一種能專門識別重組豬干擾素ɑ的單克隆抗體及ELISA試劑盒制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種能專門識別重組豬干擾素ɑ的單克隆抗體及ELISA試劑盒制備方法，利用本發明技術生產的重組豬干擾素ɑ單克隆抗體可特異地檢測重組豬干擾素ɑ產品。所述該劑盒由抗重組豬干擾素ɑ雜交瘤細胞株所分泌單克隆抗體制備的ELISA檢測試劑盒，其檢測重組豬干擾素ɑ產品具有靈敏度高、特異性強、操作簡便和診斷快速等優點。
【專利說明】—種能專門識別重組豬干擾素α的單克隆抗體及ELISA試劑盒制備方法
【技術領域】
[0001]本發明主要涉及一種針對重組豬干擾素α蛋白的單克隆抗體和用于檢測重組豬干擾素α產品的ELISA試劑盒。
【背景技術】
[0002]豬干擾素為一種廣譜的抗病毒制劑，主要是通過與細胞表面受體作用使細胞產生抗病毒蛋白，進而抑制豬瘟、口蹄疫等病毒的復制；同時還可增強自然殺傷細胞(NK細胞)、巨噬細胞和T淋巴細胞的活力，起到免疫調節作用，并增強抗病毒能力。豬干擾素在畜牧業生產上的應用已受到高度關注。最早在國內應用于獸醫臨床的是豬白細胞干擾素，由于這種干擾素存在工藝成本高等問題。而基因工程技術的發展為豬干擾素大量生產提供了新的平臺。我室采用基因工程技術獲得了一種重組豬干擾素α (重組豬α干擾素的制備方法，專利號2008100201804)，臨床試用結果表明其可有效治療豬病毒性腹瀉等疾病。但目前市場上尚無重組豬干擾素α產品的檢測試劑盒，阻礙了其廣泛應用，因此有必要研制重組豬干擾素α相應檢測試劑盒，確立檢測方法，供實驗室和市場上對重組豬干擾素α產品的鑒定和驗證用。
【發明內容】
[0003]本發明目的就是為了彌補已有技術的缺陷，提供一種重組豬干擾素α蛋白的單克隆抗體及ELISA試劑盒制備方法。
[0004]本發明是通過以下技術方案實現的:
[0005]一種能專門識別重組豬干擾素α的單克隆抗體，包括以下步驟:
[0006](I)將純化的重組豬干擾素α蛋白免疫Balb/c小鼠，分4次免疫，以間接ELISA檢測小鼠血清中重組豬干擾素α抗體的效價，效價高者選為下一步細胞融合的對象；
[0007](2)取經最后強化免疫的Balb/c小鼠，收集血清，消毒。無菌取出小鼠脾臟、分離脾細胞，與新鮮制備、生長良好的小鼠骨髓瘤細胞融合，HAT培養基稀釋融合細胞懸液，加入已預先鋪有飼養細胞的96孔板中，100 μ I/孔，于培養箱中培養，篩選單克隆抗體雜交瘤細胞，共篩選得2株雜交瘤細胞，編號為BI和D6 ；
[0008](3)取D6、BI雜交瘤細胞培養上清，采用SIGMA公司單克隆抗體亞型檢測試劑盒檢測，編號為D6和BI抗重組豬干擾素α雜交瘤細胞株株所分泌抗體的亞型分別為IgGl和IgG2a ；
[0009](4)腹腔內注射液體石蠟，6~8d后每只小鼠腹腔注射雜交瘤細胞懸液；7~IOd后觀察小鼠腹部膨脹程度收集腹水，經離心去沉淀后以辛酸-飽和硫酸銨粗純，再以DEAE陰離子交換層析純化單抗，-80°C保存。
[0010]一種ELISA檢測試劑盒，所述試劑盒包括權利要求書I的單克隆抗體制備得到抗重組豬干擾素α單克隆抗體包被酶標反應板和酶標記物、標本稀釋液、洗滌液、底物液、陰性質控品、陽性質控品和終止液；
[0011]所述的標本稀釋液為:含10%小牛血清和2%抗人IgG的0.01M pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)；
[0012]所述的洗滌液為:含有0.05% Tween20的0.01mol/L ρΗ7.4的磷酸鹽緩沖液(PBST)；
[0013]所述的底物液為=TMB-H2O2尿素溶液；
[0014]所述的終止液為:2mol/L H2SO4溶液；
[0015]所述的陰性質控品為:0.01M pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)；
[0016]所述的陽性質控品為:lmg/ml重組豬干擾素α蛋白；
[0017]所述的酶標記物的制備包括以下步驟:
[0018]取編號為BI抗重組豬干擾素α雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體，采用過碘酸鈉法制備辣根過氧化物酶的酶標記物，以飽和硫酸銨沉淀法進行純化。純化檢測后，加入終濃度為50%的甘油、0.1%的硫柳汞置_20°C保存；
[0019]所述的抗重組豬干擾素α單克隆抗體包被酶標反應板的制備包括以下步驟:
[0020]取96孔酶標板一塊，包被編號為D6的抗重組豬干擾素α雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體IOOng/孔，4°C過夜，取包被板加200 μ I PBS稀釋的10%小牛血清37°C封閉1.5小時，得到抗重組豬干擾素α單克隆抗體包被酶標反應板；
[0021]所述的ELISA檢測試劑盒，所述的檢測重組豬干擾素α含量的臨界值為50ng/ml。
[0022]本發明的優點:
[0023]建立了一種快速、準確，利用高通量檢測重組豬干擾素。產品的檢測方法，為獸藥管理部門提供一套實用有效的試劑盒產品。
[0024]說明書附圖:
[0025]圖1為抗重組豬干擾素α單克隆抗體雜交瘤細胞染色體計數(X 1000)；
[0026]圖2為Western-blot檢測抗重組豬干擾素α單克隆抗體特異性；其中
[0027]M:蛋白markerl:BL21工程菌對照2:重組豬干擾素α蛋白樣品。
【具體實施方式】
[0028]實施例1
[0029]1、試劑的制備
[0030](I)包被液(0.05mol/L, ρΗ9.6的碳酸鈉一碳酸氫鈉緩沖液)=Na2CO3L 5g,NaHC032.9g, Na2N30.2g，加雙蒸水至 1000ml，調至 ρΗ9.6。
[0031](2)標本稀釋液(即 PBS 緩沖液):NaC18.0g、KH2PO40.2g、Na2HP04.12Η202.9g、KC10.2g，硫柳汞0.lg，加雙蒸水至1000ml，調至ρΗ7.4，即得。
[0032](3)封閉液:(10% 小牛血清 /PBS 溶液)小牛血清 100ml，IXPBS (ρΗ7.4) 900ml。
[0033](4)洗滌液(PBST，ρΗ7.4):NaC18.0g、KH2PO40.2g、Na2HPO4.12H202.9g、KC10.2g、Tween200.5ml、硫柳萊 0.lg、加雙蒸水至 1000ml,調至 ρΗ7.4。
[0034](5 )底物液(TMB-H2O2尿素溶液):
[0035]①底物液A (3、3 ‘、5、5 ‘一四甲基聯苯胺，TMB):TMB200mg，無水乙醇100ml，加雙蒸水至1000ml。[0036]②底物液B緩沖液(0.lmol/L檸檬酸-0.2mol/L磷酸氫二鈉緩沖液，pH5.0~
5.4):Na2HP0414.60g,梓檬酸9.33g, 0.75%過氧化氫尿素6.4ml,加雙蒸水至1000ml,調至pH5.0 ~5.4。
[0037]③將底物液A和B按1:1混合，即成TMB-H2O2尿素溶液。
[0038](6)終止液:(2mol/L H2SO4溶液):雙蒸水600ml，濃硫酸100ml (緩慢滴加并不斷攪拌)，加雙蒸水至900ml。
[0039]2、抗重組豬干擾素α雜交瘤細胞系的建立
[0040]將純化的重組豬干擾素α蛋白免疫Balb/c小鼠,分4次免疫后以間接ELISA檢測小鼠血清中重組豬干擾素α抗體的效價，效價高者選為下一步細胞融合的對象。
[0041]取經最后強化免疫的Balb/c小鼠，眼眶放血處死(收集血清，即為陽性血清)，消毒。無菌取出小鼠脾臟、分離脾細胞，與新鮮制備、生長良好的小鼠骨髓瘤細胞(SP2/0細胞株)融合，HAT培養基稀釋融合細胞懸液，加入已預先鋪有飼養細胞(免疫小鼠的腹腔巨噬細胞)的96孔板中，100 μ I/孔，于培養箱中培養。次日后連續觀察細胞生長狀態，防止發生污染，并進行后續管理，篩選單克隆抗體雜交瘤細胞，共篩選得2株雜交瘤細胞，編號為BI和D6。
[0042]雜交瘤細胞系染色體檢查:在細胞培養基中加入秋水仙素使大部分細胞停留在有絲分裂中期，37°C繼續培養2h，常規染色體標本制備方法固定、染色，鏡下檢查并進行染色體計數。雜交瘤細胞的染色體計數達106條，高于兩親本的染色體數目，表明雜交瘤細胞確實為SP2/0與小鼠脾細胞的融合細胞。
[0043]以Western-blot測 定雜交瘤細胞培養上清液的抗體特異性，2株抗重組豬干擾素α雜交瘤細胞培養上清液均有特異性識別重組豬干擾素α蛋白能力。
[0044]3、抗重組豬干擾素α單克隆抗體亞型鑒定
[0045]取D6、BI雜交瘤細胞培養上清，采用SIGMA公司單克隆抗體亞型檢測試劑盒檢測(Lot072K4849)，編號為D6和BI抗重組豬干擾素α雜交瘤細胞株株所分泌抗體的亞型分別為 IgGl 和 IgG2a。
[0046]4、抗重組豬干擾素α單克隆抗體的制備
[0047]腹腔內注射0.5ml液體石蠟，第7d后每只小鼠腹腔注射I X 107/ml雜交瘤細胞懸液0.5ml ;7~IOd后觀察小鼠腹部膨脹程度收集腹水，經離心去沉淀后以辛酸-飽和硫酸銨粗純，再以DEAE陰離子交換層析純化單抗，其純度可達90%以上，_80°C保存。間接ELISA檢測其效價1:106。
[0048]5、酶標記物的制備
[0049]編號為BI的抗重組豬干擾素α雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體，采用過碘酸鈉法制備辣根過氧化物酶的酶標記物，以飽和硫酸銨沉淀法進行純化。純化檢測后，加入終濃度為50%的甘油、0.1%的硫柳汞置_20°C保存。
[0050]6、重組豬干擾素aELISA檢測試劑盒的組裝
[0051]取96孔酶標板一塊，包被編號為D6的抗重組豬干擾素α雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體IOOng/孔，4°C過夜，取包被板加200 μ I PBS稀釋的10%小牛血清37°C封閉1.5小時，得到抗重組豬干擾素α單克隆抗體包被酶標反應板；
[0052]重組豬干擾素aELISA檢測試劑盒由上述抗重組豬干擾素a單克隆抗體包被酶標反應板、標本稀釋液、洗滌液、酶標記物、底物液、陰性質控品、陽性質控品和終止液構成。
[0053]具體分為:
[0054](I)標本稀釋液:含10%小牛血清和2%抗人IgG的0.01M pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)；
[0055](2)洗滌液:含有 0.05% Tween20 的 0.01mol/L ρΗ7.4 的磷酸鹽緩沖液(PBST)；
[0056](3 )底物液=TMB-H2O2尿素溶液；
[0057](4)終止液:2mol/L H2SO4 溶液；
[0058](5)陰性質控品:0.01M ρΗ7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)；
[0059](6 )陽性質控品:lmg/ml重組豬干擾素。蛋白
[0060]7、利用上述試劑盒采用ELISA法檢測重組豬干擾素α產品
[0061](I)將陽性質控品用樣品稀釋液按 1:10、1:50、1:200、1:1000、1:5000、1:20000)倍比稀釋 6 個濃度(濃度分別為 0.lmg/ml>20 μ g/ml>5 μ g/ml>I μ g/ml、0.2 μ g/ml、50ng/ml)，加入稀釋后的陽性質控品、陰性質控品和待檢樣品100μ I/孔。37°C孵育lh，洗滌液洗板3次，350 μ I/孔，甩干；
[0062](2)加酶標記物100 μ I/孔，37°C孵育40min，洗滌液洗板3次，350 μ I/孔，甩干；
[0063](3)顯色:用洗滌液洗板后每孔加入底物液100μ 1，37°C或室溫避光顯色15分鐘；
[0064](4)每孔加入終止液50 μ I,終止反應；
[0065](5)測定:450nm波長依序測量各孔的吸光度(0D值)。測定應在加終止液后15min以內進行。
[0066](6)計算結果:
[0067]定性檢測結果分析:將待檢標本血清平均OD值(P)除以陰性質控品平均OD值(N)，求得P/N值，P/N≥2.1為陽性，Ρ/Ν〈2.I為陰性。
[0068]定量檢測結果分析:在Excel工作表中，以根據陽性質控品稀釋的6個不同濃度血清標準品濃度作橫坐標，對應OD值作縱坐標，繪制出標準品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值。本試劑盒的檢測靈敏度為50ng/ml。
[0069]8、重組豬干擾素aELISA檢測試劑盒特異性檢測
[0070]取100份已知含重組豬干擾素a蛋白產品檢測，結果98份為陽性，陽性率為98%，取40份不含重組豬干擾素a蛋白產品標本檢測結果，40例全為陰性。總一致率為98.57%。[0071 ] 表1重組豬干擾素aELISA檢測試劑盒性能分析
【權利要求】
1.一種能專門識別重組豬干擾素α的單克隆抗體，其特征在于包括以下步驟: (1)將純化的重組豬干擾素α蛋白免疫Balb/c小鼠,分4次免疫，以間接ELISA檢測小鼠血清中重組豬干擾素α抗體的效價，效價高者選為下一步細胞融合的對象； (2)取經最后強化免疫的Balb/c小鼠，收集血清，消毒；無菌取出小鼠脾臟、分離脾細胞，與新鮮制備、生長良好的小鼠骨髓瘤細胞融合，HAT培養基稀釋融合細胞懸液，加入已預先鋪有飼養細胞的96孔板中，100 μ I/孔，于培養箱中培養，篩選單克隆抗體雜交瘤細胞，共篩選得2株雜交瘤細胞，編號為BI和D6 ； (3)腹腔內注射液體石蠟，6-8d后每只小鼠腹腔注射B1、D6雜交瘤細胞懸液；7~10d后觀察小鼠腹部膨脹程度收集腹水，經離心去沉淀后以辛酸-飽和硫酸銨粗純，再以DEAE陰離子交換層析純化單抗，_80°C保存。
2.—種ELISA檢測試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括權利要求書I的單克隆抗體制備得到抗重組豬干擾素α單克隆抗體包被酶標反應板和酶標記物、標本稀釋液、洗滌液、底物液、陰性質控品、陽性質控品和終止液； 所述的標本稀釋液為:含10%小牛血清和2%抗人IgG的0.01M ρΗ7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)； 所述的洗滌液為:含有0.05% Tween 20的0.01mol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBST); 所述的底物液為=TMB -H2O2尿素溶液； 所述的終止液為:2 mol/L H2SO4溶液； 所述的陰性質控品為:0.01M pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)； 所述的陽性質控品為:lmg/ml重組豬干擾素α蛋白； 所述的酶標記物的制備包括以下步驟: 取編號為BI抗重組豬干擾素α雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體，采用過碘酸鈉法制備辣根過氧化物酶的酶標記物，以飽和硫酸銨沉淀法進行純化，純化檢測后，加入終濃度為50%的甘油、0.1%的硫柳汞置_20°C保存； 所述的抗重組豬干擾素α單克隆抗體包被酶標反應板的制備包括以下步驟: 取96孔酶標板一塊，包被編號為D6的抗重組豬干擾素α雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體100 ng/孔，4°C過夜，取包被板加200μ I PBS稀釋的10%小牛血清37°C封閉1.5小時，得到抗重組豬干擾素α單克隆抗體包被酶標反應板。
3.根據權利要求2所述的ELISA檢測試劑盒，其特征在于所述的檢測重組豬干擾素α含量的臨界值為50ng/ml。
【文檔編號】G01N33/577GK103588879SQ201310526078
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年10月29日 優先權日:2013年10月29日
【發明者】趙俊, 王明麗, 劉君 申請人:趙俊, 王明麗