低分子量褐藻多糖硫酸酯在制備治療腎臟疾病的藥物中的用途的制作方法

專利名稱：低分子量褐藻多糖硫酸酯在制備治療腎臟疾病的藥物中的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及低分子量褐藻多糖硫酸酯的制藥用途，特別涉及低分子量褐藻多糖硫酸酯在制備治療腎臟疾病藥物方面的用途。
背景技術：
褐藻多糖硫酸酯是一類硫酸化多糖，存在于褐藻中，首先由Kylin在1913年用稀酸從掌狀海帶中提取出來。Kylin將提取物水解后分離出L-巖藻糖，他將這種多糖命名為fucoidin，現根據多糖的命名原則一般定名為fucoidan，中文名稱為墨角藻多糖、巖藻多糖、巖藻聚糖、巖藻聚糖硫酸酯、褐藻糖膠或褐藻多糖硫酸酯。現在人們對褐藻多糖硫酸酯的組成有較為清晰的了解，它是一類化學組成和結構非常復雜的多糖，以巖藻糖和硫酸基為主，隨著藻的種類不同還含有半乳糖、木糖、糖醛酸等其他成分。海帶Fucoidan由巖藻糖、半乳糖、木糖、葡萄糖醛酸、阿拉伯糖等單糖組成。以巖藻糖和半乳糖為主，巖藻糖與半乳糖大概在3∶1。
褐藻多糖硫酸酯化學結構非常復雜，不同褐藻中分離到的褐藻多糖硫酸酯其結構有很大差異。到目前為止，對來源于墨角藻(Fucus vesiculosus)和泡葉藻(Ascophyllum nodosum)的褐藻多糖硫酸酯的結構研究最多，墨角藻褐藻多糖硫酸酯主要以α(1→3)糖苷鍵連接，硫酸化主要發生在C4位。對泡葉藻褐藻多糖硫酸酯的多項研究都表明其中存在大量的α(1→3)和α(1→4)糖苷鍵。此外還有幾種褐藻褐藻多糖硫酸酯的結構被報道。昆布(Ecklonia kurome)褐藻多糖硫酸酯主要為α(1→3)連接，硫酸化在C4位。來源于枝管藻(Cladosiphon okamuranus)和繩藻(Chorda filum)的褐藻多糖硫酸酯主鏈均為α(1→3)的巖藻糖，硫酸化在C4位，而且，二者均有少量的2-O-乙酰化。
墨角藻、泡葉藻褐藻多糖硫酸酯結構 昆布褐藻多糖硫酸酯結構
繩藻褐藻多糖硫酸酯結構關于海帶褐藻多糖硫酸酯的結構，多數的研究資料表明海帶褐藻多糖硫酸酯主要是以α-(1→3)連接的L-巖藻糖組成，硫酸化發生在C4或C2位，而且部分研究顯示存在部分(1→2)連接的L-巖藻糖作為側鏈。與上圖中繩藻褐藻多糖硫酸酯結構有相似之處。但繩藻中有部分乙酰基。而且不同取代基團所占的比例也不一樣。當然分子中還存在半乳糖、木糖、鼠李糖等單糖，半乳糖可能參與了主鏈的組成，而木糖、鼠李糖等是以側鏈的形式存在。
已有多篇文獻公開了褐藻多糖硫酸酯以及低分子量褐藻多糖硫酸酯的制備方法及其制藥用途。日本專利昭46-2248采用十六烷氯化吡啶或十六烷三甲基溴化銨與褐藻多糖硫酸酯反應成季胺鹽復合物，再利用該復合物對鹽的溶解度差異，用乙醇、甲醇和離子交換樹脂處理，純化除去褐藻膠、中性多糖和其它雜質，而得到比較純化的褐藻多糖硫酸酸酯。CN1129109A則公開了由干海帶浸泡、數次過濾、二次乙醇提取、一次乙醇洗滌、配合調節PH范圍等的堿凝析法。CN1344565A則公開了另一種制備方法，包括原料預處理、控溫攪拌浸提、離心、濃縮、乙醇沉淀、無水乙醇脫水等步驟。CN1517356A則將巖藻聚糖硫酸酯配制成水溶液，加入過氧化氫、次氯酸或亞硝酸及其鹽，將所得混合溶液加熱，用截留分子量3000-5000的膜超濾，得到巖藻聚糖硫酸酯低聚糖。CN1560086A則公開了一種高硫酸根含量巖藻聚糖硫酸酯的制備方法，用熱水或酸水浸提褐藻，制得含褐藻聚糖硫酸酯的提取液，將該提取液濃縮至多糖的重量百分數為2-10％，調PH5-8，加入殼聚糖溶液攪拌，離心或過收集沉淀，將沉淀用于5-10倍鹽溶液提取2-4次，離心或過濾收集清液，將該清液透析或超濾脫鹽。CN1616494A以天然海藻硫酸多糖為原料，將海藻硫酸糖溶液中加入抗壞血酸和過氧化氫，控制反應溫度，恒溫降解時間為0.5-3hr，再透析或超濾，減壓濃縮，制得4-100KDa的低分子量海藻硫酸多糖產物。另外，CN1670028A、CN1392160A、CN1197674A也分別公開了采用絮凝等方法制備海藻多糖。在本發明中，以上發明公開的內容均被全文引入本文作為參考。
此外，以上發明還公開了褐藻多糖硫酸酯以及低分子量褐藻多糖硫酸酯具有抗凝血、提高免疫力、抗腫瘤、抗菌和抗病毒、降血糖、抗輻射、抑制腹水瘤等活性。CN1228961A公開了褐藻多糖硫酸酯在治療腎衰方面的用途，CN1206591A則公開了褐藻多糖硫酸酯在治療腎小球疾病方面的用途。但尚未有文獻表明低分子量褐藻多糖硫酸酯在腎臟疾病方面的用途。

發明內容
申請人經研究發現，低分子量褐藻多糖硫酸酯與褐藻多糖硫酸酯相比，在治療腎臟疾病方面，具有意想不到的良好治療效果。本發明中的低分子量褐藻多糖硫酸酯，是指將褐藻多糖硫酸酯通過某種合適的方式(降解方式包括但不限于酸降解法、堿降解法、酶降解法、物理降解法、自由基氧化降解法等)降解而制得的硫酸化多糖或寡糖類物質，其分子量較未降解褐藻多糖硫酸酯分子量低，具體的分子量范圍可以是1000～200000，優選是5000～100000，更優選是8000～80000。褐藻多糖硫酸酯可以來源于人工養殖的海帶，也可以是野生褐藻馬尾藻、裙帶菜、羊棲菜、鼠尾藻、海黍子、昆布、泡葉藻或墨角藻。優選來源于海帶。
本發明的目的是提供低分子量褐藻多糖硫酸酯在治療腎臟疾病方面的用途。其中的腎臟疾病包括但不限于腎功能衰竭、腎炎和腎病綜合征等。其中所述的腎炎包括但不限于在臨床上常見的急性(腎小球)腎炎、慢性(腎小球)腎炎、腎盂腎炎、隱匿性腎炎、過敏性紫癜腎炎(紫癜性腎炎)、紅斑狼瘡腎炎(狼瘡性腎炎)等。
另一方面，本發明提供了含低分子量褐藻多糖硫酸酯的藥物組合物。所述組合物中包含治療有效量的低分子量褐藻多糖硫酸酯和至少一種藥學上可接受的輔料。該組合物的給藥方式可以是但不限于經靜脈注射、口服、肌肉、皮下、皮膚表面、直腸內、局部注射等方式給藥，其劑型可以但不限于是注射液、凍干粉針劑、注射微球、脂質體、片劑、膠囊劑、水劑、散劑、糊劑、噴霧劑、顆粒劑、軟膠囊、滴丸劑、凝膠劑、貼片、膏劑等，其中優選片劑、膠囊劑、注射液和凍干粉針劑。本領域技術人員根據現有技術以及制劑領域的公知常識可以方便地制備出所需劑型。
本發明的組合物中，低分子量褐藻多糖硫酸酯的含量≥50％，優選為≥70％，更優選為≥90％，最佳是≥95％。單位制劑中褐藻多糖硫酸酯的含量可以是1mg～1000mg，優選10mg～800mg，更優選20mg～500mg，最優選20mg～300mg，最佳是30mg～100mg。
本發明的褐藻多糖硫酸酯可以按以下方式提取和純化、分級1.提取褐藻多糖硫酸酯可以用水、稀酸或氯化鈣溶液提取，然后向提取液中加入氫氧化鉛、氫氧化鋁、乙醇或季胺鹽類陽離子表面活性劑，都可使褐藻多糖硫酸酯沉淀出來，為了減少色素、蛋白質等的溶出，提取之前可以先以高濃度醇類或甲醛溶液處理藻體。
近年來也陸續有人采用微波提取、超聲波提取以及高分子絮凝沉淀提取等方法。
2純化制備的粗褐藻多糖硫酸酯通常會含有部分水溶性褐藻膠、蛋白質、褐藻淀粉、色素等，需要進一步純化，純化方法有以下幾種乙醇重沉淀西出英一(西出英一等，日本水産學會誌，1982，48(12)1771)對熱水提取的粗褐藻多糖硫酸酯水溶液在0.05M MgCl2存在時，以20％乙醇沉淀除去作為雜質的水溶性褐藻膠。王作蕓、趙學武(王作蕓.趙學武.銅藻的褐藻糖膠、褐藻淀粉和褐藻膠的分離及提純.水產學報.1985；9(1)71)在研究銅藻中褐藻多糖硫酸酯時，將制得的粗褐藻多糖硫酸酯溶于水后，先后以4M CaCl2和30％乙醇沉淀去除褐藻膠，然后用80％乙醇沉出純化的褐藻多糖硫酸酯。
季胺鹽類沉淀法利用陽離子表面活性劑如十六烷基氯化吡啶(CPC)或十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)能與高分子電解質產生沉淀的性質使褐藻多糖硫酸酯沉淀下來。
在提取和純化過程中，為除去溶液中的離子和小分子物質一般都采用透析的方法。也有人采用超濾分離方法以排除分子量較小的物質。有時為除去混雜在提取液中的褐藻淀粉和蛋白質，可采取酶消化法。Feury等(Fleury N andLahaye M.Studies on by-products from the industrlal extration of alglnate2.Chemieal structure analysis of fucans from the leach-water.J ApplPhycol，1993，5605-610)在研究法國褐藻膠工業的副產品時就采用葡聚糖酶和alcalase來清除其中的褐藻淀粉和蛋白質。分離褐藻淀粉和褐藻多糖硫酸酯還可以采用離子交換樹脂法，因為前者是電中性的，而后者為多聚陰離子形式。
3分級由于褐藻多糖硫酸酯化學組分相當復雜，對制備出的粗褐藻多糖硫酸酯的色譜和電泳檢查一般都呈現不均一性，因此人們逐步使用分級方法將混雜的多糖分成不同級分以進行深入研究。常用的分級方法有兩種一種是乙醇分級沉淀，即利用不同的乙醇濃度沉淀出不同的級分，另一種是層析法，利用凝膠過濾柱層析和離子交換層析進行分級。離子交換層析法能將多糖分成荷電性不同的級分，凝膠過濾層析法則將多糖按照分子量大小進行分級。還可以采用超濾技術對褐藻多糖硫酸酯進行分級。
將褐藻多糖硫酸酯降解從而制備低分子量褐藻多糖硫酸酯的方法則可采用以下幾種1.酸降解 在酸性條件下，酸性溶液能引起多糖中糖苷鍵的斷裂，使多糖降解為低分子片段。控制酸的濃度、溫度及時間可獲得不同分子量大小的降解產物。多糖降解產品分子量分布較難控制，硫酸根含量變化較大。
2.堿解法 在堿性條件下，往往引起酸性多糖的改性及硫酸根的脫落，影響產品的活性，因此不適用于海藻硫酸多糖。
3.酶解法 酶解法是利用專一性糖苷酶通過開裂多糖中的某一糖苷鍵來達到降解的目的。酶降解反應因其高度的專一性、高效性以及降解條件及過程易于控制，無副反應等，在多糖降解中已逐漸受到重視。但由于酶的專一性強，因此不具有廣泛的適用性，而且酶生產周期長，容易失去活性，成本高。這些缺點都使得該法目前無法推廣應用。
4.物理降解法包括超聲波和微波等方法。這兩種方法由于能耗高，儀器設備條件要求高，樣品處理量小，目前無法應用于工業生產。超聲波輻射的結果表明，無論輻射時間長短，解聚分子量有個低限；而且，解聚物具有相當窄的分子量分布，5.自由基氧化降解例如以過氧化氫降解法，所得產物的硫酸化程度較高，成本較低，具有較大的應用價值。
另外，本文中所引用專利公開的提取方法以及由這些方法制備的產品也可以被本領域技術人員任意地采用。
在本發明的一個具體實施方式
中，低分子褐藻多糖硫酸酯是采用以下制備方法制備將海帶粉碎后以甲醛溶液浸泡過夜，添加蒸餾水沸水提取，提取液以硅藻土助濾過濾，濾液先以自來水流水透析一天，然后以蒸餾水透析一天，將透析液濃縮，加乙醇至濃度為75％沉淀，沉淀干燥得粗褐藻多糖硫酸酯。將粗品重溶于水，在0.05mol/L MgCl2存在下20％乙醇沉淀除去水溶性褐藻膠，濾液透析、濃縮后75％乙醇沉淀，干燥后即得到純化的褐藻多糖硫酸酯。取適量海帶褐藻多糖硫酸酯，溶于蒸餾水中；向該溶液中加入適量抗壞血酸和過氧化氫，混合均勻，在室溫下攪拌反應，對反應液進行透析和超濾，將超濾液進行減壓濃縮，將濃縮液冷凍干燥。
以下通過具體實施方式
對本發明進行進一步說明。這里想要指出的是，下面的具體實施方式
僅用來說明本發明，本領域技術人員在理解本發明精神的前提下，可以根據本技術領域的現有技術和公知常識對本發明進行相應變換，這些技術方案均落入本發明的范圍之內。
具體實施例方式
實施例1 褐藻多糖硫酸酯的制備將海藻粉碎后以3.7％甲醛溶液浸泡過夜，然后添加蒸餾水沸水提取，提取液以硅藻土助濾過濾，濾液先以自來水流水透析一天，然后以蒸餾水透析一天，將透析液濃縮，加乙醇至濃度為75％沉淀，沉淀干燥得粗褐藻多糖硫酸酯。將粗品重溶于水，在0.05mol/L MgCl2存在下20％乙醇沉淀除去水溶性褐藻膠，濾液透析、濃縮后75％乙醇沉淀，干燥后即得到純化的褐藻多糖硫酸酯。按照上述方法制備四種海藻褐藻多糖硫酸酯，其化學組分分析如下表所示

低分子量褐藻多糖硫酸酯的制備1.稱取150g海帶褐藻多糖硫酸酯，溶于10L蒸餾水中配成濃度為1.5％的溶液；向該溶液中加入抗壞血酸和過氧化氫，使它們的濃度分別達到35mmol/L，混合均勻，在室溫下攪拌反應2小時，反應完畢后，對反應液進行透析和超濾，將超濾液進行減壓濃縮，再將濃縮液冷凍干燥；制得分子量范圍為8000-10000Da的低分子量褐藻多糖硫酸酯A；經高效凝膠滲透色譜(HPGPC)法檢測該產物重均分子量為9.8KD。化學組分分析結果巖藻量28.4％，硫酸根含量28.7％。
2.稱取150g海帶褐藻多糖硫酸酯，溶于10L蒸餾水中配成濃度為1.5％的溶液；向該溶液中加入抗壞血酸和過氧化氫，使它們的濃度分別達到2mmol/L，混合均勻，在室溫下攪拌反應2小時，反應完畢后，對反應液進行透析和超濾，將超濾液進行減壓濃縮，再將濃縮液冷凍干燥；制得分子量范圍為50KD-80KD的低分子量褐藻多糖硫酸酯B；經高效凝膠滲透色譜(HPGPC)法檢測該產物的重均分子量為72.2KD。化學組分分析結果巖藻糖含量28.1％，硫酸根含量29.2％。
3.稱取150g海帶褐藻多糖硫酸酯，溶于10L蒸餾水中配成濃度為1.5％的溶液；向該溶液中加入抗壞血酸和過氧化氫，使它們的濃度分別達到10mmol/L，混合均勻，在室溫下攪拌反應2小時，反應完畢后，對反應液進行透析和超濾，除去殘存的抗壞血酸和過氧化氫，將超濾液進行減壓濃縮，再將濃縮液冷凍干燥；制得分子量范圍15KD-30KD的低分子量褐藻多糖硫酸酯C；經高效凝膠滲透色譜(HPGPC)法檢測該產物的重均分子量為27KD。化學組分分析結果巖藻量28.5％，硫酸根含量28.2％。
實施例2 低分子量褐藻多糖硫酸酯注射劑的制備取低分子量褐藻多糖硫酸酯50g，加入注射用水500ml，甘露醇50g，調PH值至7.0，分裝，冷凍干燥。
實施例3 低分子量褐藻多糖硫酸酯片劑的制備取低分子量褐藻多糖硫酸酯50g，加入微晶纖維素，聚乙烯吡咯烷酮，混合，加入適量水，制軟材，制粒，干燥。粒子加入交聯羧甲基纖維素鈉、硬脂酸鎂，混合，壓片，每片含低分子量褐藻多糖硫酸酯10-200mg。
實施例4 低分子量褐藻多糖硫酸酯(樣品B)對大鼠慢性腎衰的試驗研究1.低分子量褐藻多糖硫酸酯對腎部分切除引起的大鼠慢性腎衰的影響選取180～250克雄性大鼠105只(術前測定無蛋白尿)，隨機分成正常對照組和造模組(95只)，造模組大鼠以戊巴比妥鈉30mg/kg腹腔麻醉后，常規消毒皮膚，背部左側切口，暴露左腎，剝離腎筋膜，迅速切除上、下極腎實質，立即以明膠海綿壓迫止血，必要時滴加數滴凝血酶溶液，然后復位腎臟，結束手術。一周后再進行手術，切除右腎。術后常規飼養，于術后14周(大鼠已死亡16只)和正常對照組大鼠眼眶靜脈眥取血，用42型貝克曼生化分析儀測定大鼠血清肌酐、尿素氮、總蛋白、白蛋白水平，根據測定結果，將造模大鼠進行隨機分組，每組14～15只(剔除血清肌酐176μmol/L以下者)，即模型對照組、低分子量褐藻多糖硫酸酯B 200、100mg/kg兩個劑量組及實施例1中用于制備低分子量褐藻多糖硫酸酯的海帶褐藻多糖硫酸酯(以下簡稱為“樣品1”)200mg/kg組、醋酸地塞米松0.07mg/kg陽性對照藥組。另取未手術的大鼠為正常對照組，共六組，開始實驗治療，每日一次灌胃給藥，連續30天，正常和模型對照組均每日一次灌服同體積蒸餾水，于給藥治療后10、20、30天各組大鼠乙醚麻醉，眼眶取血，分離血清，進行上述生化指標的測定，實驗結果采用t值法進行統計學處理，結果見表1。于最后一次取血后將動物處死，取腎固定于10％甲醛溶液中，常規石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡觀察一般腎組織形態，測定腎小球(具有血管極或/和尿極)二條互相垂直的縱徑和橫徑，每份標本選測10個最大的腎小球，求出各個腎小球面積及腎小球的平均面積。對每一病理切片的腎小管和間質病變程度進行病理分級(-、+、++、+++)記分。結果采用t檢驗及WMW非參數法進行統計學處理，結果見表2。
表1 低分子量褐藻多糖硫酸酯對腎部分切除引起的慢性腎衰大鼠血清肌酐、尿素氮、總蛋白和白蛋白的影響

△p＜0.05 △△p＜0.01 △△△p＜0.001(與正常對照組比較)*p＜0.05**p＜0.01***p＜0.001(與模型對照組比較)(N)鼠數表2 低分子量褐藻多糖硫酸酯對腎部分切除所致慢性腎衰大鼠腎病理組織學檢查的影響

注-0分+1分 ++2分 +++3分；*p＜0.05**p＜0.01***p＜0.001與模型對照組比較＝腎小管及腎間質病變按如下標準分級

表1結果表明各組大鼠經腎部分切除手術后14周形成慢性腎功能衰竭，與正常對照組比較，血清肌酐、尿素氮均呈顯著性增高(p＜0.001)，血清白蛋白明顯下降(p＜0.001)。在給藥治療30天期間，模型對照血清肌酐、尿素氮水平仍呈穩定增高(p＜0.001)，白蛋白明顯下降狀態(p＜0.01～0.001)，低分子量褐藻多糖硫酸酯治療后，血清肌酐逐漸下降，治療達20～30天時，肌酐和尿素氮明顯下降(與模型對照組比較P＜0.05、0.01或0.001)或有下降趨勢，并隨劑量增加，作用增強對血清蛋白和總蛋白無明顯影響。
表2病理結果表明腎部分切除所致的慢性腎衰大鼠，腎被膜結締組織增厚，大部分腎小球代償性肥大，腎小球面積與正常對照組比較明顯增大(p＜0.001)，個別腎小球呈硬化或玻璃透明變性，腎小管濁腫、脂變、甚至萎縮、壞死，間質纖維組織增生，炎細胞浸潤明顯。與模型對照組比較，低分子量褐藻多糖硫酸酯可明顯降低腎小球面積和腎小管病變得分，并與劑量有關，對腎間質病變亦有改善的趨勢。陽性對照藥醋酸地塞米松0.07mg/Kg與低分子量褐藻多糖硫酸酯B 200mg/Kg劑量組作用強度相當。
2低分子量褐藻多糖硫酸酯(樣品B)對冷凍引起的大鼠慢性腎衰的影響選取200～250克雄性大鼠88只(術前測定無蛋白尿)，隨機分成正常對照組(10只)和造模組(78只)，造模組大鼠以戊巴必妥鈉30mg/Kg腹腔麻醉后，常規消毒皮膚，背部左側切口，暴露左腎，剝離腎筋膜，將預先浸入液氮瓶內的冷刀(0.6×1.4×25cm)，依次在腎臟的上、下極和外側前后共四個部分，每處冷凍45秒，然后復位腎臟，結束手術2周后，再行手術切除右腎，術后常規飼養。大鼠于術后6周(至此死亡17只)和正常對照組大鼠眼眶靜脈眥取血，分離血清，用42型貝克曼生化分析儀測定大鼠血清肌酐、尿素氮、總蛋白和白蛋白，根據測定結果將造模組大鼠進行隨機分組(剔除血清肌酐176μmol/L以下者)，每組9～10只，即模型對照組，低分子量褐藻多糖硫酸酯B 200、100mg/kg兩個劑量組及樣品1(200mg/kg)組、醋酸地塞米松0.07mg/kg陽性對照藥組。取未手術的大鼠為正常對照組，共6組，開始實驗治療，每日一次，灌胃給藥，連續40天，模型對照組、正常對照組均每日一次灌服同體積蒸餾水，于給藥治療后10、20、30、40天各組大鼠乙醚麻醉，眼眶取血，分離血清，進行上述生化指標的測定，結果見表3-1和3-2。實驗結束，將大鼠斷頭處死。取腎，固定于10％甲醛溶液中，石蠟包埋，HE染色，光鏡觀察。腎病理觀測指標及實驗結果統計學處理均同于腎部分切除大鼠。結果見表4。
表3-1和3-2結果表明，各組大鼠經冷凍手術后6周形成慢性腎功能衰竭，與正常對照組比較，血清肌酐、尿素氮均呈顯著性增高(p＜0.001)，血清白蛋白明顯下降(p＜0.05～0.001)。在給藥治療40天期間，模型對照組血清肌酐、尿素氮水平仍呈穩定增高(p＜0.001)，白蛋白明顯下降狀態(p＜0.05～0.01)。低分子量褐藻多糖硫酸酯治療后，血清肌酐逐漸下降，治療達30～40天時，肌酐、尿素氮明顯下降(與模型對照組比較P＜0.01或0.05)或有下降趨勢，并隨劑量增加，作用增強；對血清白蛋白和總蛋白無明顯影響。
表4腎臟病理結果表明冷凍所致的慢性腎衰大鼠病理結果基本同于腎部分切除所致的慢性腎衰大鼠，表現為腎被膜結締組織增厚，大部分腎小球代償性肥大，腎小球面積與正常對照組比較明顯增大(p＜0.001)，個別腎小球呈硬化或玻璃樣透明變性，腎小管濁腫、脂變，甚至萎縮、壞死；間質纖維組織增生，炎細胞浸潤明顯。經低分子量褐藻多糖硫酸酯治療后，高劑量組可使腎小球面積明顯下降(p＜0.05)；腎小管病變得分明顯降低(p＜0.05)，低劑量組亦呈如上變化趨勢；對腎間質病變亦有改善的趨勢。陽性對照藥醋酸地塞米松0.07mg/kg與低分子量褐藻多糖硫酸酯B200mg/kg劑量組作用強度相當。
表3-1 低分子量褐藻多糖硫酸酯對冷凍引起的慢性腎衰大鼠血清肌酐、尿素氮的影響

△p＜0.05 △△p＜0.01 △△△p＜0.001(與正常對照組比較)；*p＜0.05**p＜0.01***p＜0.001(與模型對照組比較)；(N)鼠數表3-2 低分子量褐藻多糖硫酸酯對冷凍引起的慢性腎衰大鼠總蛋白和白蛋白的影響

△p＜0.05 △△p＜0.01 △△△p＜0.001(與正常對照組比較)；*p＜0.05**p＜0.01***p＜0.001(與模型對照組比較)；(N)鼠數表4 低分子量褐藻多糖硫酸酯對冷凍所致慢性腎衰大鼠腎病理組織學檢查的影響

注-0分 +1分 ++2分 +++3分；*p＜0.05**p＜0.01***p＜0.001(與模型對照組比較)
3低分子量褐藻多糖硫酸酯(樣品B)對腺嘌呤引起的大鼠慢性腎衰的影響選取體重160～200克Wistar大鼠60只，隨即分成正常對照組和造模組，造模組大鼠灌胃給予腺嘌呤365mg/kg/日，共16天，制備慢性腎衰模型，正常對照組及造模組大鼠自由攝食及飲水，于第17天乙醚麻醉，由眼眶靜脈眥取血，分離血清，用42型貝克曼生化分析儀測定大鼠血清肌酐、尿素氮、總蛋白和白蛋白。根據測定結果，將造型大鼠隨機分為模型對照組、低分子量褐藻多糖硫酸酯B 200、100mg/kg兩個劑量組及樣品1(200mg/kg)組、醋酸地塞米松0.07mg/kg陽性對照藥組，每組10只，并開始灌胃給藥，模型對照組給予等容量0.5％CMC，除正常對照組外，其余各組繼續灌胃給予腺嘌呤，劑量為200mg/kg/日，于給藥第40天，各組大鼠乙醚麻醉，眼眶靜脈眥取血，分離血清，進行上述生化指標的測定。實驗結果采用t檢驗進行統計分析，結果列入表5。實驗結束，將大鼠斷頭處死。立即取新鮮腎臟，觀察外觀形態變化，固定于10％甲醛溶液中，石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡觀察。
表5結果表明模型對照組大鼠灌胃給予腺嘌呤16天后(治療前)血清肌酐、尿素氮與正常對照組比較，均呈顯著性增高(p＜0.001)，白蛋白下降趨勢。隨腺嘌呤灌胃日數的增加，血清肌酐、尿素氮水平呈進行性升高，白蛋白明顯下降(p＜0.01)(治療后)。各給藥組大鼠治療前(即腺嘌呤灌胃16天后)其血清肌酐、尿素氮值與正常對照組比較亦明顯增加(p＜0.001)，白蛋白明顯下降(p＜0.05)或有下降趨勢，但與模型對照組比較，經統計學處理，無顯著性差異。低分子量褐藻多糖硫酸酯(200和100mg/kg)及陽性藥對照組給藥治療后血清肌酐和尿素氮明顯下降(與模型對照組比較p＜0.01或0.05)，低分子量褐藻多糖硫酸酯(200mg/kg)和陽性對照藥還使血清白蛋白明顯上升，對血清總蛋白無明顯影響。
組織形態學觀察結果1)正常對照組肉眼觀察腎暗紅色，表面光滑，腎體積未見增大，切面皮，髓質界限清晰，未見結石及腎孟擴張。
光鏡觀察被膜光滑，皮、髓質清晰可見，腎小體未見減少或纖維化，遠、近曲小管及集合管上皮細胞完好，管腔未見結石、管型及擴張，腎間質未見炎細胞浸潤及纖維組織增生、腎孟移行，上皮完整，腎孟未見擴張、積水及積石形成。
2)模型對照組肉眼觀察腎臟蒼白、腫大，表面光滑呈顆粒狀，切面亦蒼白，見許多大、小不等微孔，皮、髓質界限不清，散在多量細小結石，少數腎臟的腎盂擴張(2/8)。
光鏡檢查被膜凹凸不平，部分區域增厚，皮、髓質界限不清，腎小球、小管及間質可見大量散在不規則形狀結晶聚集，部分腎小管被堵塞，部分腎小管明顯擴張，腎小球數量明顯減少，且部分萎縮，未見異常的腎單位，僅島狀存在，部分腎小管見管型，部分腎小管上皮細胞變化，甚至壞死脫落在腔中，腎間質可見異物性肉芽腫及纖維化，部分腎臟的腎孟擴張。
3)褐藻多糖硫酸酯200mg/kg組(1/8)，低分子量褐藻多糖硫酸酯100mg/kg組(0/8)腎孟擴張，腎臟病變大致如模型對照組，僅略顯輕些。
4)低分子量褐藻多糖硫酸酯200mg/kg組腎臟病變與模型對照組比較明顯減輕，多數腎臟(5/9)皮、髓質界限尚未辨認，腎小球數量僅輕度減少，殘余的正常腎單位區域較明顯，未見腎孟擴張。
5)陽性藥對照組醋酸地塞米松0.07mg/kg。
腎臟病變大致如低分子量褐藻多糖硫酸酯200mg/kg組，與模型對照組相比亦明顯減輕。
以上腺嘌呤引起的大鼠慢性腎衰病理結果表明低分子量褐藻多糖硫酸酯200mg/kg和陽性藥對照組醋酸地塞米松均顯示有改善腎損害的病理學變化。
表5 低分子量褐藻多糖硫酸酯對腺嘌呤所致慢性腎衰大鼠血清肌酐、尿素氮、總蛋白和白蛋白的影響

△p＜0.05 △△p＜0.01 △△△p＜0.001(與正常對照組比較)；*p＜0.05**p＜0.01(與模型對照組比較)
實驗結論1.低分子量褐藻多糖硫酸酯200、100mg/kg給大鼠治療給藥，每天灌胃一次，連續30天，和模型對照組比較，200、100mg/kg劑量組明顯降低腎部分切除所致慢性腎衰大鼠血清肌酐、尿素氮水平和腎小球面積，改善腎小管病理改變程度。并隨劑量增加，作用增強。表明低分子量褐藻多糖硫酸酯有治療腎部分切除所致大鼠慢性腎衰的作用。
2.低分子量褐藻多糖硫酸酯200、100mg/kg給大鼠治療給藥，每天灌胃一次，連續40天，和模型對照組比較，200、100mg/kg劑量組明顯降低冷凍所致慢性腎衰大鼠血清肌酐，尿素氮水平，200mg/kg劑量組明顯降低腎小球面積，改善腎小管病理改變程度，并隨劑量增加，作用增強。表明低分子量褐藻多糖硫酸酯有治療冷凍所致大鼠慢性腎衰的作用。
3.低分子量褐藻多糖硫酸酯200、100mg/kg給大鼠預防和治療給藥，每天灌胃一次，連續40天，和模型對照組比較，200、100mg/kg劑量組明顯降低腺嘌呤所致慢性腎衰大鼠血清肌酐、尿素氮水平，200mg/kg劑量組明顯增加白蛋白水平，緩解腎臟病理變化，并隨計量增加，作用增強。表明低分子量褐藻多糖硫酸酯對腺嘌呤所致大鼠慢性腎衰有防治作用。
以上實驗所用陽性對照藥醋酸地塞米松0.07mg/kg亦有類似作用，與200mg/kg低分子量褐藻多糖硫酸酯作用強度相當。
實施例5 低分子量褐藻多糖硫酸酯(樣品A)對大鼠Heymann腎小球腎炎的療效觀察選取Wistar種大鼠，擊昏后打開腹腔，自腎動脈插入針頭，用生理鹽水反復沖洗至腎色轉白厚，摘下腎臟，取腎皮質5克研成勻漿，與弗氏完全佐劑混勻成10ml，加生理鹽水20ml，給同種大白鼠做腹腔內注射，兩周1次，每次2ml，約3-6次，直至出現蛋白尿，說明模型形成，將此大鼠分為模型對照組，陽性藥對照組即醋酸地塞米松0.1mg/kg，低分子量褐藻多糖硫酸酯A 200、100mg/kg兩個劑量組及樣品1(200mg/kg)組，另設正常對照組(未造模)。灌胃給藥，每天1次，模型對照組和正常對照組給予等容量蒸餾水，共四周，評定指標①尿蛋白定量造型前測1次，并去除蛋白高者，確認腎炎形成后每周測1-3次(放入代謝籠中取尿，測定24小時尿蛋白定量)②血肌酐及血尿素氮造型前，確認腎炎形成后及實驗結束前各測一次。采用Beckman Model42自動生化分析儀測定。③病理學檢查。實驗結束時，取腎臟進行腎切片(HE染色)，光鏡檢查，每例各選5個最大切面的腎小球，計量腎小球直徑和細胞數。
實驗結果低分子量褐藻多糖硫酸酯灌胃給藥4周對大鼠Heymann腎炎尿蛋白的影響列入表6，對血清肌酐、尿素氮的影響列入表7，病理學檢查結果列入表8。
表6 低分子量褐藻多糖硫酸酯對大鼠Heymann腎炎尿蛋白的影響

n動物數；△p＜0.05，△△p＜0.01，△△△p＜0.001(與造型前比較)；**p＜0.05，**p＜0.01(與模型對照組比較)。
由表6可見，各組造型后大鼠尿蛋白定量，均明顯高于造型前(P＜0.001)表明模型成功，并且尿蛋白升高持續4周以上，低分子量褐藻多糖硫酸酯200mg/kg和100mg/kg于治療后4周，使大鼠尿蛋白排除量明顯降低(與模型對照組比較P值分別＜0.05和＜0.01)，陽性對照藥醋酸地塞米松亦使大鼠尿蛋白有一定治療作用，隨劑量增加作用增強。
表7 低分子量褐藻多糖硫酸酯對大鼠Heymann腎炎血清肌酐、尿素氮的影響

n動物數；△p＜0.05，△△p＜0.01，△△△p＜0.001(與造型前比較)；**p＜0.01(與模型對照組比較)。
表7結果表明，造型后大鼠血清肌酐和尿素氮比造型前明顯升高(p＜0.01或p＜0.001)，低分子量褐藻多糖硫酸酯(200和100mg/kg)及陽性藥對照組治療后血清肌酐明顯下降(與模型對照組比較p＜0.01)，對血清尿素氮無明顯影響。實驗結果表明低分子量褐藻多糖硫酸酯對大鼠Heymann腎炎血肌酐有一定治療作用，隨劑量增加，作用增強。
表8 低分子量褐藻多糖硫酸酯對大鼠Heymann腎炎腎臟病理學的影響

△△△p＜0.001(與造型前比較)；**p＜0.01(與模型對照組比較)表8結果表明造型后大鼠病理學檢查腎小球直徑及腎小球細胞數均明顯高于空白對照組。低分子量褐藻多糖硫酸酯給藥組對腎小球直徑有降低趨勢，對腎小球細胞無明顯影響。陽性對照藥醋酸地塞米松可明顯降低腎小球直徑。
實驗結論低分子量褐藻多糖硫酸酯200、100mg/kg，灌胃給藥4周，可降低大鼠Heymann腎炎模型尿蛋白排出量及血清肌酐值，并隨劑量增加，作用增強，對血清尿素氮無明顯影響，病理學檢查，對腎小球直徑有降低趨勢，對腎小球細胞數無明顯影響。
實施例6 低分子量褐藻多糖硫酸酯(樣品C)對正常及水負荷大鼠的利尿作用1、對水負荷動物的作用體重150g～200g的雄性健康Wistar大鼠，置于代謝籠中預適應1日，接取6小時尿液，觀察自由飲水條件下的尿量是否穩定。再按2.5ml/100g灌胃生理鹽水，2小時內收集的尿量達到灌入量40％的動物入選試驗。
按6小時排尿量將動物隨機分為6組，即低分子量褐藻多糖硫酸酯(樣品C)低、高劑量組，樣品1(200mg/kg)組，氫氯噻嗪組，模型組，正常組。給藥組劑量分別為低分子量褐藻多糖硫酸酯C 100、200mg/kg，氫氯噻嗪4mg/kg，模型組給予等容積生理鹽水，正常組不做處理。
試驗前動物禁食18小時。試驗時給藥組動物藥物混于負荷水中(即按2.5ml/100g灌胃給予38℃生理鹽水)給予。模型組用等容積的生理鹽水代替藥液。給藥后動物迅速放入給予充分飲水的代謝籠中，每代謝籠中放置大鼠1只，放入前輕壓動物下腹，排盡余尿。藥后每小時接尿一次，連續觀察6小時，觀察各組一定時間內尿量的差異。
結果用均數±標準差表示，用組間t檢驗進行顯著性測驗。見表9表9 低分子量褐藻多糖硫酸酯對水負荷大鼠單位時間內尿量(單位ml)的影響(x±s)

.vs正常組 .p＜0.05 ..p＜0.01*vs模型組*p＜0.05**p＜0.01由表9可見，模型組給予水負荷后動物尿量明顯增加，0～3小時期間與正常組比較有統計學差異(p＜0.01或0.05)。
低分子量褐藻多糖硫酸酯各組在給藥后6小時內尿量與模型組比較均有增加，其中100mg/kg組在給藥后3～4小時期間尿量有統計學差異(p＜0.05)；200mg/kg組在給藥后1～6小時期間尿量有統計學差異(p＜0.01或0.05)。褐藻多糖硫酸酯200mg/kg組也有作用趨勢。各劑量組作用有劑量依賴性。
低分子量褐藻多糖硫酸酯各組在給藥后2～4小時利尿作用最強。
氫氯噻嗪組在給藥后6小時內尿量與模型組比較均有統計學差異(p＜0.01或0.05)。
2.對正常動物的作用體重150～200g的雄性健康Wistar大鼠，置于代謝籠中預適應1日，接取6小時尿液，觀察自由飲水條件下的尿量，選尿量穩定的動物入選試驗。
按6小時排尿量將動物隨機分為5組，即受試藥物高、低劑量組，樣品1組，氫氯噻嗪組，正常組。給藥組劑量分別為低分子量褐藻多糖硫酸酯100、200mg/kg，褐藻多糖硫酸酯(樣品1)200mg/kg，氫氯噻嗪4mg/kg。給藥容積為1ml/100g，正常組給予等容積溶媒。
試驗前動物禁食18小時。給藥后動物迅速放入給予充足飲水的代謝籠中，每代謝籠中放置大鼠1只，放入前輕壓動物下腹，排盡余尿。藥后每小時接尿一次，連續觀察6小時，觀察各組一定時間內尿量的差異。結果用均數±標準差表示，用組間t檢驗進行顯著性測驗，見表10。
表10 低分子量褐藻名糖硫酸酯對正常大鼠單位時間內尿量(單位ml)的影響(x±s)

*vs正常組*p＜0.05**p＜0.01由表10可見低分子量褐藻多糖硫酸酯各組在給藥后尿量與正常組比較均有增加，其中200mg/kg組在給藥后0～5小時期間尿量與正常組比較有統計學差異(p＜0.01或0.05)；100mg/kg組在給藥后部分時間內尿量也有統計學差異(p＜0.01或0.05)。各劑量組作用具有劑量依賴性。
低分子量褐藻多糖硫酸酯各組在給藥后2～4小時利尿作用最強。
氫氯噻嗪組在給藥后6小時內尿量與正常組比較均有統計學差異(p＜0.01或0.05)。
試驗結論低分子量褐藻多糖硫酸酯100～200mg/kg單次灌胃給藥對正常及水負荷大鼠均有利尿作用，在給藥后2～4小時利尿作用最強，各劑量組作用差異明顯，具有一定劑量依賴關系。
實施例7 低分子量褐藻多糖硫酸酯(樣品B)對小鼠遲發型超敏反應及體液免疫的影響體重24～26g的健康昆明小鼠，雌雄兼用。用1.25％的2，4-二硝基氯苯丙酮液背部皮下0.02ml/只注射小鼠致敏。致敏后一天，動物隨機分為5組，即低分子量褐藻多糖硫酸酯B兩個劑量組及樣品1組，醋酸地塞米松組，模型組。分別灌胃給予低分子量褐藻多糖硫酸酯150、300mg/kg，褐藻多糖硫酸酯300mg/kg，醋酸地塞米松0.1mg/kg，模型組給予等容積生理鹽水，連續灌胃9天，第10天以0.25％2，4-二硝基氯苯丙酮液皮下注射小鼠右足墊中間，劑量為0.02ml/只，對側足注射等容積丙酮液作對照，38小時后從踝關節剪下二足，電子天平稱重，按照下式計算腫脹度及抑制率，并進行統計學處理。
腫脹度＝右足重量(mg)-左足重量(mg)

處死動物前取內眥靜脈血離心，速率散射比濁法測定血清C3、C4、IgG、IgM含量。
另取10只昆明種小鼠作為正常組，同樣飼養10天后，內眥靜脈取血離心，同上測血清C3、C4、IgG、IgM含量。結果見表11、12。
表11 低分子量褐藻多糖硫酸酯對2，4-二硝基氯苯所致小鼠遲發型超敏反應的影響

由表11可見，低分子量褐藻多糖硫酸酯ig給藥9天對2，4-二硝基氯苯所致小鼠遲發型超敏反應有抑制作用，150、300mg/kg組腫脹度與模型組比較p＜0.01。醋酸地塞米松組也有類似作用。
表12 低分子量褐藻多糖硫酸酯對血清C3、免疫球蛋白、總補體含量的影響

·vs正常組·p＜0.05 ··p＜0.01*vs模型組*p＜0.05**p＜0.01由表12可見，小鼠皮下注射2，4二硝基氯苯后體液免疫指標均升高。給予藥物ig 9天后，低分子量褐藻多糖硫酸酯150mg/kg組對小鼠體液免疫部分指標有抑制作用；低分子量褐藻多糖硫酸酯300mg/kg組及醋酸地塞米松組對小鼠體液免疫各項指標均有顯著抑制作用，與模型組比較p＜0.05或p＜0.01。
試驗結論(1)低分子量褐藻多糖硫酸酯150、300mg/kg給藥ig 9天對2，4二硝基氯苯所致小鼠遲發型超敏反應有明顯抑制作用，且有劑量依賴性；(2)低分子量褐藻多糖硫酸酯150、300mg/kg給藥ig9天可明顯抑制超敏反應小鼠體液免疫。
權利要求
1低分子量褐藻多糖硫酸酯在制備治療腎臟疾病的藥物中的用途，其中所述的低分子量褐藻多糖硫酸酯是將褐藻多糖硫酸酯通過降解而制得的硫酸化多糖或寡糖類物質。
2根據權利要求1的用途，其中所述的腎臟疾病選自腎功能衰竭、腎炎和腎病綜合征中的一種或幾種。
3根據權利要求2的用途，其中所述的腎炎為臨床上常見的急性腎小球腎炎、慢性腎小球腎炎、腎盂腎炎、隱匿性腎炎、過敏性紫癜腎炎、紅斑狼瘡腎炎中的一種或幾種。
4根據權利要求1～3中任一項權利要求的用途，其中所述的低分子量褐藻多糖硫酸酯分子量為1000～200000。
5根據權利要求4的用途，其中所述的低分子量褐藻多糖硫酸酯分子量為5000～100000。
6根據權利要求5的用途，其中所述的低分子量褐藻多糖硫酸酯分子量為8000～80000。
7根據權利要求6的用途，其中所述的低分子量褐藻多糖硫酸酯分子量為50000～80000。
8根據權利要求6的用途，其中所述的低分子量褐藻多糖硫酸酯分子量為15000～30000。
9根據權利要求1的用途，其中的褐藻多糖硫酸酯來源于海帶、野生褐藻馬尾藻、裙帶菜、羊棲菜、鼠尾藻、海黍子、昆布、泡葉藻或墨角藻一種或幾種。
10根據權利要求1的用途，其中的低分子量褐藻多糖硫酸酯的劑型為注射劑、口服制劑、局部給藥制劑或鼻腔給藥制劑。
全文摘要
本發明公開了低分子量褐藻多糖硫酸酯在制備腎臟疾病的藥物中的用途。其中的腎臟疾病包括但不限于腎功能衰竭、腎炎和腎病綜合征等。本發明中的低分子量褐藻多糖硫酸酯可以是從海帶、墨角藻、泡葉藻、昆布或繩藻中提取得到的褐藻多糖硫酸酯降解而得，分子量為1000～200000。
文檔編號A61P13/00GK101028282SQ20071006431
公開日2007年9月5日 申請日期2007年3月12日 優先權日2007年3月12日
發明者郝守祝, 李靜 申請人:北京世紀博康醫藥科技有限公司