一種前脂肪細胞異種疫苗及其制備方法和用途的制作方法

專利名稱：一種前脂肪細胞異種疫苗及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種前脂肪細胞異種疫苗及其制備方法和用途，屬于生物技術領域。
技術背景近年來，隨著我國社會經濟的發展、人民物質生活水平的提高和生活方式的改變，肥 胖癥的發病率呈逐年上升的趨勢。肥胖癥是一種嚴重威脅人類健康的全球性慢性疾病。現 己知肥胖癥是高血壓、高血脂、糖尿病、心血管疾病、睡眠呼吸暫停綜合征等多種慢性疾 病和社會心理障礙的重要危險性因素，是導致早死、致殘、影響生活質量和增加國家財政 負擔的重要的全球性的健康問題。按照世界衛生組織規定，當進食熱量超過人體消耗量而以脂肪形式貯存于體內，致使 體重指數(Body mass index, BMI):體重(Kg)/身高2(1!12)大于25 29. 9者為超體重，》 30. 0稱肥胖癥。現美國有3200萬婦女，2600萬男性超標準體重。世界衛生組織認為肥胖、 艾滋病、吸毒、酒精中毒將成為二十一世紀全球四大健康問題，預防和治療肥胖癥是本 世紀前50年世界各國所要面臨的最大的流行病挑戰。肥胖的主要原因是機體能量的攝入超過消耗，多余的能量以脂肪形式貯存所致。機體 能量平衡受飲食、運動、內分泌疾病及遺傳等多重因素的影響。限制能量攝入和增加運動 相結合被推薦為有效的減肥方法。在美國，29%的男性和44%的女性認為自己在盡力減肥， 但僅20%的人承認做到了限制能量攝入和增加運動相結合，盡管這可使體重下降，卻難 以長期維持減重的效果。由此可見，對大多數肥胖患者而言，減重是困難的，而長期保持 減重將面臨更嚴峻的挑戰。因此，適當選擇使用減肥藥物是未來的必然趨勢。目前治療肥胖癥的藥物按作用機制，可分為三類作用于中樞的食欲抑制劑、作用于 外周減少營養吸收的脂酶抑制劑和增加能量消耗的藥物。就臨床應用而言，目前獲準廣泛 應用而未發現嚴重副反應的只有作用于中樞的食欲抑制劑西布曲明和作用于外周減少營 養吸收的脂酶抑制劑奧利斯他，但其應用時間不長，尚需作長期追蹤的臨床評估。西布曲 明的主要副作用有口干、厭食、便秘、失眠、惡心、腹痛、眩暈等胃腸道及中樞神經系統 刺激作用，少數患者心率稍增快、血壓輕度增高，但有很大個體差異， 一般可耐受。奧利 斯他的主要副作用為胃腸道不適，包括脂肪便、脂肪瀉、腹痛、腹脹、肛門排氣增多和大 便失禁等，少數人因為胃腸道不良反應放棄使用。綜上所述，現在人們迫切希望開發出更 為安全、有效的減肥藥。現在研究已表明肥胖不僅是脂肪細胞體積的增大，也包括脂肪細胞數目的增加。脂肪 細胞體積的改變主要通過脂肪生成或脂肪溶解作用。脂肪細胞數目的增多是通過前脂肪細 胞增殖與分化以及成熟脂肪細胞的增殖實現；其數目的減少則通過脂肪細胞、前脂肪細胞 的凋亡及其他可能的機制如脂肪細胞的去分化而實現。肥胖者的前脂肪細胞或脂肪細胞去分化之后，在體外培養的條件下具有過度增殖的特點。通常脂肪細胞數目增多與減少之間 保持在一種平衡狀態，當脂肪細胞數目增多明顯多于減少時，就有可能導致肥胖癥的發生。 有研究表明單純性肥胖兒童脂肪細胞的凋亡率明顯低于非肥胖兒童，這種異常有可能參與 了肥胖癥的發生過程。肥胖癥被認為一定程度上是前脂肪細胞細胞的增殖、分化及成熟脂 肪細胞的增殖失控的結果。因此，可以推斷設法誘導前脂肪細胞和成熟脂肪細胞凋亡將是 治療肥胖癥的一項重要策略。神經肽Y (neurop印tide Y， NPY)是迄今發現的中樞性刺激食欲的最有效的物質， 有研究發現經外科手術側腦室插管，月茵室內(intracerebroventricularly， i. c. v.)注 射神經肽Y-Y5受體的反義寡聚脫氧核糖核酸可以導致脂肪細胞的凋亡和脂肪分解。瘦素 (l印tin，又稱消脂素)是脂肪細胞產生的一種肽類激素，它可能作用于下丘腦的相應受 體從而發揮其調節脂肪組織代謝及脂肪細胞數目的作用。瘦素對脂肪細胞的分解代謝無直 接作用，這一點可由目前為止在脂肪組織中尚未發現痩素的受體而支持。Gullicksen等 發現腦室內(i.c.v.)注射瘦素不僅可以誘導脂肪細胞凋亡，而且脂肪細胞體積也縮小。由此可見，目前研究發現的可以誘導脂肪細胞凋亡的神經肽Y和瘦素都需要外科手術 進行腦室內(i.c.v.)注射才有誘導脂肪細胞凋亡的治療效果，此種復雜的腦外科手術不 僅花費昂貴，而且風險較大、 一般患者難以接受，基本上沒有臨床實施的可行性。因此， 尋找有效的并且臨床可行的誘導前脂肪細胞和成熟脂肪細胞凋亡的方法是當今肥胖癥治 療研究的關鍵問題和國際上的研究熱點。 發明內容針對現有技術的不足，本發明提供一種前脂肪細胞異種疫苗及其制備方法和用途，為 誘導前脂肪細胞凋亡提供了新的方法。 發明概述我們利用前脂肪細胞異種免疫，誘導機體對自身前脂肪細胞產生免疫應答，阻止自身 前脂肪細胞的增值和分化為成熟脂肪細胞，有效抑制脂肪組織的產生。在正常情況下，機 體對自身抗原不產生免疫應答，即自身耐受性；所以，我們將生物進化中的異種同源基因、 異種免疫排斥及自身免疫反應相結合，用以克服自身抗原的免疫耐受性。在本發明中，我 們將設計誘導前脂肪細胞凋亡的方法，并探討其可行性。本發明利用被固定了的異種前脂肪細胞作為疫苗進行主動免疫的方法，并用同種前脂 肪細胞和異種成纖維細胞作對照，來打破機體對自身前脂肪細胞的免疫耐受，誘導機體產 生針對自身前脂肪細胞的交叉免疫反應，從而導致前脂肪細胞凋亡，達到治療肥胖癥的目 的，最終實現肥胖癥治療新途徑的突破。發明詳述本發明的技術方案如下本發明的前脂肪細胞異種疫苗，是用小鼠3T3-Ll前脂肪細胞作為前脂肪細胞來源制 作的前脂肪細胞異種疫苗。可作為交叉抗原異種免疫，激發機體免疫系統，對機體前脂肪細胞產生免疫應答。本發明的前脂肪細胞異種疫苗制備方法，步驟如下將小鼠3T3-Ll前脂肪細胞于含10%胎牛血清、lOOU/tnL的青霉素、0. lmg/mL的鏈霉素 的DMEM培養基上培養，當小鼠3T3-Ll前脂肪細胞匯合達7(m時，用胰蛋白酶消化、傳代。 收集體外培養的前脂肪細胞，用PBS洗3次。用PBS配制3%多聚甲醛，pH 7.4，作為固 定液，在4'C固定細胞24h。用PBS洗3次，37'C孵育2h以去除殘余的多聚甲醛。用PBS 重懸后即為前脂肪細胞異種疫苗。用本發明制備的異種前脂肪細胞疫苗進行免疫預防，通過抗大鼠前脂肪細胞自身抗 體的研究和前脂肪細胞凋亡的檢測，結果顯示本發明前脂肪細胞異種疫苗可打破機體對自 身前脂肪細胞的免疫耐受，誘導機體產生針對自身前脂肪細胞的交叉免疫反應，從而導致 前脂肪細胞凋亡，達到治療肥胖癥的目的，可用于肥胖癥的治療。本發明前脂肪細胞異種疫苗的用途，用于制備預防或治療肥胖癥的藥物。本發明前脂 肪細胞異種疫苗可進行主動免疫能夠預防肥胖癥的發生和治療肥胖癥。


圖1為雄性大鼠治療組和對照組中的體重-時間曲線。 圖2為雌性大鼠治療組和對照組中的體重-時間曲線。 圖3是大鼠的前脂肪細胞中自身抗體儲存的免疫組化照片。 圖4是體內前脂肪細胞凋亡的免疫熒光照片。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明做進一步說明。實施例1:(一)疫苗細胞、對照細胞的培養和疫苗制備1、 試劑(1) 磷酸鹽緩沖液(PBS):取ZLI-9061 PBS溶于1000ml的蒸餾水中，混勻，測pH 值應在7.2-7.4之間，若偏離此范圍，用O. 1N的HCL或Na0H調整。(2) 固定液用PBS配制3y。多聚甲醛，pH 7.4。2、 材料前脂肪細胞來源于體外培養的人、鼠等前脂肪細胞系，其中小鼠前脂肪細胞系3T3-L1、 人成纖維細胞系MRC-5和NIH/3T3細胞系均購自ATCC (American Type Culture Collection),購買方便，因此，我們用小鼠前脂肪細胞系3T3-Ll作為疫苗細胞來源，并 用人成纖維細胞系MRC-5、小鼠成纖維細胞系NIH/3T3作為對照細胞。3、 試驗方法小鼠3T3-L1前脂肪細胞的培養在含10%胎牛血清、100U/mL的青霉素、0. lmg/mL 的鏈霉素的DMEM培養基中培養細胞。當小鼠3T3-L1前脂肪細胞匯合達70%時，用胰蛋白 酶消化、傳代。人成纖維細胞系MRC-5和NIH/3T3細胞系均用含10%胎牛血清、100U/mL的青霉素、0. lmg/mL的鏈霉素的函EM培養基按常規細胞系培養法培養，將其置于含5%C02 37'C培養箱中大量擴增。收集體外培養擴增后的細胞于離心管中，包括各種前脂肪細胞和對照細胞，用PBS洗 3次。用固定液在4r固定細胞24h。用PBS洗3次，37'C孵育2h以去除殘余的多聚甲醛。 加PBS制備成細胞懸液，用血細胞記數板記數細胞后，用0.9%生理鹽水制備細胞懸液， 濃度為107ml。即制備出前脂肪細胞異種疫苗，放置于離心管，密封，一8(TC冰箱保存備 用。(二)前脂肪細胞異種疫苗免疫預防大鼠進食高能伺料后發生肥胖癥的作用將6-8周齡、雌性SD大鼠隨機分為治療組和對照組(每組10只)，治療組大鼠每只 用濃度為107ml的小鼠前脂肪細胞lml，對照組大鼠同樣用人成纖維細胞系MRC-5、 NIH/3T3細胞和0. 9%生理鹽水各lml腹腔內注射，每周1次，連續4周。當第4次注射免 疫完成后，給SD大鼠喂高能量飼料(脂肪和蛋白質含量較高)，高能量飼料成分為粗蛋白 25%，，脂肪11%,，碳水化合物等6錢。同樣方法對雄性大鼠進行研究。觀察疫苗免疫組和 對照組雌雄性大鼠的體重變化，并用非參數的秩和檢驗進行統計學分析，對用異種前脂肪 細胞作為疫苗免疫是否能夠預防肥胖癥的發生進行分析。將雌性大鼠治療組和對照組中的體重-時間作曲線，其結果見附圖1。雄性大鼠的體 重-時間作曲線見附圖2。可以看出，經異種小鼠前脂肪細胞免疫后的大鼠，不論雌性和雄性，體重都得到明顯 的抑制，統計學分析P<0. 05。而人成纖維細胞系MRC-5、 NIH/3T3細胞和0. 9%生理鹽水 免疫后的大鼠.，體重沒有明顯變化，統計學分析P〉0.05。 (三)大鼠的前脂肪細胞中自身抗體儲存的檢測通過用異種前脂肪細胞免疫大鼠的血清和未被異種前脂肪細胞免疫大鼠的血清(作對 照)作為第一抗體的免疫組織化學技術染色免疫大鼠的前脂肪細胞和成熟脂肪細胞，可以 鑒定出在被免疫大鼠的前脂肪細胞中有自身抗體儲存(圖3所示)。(四)前脂肪細胞凋亡的檢測用末端脫氧核苷酰轉移酶(TUNEL法)標記免疫熒光染色法檢測到體內前脂肪細胞的凋 亡(圖4所示)。
權利要求
1、一種前脂肪細胞異種疫苗，其特征在于，是用小鼠3T3-L1前脂肪細胞作為前脂肪細胞來源制作的前脂肪細胞異種疫苗。
2、制備權利要求1所述的一種前脂肪細胞異種疫苗的方法，其特征在于，步驟如下 將小鼠3T3-L1前脂肪細胞于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、0. lmg/mL鏈霉素的DMEM 培養基上培養，當小鼠3T3-Ll前脂肪細胞匯合達70y。時，用胰蛋白酶消化、傳代；收集體 外培養的前脂肪細胞，用PBS洗3次；用PBS配制3y。多聚甲醛，pH7.4，作為固定液，在 4'C固定細胞24h;用PBS洗3次，37'C孵育2h以去除殘余的多聚甲醛；用PBS重懸后即 為前脂肪細胞異種疫苗。
3、權利要求1所述的一種前脂肪細胞異種疫苗的用途,用于制備預防或治療肥胖癥的 藥物。
全文摘要
本發明涉及一種前脂肪細胞異種疫苗及其制備方法和用途，屬于生物技術領域。本發明前脂肪細胞異種疫苗是用小鼠前脂肪細胞系3T3-L1作為疫苗細胞來源，疫苗的制備是通過體外培養擴增細胞，用多聚甲醛進行固定后，再洗棄殘余的多聚甲醛，制備成細胞懸液而得。本發明前脂肪細胞異種疫苗可進行主動免疫能夠預防肥胖癥的發生并用于治療肥胖癥。
文檔編號A61P3/00GK101259266SQ20081001568
公開日2008年9月10日 申請日期2008年4月14日 優先權日2008年4月14日
發明者欣 徐, 來慶國, 袁奎封, 高振南 申請人:山東大學