，在膠體微粒內部預先引入聚電解質微凝膠來實現抗癌藥物在微膠囊中包埋。
本發明包括以下步驟1)在濃度為0.001-0.1M/L的含鈣無機鹽水溶液中加入帶有負電荷的聚電解質，攪拌下加入濃度為0.001-0.1M/L的含碳酸根無機鹽水溶液，帶負電荷的聚電解質在混合物中的終濃度為1～10mg/mL，攪拌下反應1～30分鐘，離心過濾，得內部含有帶負電荷聚電解質的CaCO3膠體微粒；2)在0.2～0.5M/L的NaCl溶液中，將濃度為1～2mg/mL的具有正電荷的聚電解質與步驟1)的CaCO3膠體微粒混和，離心棄上清液，再加入水使CaCO3膠體微粒重新分散，離心棄上清液，如此用水反復洗滌，得到第一層包覆有帶正電的聚電解質的CaCO3膠體微粒；再在0.2～0.5M/L的NaCl溶液中，將CaCO3膠體微粒加入濃度為1～2mg/mL的具有負電荷的聚電解質，離心棄上清液，再加入水使CaCO3膠體微粒重新分散，離心棄上清液，如此用水反復洗滌，得到第二層包覆有帶負電的聚電解質；重復以上過程，按預期的層數分別將帶有正電和負電的聚電解質層層自組裝，得到核—殼結構的膠體微粒，通過溶解或分解方法去除CaCO3膠體微粒，得到中空微膠囊，微膠囊中含有預先包埋到微粒中的荷負電的聚電解質；3)在4～70℃溫度下，將步驟2)所得的中空微膠囊在濃度為0.01～500mg/mL的抗癌藥物的水溶液中孵化0.5～12小時，使藥物包埋到微膠囊中，得到載藥微膠囊；，本發明中，所說的含鈣無機鹽可以是硝酸鈣或氯化鈣，含碳酸根無機鹽可以是碳酸鈉或碳酸氫氨。所說的分解去除CaCO3膠體微粒可以采用鹽酸分解或乙二胺四乙酸絡合。所說的抗癌藥物是柔紅霉素或阿霉素。
本發明中，所說的帶負電荷的聚電解質是聚苯乙烯磺酸鈉。所說的帶正電的聚電解質可以采用聚烯丙基胺鹽酸鹽或接枝有聚乙二醇的聚烯丙基胺鹽酸鹽。通常為提高微膠囊的生物相容性，采用接枝有聚乙二醇的聚烯丙基胺鹽酸鹽為好。
上述接枝有聚乙二醇的聚烯丙基胺鹽酸鹽通過如下步驟合成得到1)將1～50mg/mL對甲苯磺酰氯的吡啶溶液攪拌下加入1～100mg/mL的單甲氧基聚乙二醇的二氯甲烷溶液中，室溫下反應1～12小時；2)取1～5mmol活化的聚乙二醇攪拌加入到1～100mg/mL的聚烯丙基胺鹽酸鹽溶液中，室溫反應1～24小時；3)將得到的反應產物透析除去小分子雜質，冷凍干燥后得終產物聚烯丙基胺接枝聚乙二醇；通過改變聚電解質組裝的層數或者改變聚電解質溶液中NaCl的濃度，可在納米尺度精確調控微膠囊的囊壁微結構和厚度，從而達到控制藥物釋放的速度。
本發明的優點在于
(1)無毒性。本發明采用的材料沒有生理毒性，制備過程完全在水中完成，無環境污染的隱患。
(2)良好的生物相容性。本發明以生物相容性良好的聚烯丙基胺接枝聚乙二醇為組裝材料，具有良好的組織相容性，在體內不會造成組織的不良反應。
(3)可控性。通過簡單控制模板微粒的尺寸可精確控制微膠囊的大小，通過控制組裝的聚電解質的層數可調控微膠囊的通透性和緩釋性能。
(4)優異的穩定性。本發明制備的微膠囊在水中可長期穩定儲存。
(5)適用范圍廣。本發明的制作工藝可適用于包埋多種水溶性藥物，同時該注射制劑既可直接應用，也可與其它高分子材料結合后使用。
(6)制備工藝簡單，條件溫和。
圖1制備的含有聚電解質凝膠的CaCO3微粒的掃描電鏡照片。
圖2包埋有羅丹明后的微膠囊的激光共聚焦顯微鏡照片。
圖3聚烯丙基胺鹽酸鹽(PAH)及聚烯丙基胺鹽酸鹽接枝聚乙二醇(PAH-g-PEG)的紅外譜圖。
圖4聚烯丙基胺鹽酸鹽(上)及聚烯丙基胺鹽酸鹽接枝聚乙二醇(下)的1HNMR譜圖。
圖5羅丹明標記的PAH-g-PEG作為微膠囊最外層時微膠囊的激光共聚焦顯微鏡照片。
圖6(a)空白微膠囊，(b)柔紅霉素(DNR)和(c)阿霉素(ADM)包埋到微膠囊后的透射電鏡照片。
圖7(a)空白微膠囊，(b)柔紅霉素和(c)阿霉素包埋到微膠囊內的原子力顯微鏡圖片。
圖8不同初始藥物濃度下微膠囊內部的藥物濃度。
圖9不同溫度對柔紅霉素和阿霉素包埋量的影響。
圖10不同鹽濃度對柔紅霉素和阿霉素包埋量的影響。
圖11微膠囊層數對柔紅霉素和阿霉素包埋的影響。
圖12(a)微膠囊層數對柔紅霉素釋放的影響；圖12(b)微膠囊層數對阿霉素的釋放的影響。
具體實施例方式
以下實例進一步說明本發明，但這些實例并不用來限制本發明。
實例1
將50mL濃度為0.025M/L的硝酸鈣溶液與100mg聚苯乙烯磺酸鈉(PSS)混合，10分鐘后，快速加入50mL濃度為0.025M/L的碳酸鈉溶液。15分鐘后，將生成的含有PSS的碳酸鈣(表示為CaCO3(PSS))沉淀離心收集，用水洗滌3次，保存。制備的CaCO3(PSS)微粒的掃描電鏡照片見圖1。
將1mL(固含量5～10％)直徑為2～10μm的上述CaCO3(PSS)微粒置于2mL的離心管中。(1)離心去除上清，用水洗滌3次。(2)在0.2～0.5M/L的NaCl溶液中，加入1mL的聚烯丙基胺鹽酸鹽(PAH)溶液，振蕩離心管。10分鐘后，用水洗滌3次，去除多余的PAH，從而在CaCO3(PSS)表面吸附了一層PAH(表示為CaCO3(PSS)-PAH)。(3)然后在0.2～0.5M/L的NaCl溶液中，加入1mL的聚苯乙烯磺酸鈉(PSS)溶液，振蕩離心管。10分鐘后，用水洗滌3次，去除多余的PSS，從而在CaCO3(PSS)-PAH表面又吸附了一層PSS(表示為CaCO3(PSS)-PAH/PSS)。重復上述(2)、(3)過程，直至形成CaCO3(PSS)-(PAH/PSS)4PAH的核殼微粒。然后向此核殼微粒溶液加入濃度為0.1M/L的乙二胺四乙酸(EDTA)溶液，反應15分鐘，去除CaCO3微粒。用EDTA溶液重復洗滌2次。離心去除上清，用水洗滌3次，得到懸浮在水中的CaCO3(PSS)/(PAH/PSS)4PAH聚電介質中空微膠囊。
將20μL的微膠囊溶液和1μL濃度為0.2mg/mL的羅丹明溶液混合。10秒鐘后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察，發現羅丹明被包埋在微膠囊內，見圖2。
實例2(1)將2g(10mmol)的對甲苯磺酰氯(TsCl)溶于50mL的吡啶中。將5g(2.5mmol)的單甲氧基聚乙二醇溶于50mL的二氯甲烷中，攪拌加入上述TsCl的吡啶溶液。反應12小時。反應產物加3mol/L鹽酸50mL萃取，有機層加入2.5g NaHCO3，攪拌過濾，得聚乙二醇對甲苯磺酸酯(PEG-Ts)粗品。攪拌將PEG-Ts粗品溶于5mL THF中，用乙醚沉析3次。真空干燥后得PEG-Ts純品。(2)取2.38g(1.09mmol)PEG-Ts，加入0.4335g(0.0062mmol)PAH的硼砂溶液(pH＝9.18)，攪拌，室溫反應24h。(3)將所得產物透析足夠長時間，以除去小分子雜質。冷凍干燥后得終產物聚烯丙基胺接枝聚乙二醇(PAH-g-PEG)。
取少量接枝反應的產物PAH-g-PEG和PAH，測量其紅外光譜和核磁共振氫譜，見圖3和圖4，證明所得化合物為PAH-g-PEG。
實例3按實例1制備微膠囊，但最后一層用羅丹明標記的PAH-g-PEG代替PAH，得到CaCO3(PSS)/(PAH/PSS)4/PAH-g-PEG微膠囊。10秒鐘后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察，發現羅丹明標記的PAH-g-PEG組裝到微膠囊上，微膠囊具有中空而完整的結構(圖5)。
實例4按實例1制備微膠囊，得到組成為CaCO3(PSS)/(PAH/PSS)4/PAH的微膠囊。在室溫下，分別取1mL的微膠囊懸液和1mL濃度分別為1mg/mL的柔紅霉素和阿霉素溶液混和，12小時后離心，用水洗滌2次，制備透射電鏡試樣和原子力試樣。圖6(a)、(b)和(c)分別是空白微膠囊、包埋有柔紅霉素和阿霉素的微膠囊的透射電鏡照片。圖7(a)、(b)和(c)分別是空白微膠囊、包埋有柔紅霉素和阿霉素的微膠囊的原子力顯微鏡照片。這些照片證明柔紅霉素和阿霉素被包埋到微膠囊中。
實例5按實例1制備微膠囊，得到組成為CaCO3(PSS)/(PAH/PSS)4/PAH的微膠囊。在4℃下，分別取1mL的微膠囊懸液和不同濃度的柔紅霉素和阿霉素溶液混和，12小時后離心分離。通過紫外吸收光譜測定微膠囊內外的柔紅霉素和阿霉素濃度，證明藥物被成功地包埋到微膠囊內，且微膠囊內柔紅霉素和阿霉素的濃度高于本體溶液(圖8)。
實例6按實例1制備微膠囊，得到組成為CaCO3(PSS)/(PAH/PSS)4/PAH的微膠囊。分別取1mL的微膠囊懸液和1mL濃度分別為1mg/mL的柔紅霉素和阿霉素溶液，在4℃、25℃、37℃、50℃和70℃混和，12小時后離心分離，通過紫外吸收光譜測定微膠囊內外的柔紅霉素和阿霉素濃度，證明隨溫度升高，微膠囊內包埋的藥物量也隨之增大，見圖9。
實例7按實例1制備微膠囊，得到組成為CaCO3(PSS)/(PAH/PSS)4/PAH的微膠囊。分別取1mL的微膠囊懸液和1mL濃度分別為1mg/mL的柔紅霉素和阿霉素溶液，將它們在一系列不同濃度的NaCl溶液中混和。12小時后離心分離，通過紫外吸收光譜測定微膠囊內外的柔紅霉素和阿霉素濃度，表明在NaCl濃度為0-0.1M/L之間，藥物的包埋量較大，見圖10。
實例8按實例1相同的方法制備微膠囊，得到組成分別為CaCO3(PSS)/(PAH/PSS)4/PAH、CaCO3(PSS)/(PAH/PSS)5(最外層為去核后組裝)、CaCO3(PSS)/(PAH/PSS)5/PAH(最外層和次外層為去核后組裝)和CaCO3(PSS)/(PAH/PSS)4/PSS/PAH-g-PEG(最外層和次外層為去核后組裝)的微膠囊。分別取1mL的上述四種微膠囊懸液和1mL濃度分別為1mg/mL的柔紅霉素和阿霉素溶液混和。12小時后離心分離，通過紫外吸收光譜測定微膠囊內外的柔紅霉素和阿霉素濃度。證明去核后組裝一層對藥物包埋量影響不大，而去核后組裝兩層聚電解質則可顯著降低藥物的包埋量；采用PAH-g-PEG進行組裝與相同層數的微膠囊相比，對包埋量影響不大，見圖11。
實例9按與實例1相同的方法制備微膠囊，得到組成分別為CaCO3(PSS)/(PAH/PSS)4/PAH、CaCO3(PSS)/(PAH/PSS)5(最外層為去核后組裝)、CaCO3(PSS)/(PAH/PSS)5/PAH(最外層和次外層為去核后組裝)和CaCO3(PSS)/(PAH/PSS)4/PSS/PAH-g-PEG(最外層和次外層為去核后組裝)的微膠囊。分別取1mL的上述四種微膠囊懸液和1mL濃度分別為1mg/mL的柔紅霉素和阿霉素溶液混和。12小時后離心分離，于37℃下加入1mL水。每隔一定時間離心一次，取出上清0.9mL，補充等體積的水。取出的上清通過紫外吸收光譜測定其吸收值，通過與已知濃度的標準曲線相比較，計算釋放出來的柔紅霉素和阿霉素濃度。柔紅霉素和阿霉素的累積釋放量與時間的關系見圖12，證明所包埋的抗癌藥物能夠以緩釋的方式釋放出來。
權利要求
1.一種包埋抗癌藥物的微膠囊的制備方法，其特征是包括以下步驟1)在濃度為0.001-0.1M/L的含鈣無機鹽水溶液中加入帶有負電荷的聚電解質，攪拌下加入濃度為0.001-0.1M/L的含碳酸根無機鹽水溶液，帶負電荷的聚電解質在混合物中的終濃度為1～10mg/mL，攪拌下反應1～30分鐘，離心過濾，得內部含有帶負電荷聚電解質的CaCO3膠體微粒；2)在0.2～0.5M/L的NaCl溶液中，將濃度為1～2mg/mL的具有正電荷的聚電解質與步驟1)的CaCO3膠體微粒混和，離心棄上清液，再加入水使CaCO3膠體微粒重新分散，離心棄上清液，如此用水反復洗滌，得到第一層包覆有帶正電的聚電解質的CaCO3膠體微粒；再在0.2～0.5M/L的NaCl溶液中，將CaCO3膠體微粒加入濃度為1～2mg/mL的具有負電荷的聚電解質，離心棄上清液，再加入水使CaCO3膠體微粒重新分散，離心棄上清液，如此用水反復洗滌，得到第二層包覆有帶負電的聚電解質；重復以上過程，按預期的層數分別將帶有正電和負電的聚電解質層層自組裝，得到核-殼結構的膠體微粒，通過溶解或分解方法去除CaCO3膠體微粒，得到中空微膠囊，微膠囊中含有預先包埋到微粒中的荷負電的聚電解質；3)在4～70℃溫度下，將步驟2)所得的中空微膠囊在濃度為0.01～500mg/mL的抗癌藥物的水溶液中孵化0.5～12小時，使藥物包埋到微膠囊中，得到載藥微膠囊。
2.根據權利要求1所述的包埋抗癌藥物的微膠囊的制備方法，其特征在于所說的含鈣無機鹽是硝酸鈣或氯化鈣，所說的含碳酸根無機鹽是碳酸鈉或碳酸氫氨。
3.根據權利要求1所述的包埋抗癌藥物的微膠囊的制備方法，其特征在于所說的帶負電荷的聚電解質是聚苯乙烯磺酸鈉。
4.根據權利要求1所述的包埋抗癌藥物的微膠囊的制備方法，其特征在于所說的帶正電的聚電解質是聚烯丙基胺鹽酸鹽或接枝有聚乙二醇的聚烯丙基胺鹽酸鹽。
5.根據權利要求4所述的包埋抗癌藥物的微膠囊的制備方法，其特征在于所說的接枝有聚乙二醇的聚烯丙基胺鹽酸鹽是通過如下步驟合成得到的1)將1～50mg/mL對甲苯磺酰氯的吡啶溶液攪拌加入1～100mg/mL的單甲氧基聚乙二醇的二氯甲烷溶液中，室溫下反應1～12小時；2)取1～5mmol活化的聚乙二醇攪拌加入到1～100mg/mL的聚烯丙基胺鹽酸鹽溶液中，室溫反應1～24小時；3)將得到的反應產物透析除去小分子雜質，冷凍干燥后得終產物聚烯丙基胺接枝聚乙二醇；
6.根據權利要求1所述的包埋抗癌藥物的微膠囊的制備方法，其特征在于所說的分解去除CaCO3膠體微粒是采用鹽酸分解或乙二胺四乙酸絡合。
7.根據權利要求1所述的包埋抗癌藥物的微膠囊的制備方法，其特征在于所說的抗癌藥物是柔紅霉素或阿霉素。
全文摘要
本發明公開了一種包埋抗癌藥物的微膠囊的制備方法。該方法采用內含聚電解質的膠體微粒為模板，通過層層靜電自組裝方法將具有相反電荷的聚電解質組裝到膠體微粒表面，將膠體微粒溶解或分解，得到內含聚電解質的聚合物中空微膠囊。微膠囊的囊壁微結構和厚度可在納米尺度精確控制，內含的聚電解質可以與藥物相互作用，從而將藥物包埋到微膠囊內。包埋的藥物釋放速率可控。通過在微膠囊表面引入接枝有聚乙二醇的聚電解質，以提高微膠囊的生物相容性。本發明所提供的藥物包埋工藝過程簡單可行，重復性好，藥物釋放速率可控，適用于多種水溶性抗癌藥物的包埋和可控釋放，具有良好的應用前景。
文檔編號A61K31/7028GK1771917SQ20051006135
公開日2006年5月17日 申請日期2005年11月1日 優先權日2005年11月1日
發明者高長有, 趙慶賀, 張雙, 沈家驄 申請人:浙江大學