一種重組水貂α-干擾素的制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于基因工程領域，特別涉及一種重組水貂α -干擾素的制備方法和應 用。
【背景技術】
[0002] 干擾素是動物中目前所知出現最早、作用最快的第一抵御病毒體系。已對人和鼠 的干擾素進行了深入研宄，但對于水貂的干擾素研宄相對較少。
[0003] 水貂α -干擾素是由13個相關功能基因編碼的蛋白質家族，亞型基因間編碼框大 小一致，氨基酸同源性88. 8-98.4%。成熟的水貂α-干擾素由167個氨基酸組成，誘導其 分泌表達的信號肽由23個氨基酸組成。由于水貂的病毒性疾病種類多、危害大，因此發展 具廣譜抗病毒效應的水貂干擾素具有重要意義。但干擾素的傳統提取方法產量低、操作繁 瑣，很難推廣應用，因而尋找一種高效生產干擾素的方法成為亟待解決的問題。
[0004] 畢赤酵母表達系統是應用廣泛的一種真核表達系統，可胞外表達外源蛋白。相比 于大腸桿菌等原核表達系統，它具有完整的蛋白表達、加工和修飾功能，而與桿狀病毒、哺 乳動物細胞相比，它又具有培養成本低、產量高、便于產物的分離純化等優點。近年來，酵母 表達系統的研宄得到迅速發展，此系統具有高表達、高穩定、高分泌的特點，其宿主菌畢赤 酵母自身蛋白分泌量少，高活性外源蛋白的分泌量大，利于下游分離純化操作，能大規模發 酵生產，是一種適宜表達外源基因的真核表達系統。
【發明內容】
[0005] 本發明旨在克服傳統獲得干擾素方法的不足，提供一種重組水貂α -干擾素的制 備方法和應用，所述的制備方法通過高效外源表達重組水貂α-干擾素的真核表達系統實 現。
[0006] 本發明的目的通過下述技術方案實現：一種重組水貂α -干擾素的制備方法，包 括：將水貂α 2-干擾素基因克隆至載體pGAPZa A中，實現畢赤酵母重組表達載體的構建及 篩選，并在畢赤酵母中進行誘導表達，獲得重組水貂α -干擾素。
[0007] 所述的水貂α -干擾素基因序列如Seq ID NO :1所示。
[0008] 所述的水貂α -干擾素基因進行克隆時所用的引物為：
[0009] 擴增水貂α -干擾素基因特異性上游引物：
[0010] 5' -GAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGATGTGACCTGCCTCAGA-3' ；
[0011] 擴增水貂α -干擾素基因特異性下游引物：
[0012] 5 ' -GAGTTTTTGTTCTAGATTACTTCCTGCTCCGCA-3 '。
[0013] 所述的誘導表達的具體方法為：用含Zeocin 100mg/L的YTO液體培養基進行菌體 的擴增培養，30°C，300rpm搖床培養至OD6qq= 1. 5 ;按1:100比例轉接到含Zeocin IOOmg/ L的YPD液體培養基中，30°C，300rpm搖床培養至OD6qq= 6-8, 7000rpm，4°C，離心15min，獲 得含有重組水貂α-干擾素的上清液。
[0014] 本發明的目的還可以采用以下的技術措施來進一步實現。
[0015] 所述的畢赤酵母重組表達載體的構建及篩選，包括以下步驟：
[0016] 首先將載體PGAPZa用Xh0 I和Xba I雙酶切后檢測回收，設計擴增水貂α-干 擾素基因特異性引物，引物上下游分別有15個堿基與上述酶切后線性載體的兩端互補，回 收PCR基因片段，直接用In-Fusion HD Cloning Kit將片段和載體連接，轉化DH5a感受態 細胞，經質粒PCR和雙酶切鑒定陽性克隆，經驗證得到插入正確的重組畢赤酵母載體，即將 基因插入PGAP啟動子和a -alpha信號肽下游的Xho I /Xba I位點，構建成分泌型酵母 表達重組質粒，以Bin I酶切載體呈線性化后電擊轉化酵母X-33,轉化子經Zeocin IOOmg/ L抗性篩選，菌落PCR鑒定分析，確定陽性菌株后作進一步的搖瓶發酵。
[0017] 上述方法制備獲得的重組水貂α -干擾素在制備治療犬瘟熱疾病的藥物中應用。
[0018] 上述方法制備獲得的重組水貂α -干擾素在制備治療水貂細小病毒感染疾病的 藥物中應用。
[0019] 上述應用的一種優選配方為50~100萬IU重組水貂α -干擾素：1ml止血敏： 0. 8ml安乃近注射液。
[0020] 本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果：
[0021] 本發明采用常規的PCR方法獲得水貂α-干擾素基因編碼區，克隆入畢赤酵母分 泌型表達載體中，電轉化畢赤酵母菌，篩選高抗性轉化子，實現重組蛋白在畢赤酵母中的分 泌表達，并得到具有抗病毒活性的重組蛋白，蛋白濃度最高可達3. 593mg/mL。另外，本發明 通過優化畢赤酵母表達系統，提高了重組重組蛋白的抗病毒活性。
【附圖說明】
[0022] 圖1是畢赤酵母-X33培養上清多克隆抗體檢測MiIFN-α蛋白表達結果圖，其中 Α:克隆菌株1培養上清；Β:克隆菌株2培養上清；C:克隆菌株3培養上清；D:克隆菌株4 培養上清；Ε:克隆菌株5培養上清；F:克隆菌株6培養上清；G:克隆菌株7培養上清；Η: 陰性對照；MK:分子量標準。
[0023] 圖2是表達產物純化結果圖，其中Α:誘導IFN-α蛋白表達產物（6 μ g) ;Β:未誘 導IFN- α蛋白表達產物（6 μ g)，MK:分子量標準。
【具體實施方式】
[0024] 下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限 于此。
[0025] 實施例1畢赤酵母重組表達載體的構建
[0026] 1)水貂α -干擾素13個亞型基因序列擴增及多態性分析
[0027] 外周血淋巴細胞誘導及總RNA的提取：
[0028] 無菌采取健康水紹外周5mL，置于加有抗凝劑（38g/L梓檬酸鈉）的滅菌容器中， 然后在無菌條件下加入RPMI1640培養液1 :1稀釋。取5mL人用淋巴細胞分離液上，室溫下 2000r/min水平轉子離心40min。用折彎的滅菌長針頭小心將白細胞層移于另一試管中（約 ImL)中，加2倍體積的RPMI1640培養液混勻后，2000r/min離心10min，棄上清液，沉淀物再 加入等量RPMI1640,相同方法洗滌2次，棄去上清液，沉淀細胞用含lOOOOU/mL雙抗、IOOmL/ L小牛血清的RPMI1640培養液懸浮。取10 μ L細胞懸液計數，按計數結果稀釋至I X IO7/ mL，置于24孔細胞培養板中，37°C 50mL/LC02培養箱中靜置培養2h后，加入TCID 5Q為10 _6 5 新城疫弱毒株Lasota 100 μ 1誘導物培養24h〇
[0029] 收集誘導24h后的淋巴細胞于15mL離心管中，2000r/min離心10min，棄上清液， 將沉淀用ImL TRIzol Reagent重懸，凍存于-70°C備用。
[0030] 取出裝有淋巴細胞的凍存管，室溫融化，加 l/5Trizol體積的氯仿，充分混勻后靜 置3min，12000r/min離心15min，將沉淀用750mL/L的乙醇緩慢洗滌2遍，倒置控干后用 lmL/L DEPC處理的滅菌水9. 5 μ L溶解沉淀，即獲得淋巴細胞總RNA。
[0031] 2) 13個亞型基因通用引物的設計與合成
[0032] 應用Primer 5. O基因分析軟件，參照GenBank登陸的犬、狐、貓、豬、羊、牛、人及 禽類的α-干擾素基因序列，分析其核苷酸同源性，設計擴增水貂α-干擾素基因引物，弓丨 物序列如下：
[0033] 擴增水貂α -干擾素基因上游引物：5' -ATGGCCCTGCCCTGCTCCT-3' ；
[0034] 擴增水貂α -干擾素基因下游引物：5' -TCACTTCCTGCTCCGCAATCT-3'。
[0035] 采用RT-PCR方法擴增目的基因。操作步驟：在9. 5 μ L的RNA溶液中加入1 μ L 01igo(dT)15引物（50pmol/yL)，混勻后于70°C水浴作用5min，立即冷卻，依次加入 lOmmol/L dNTP 5 μ L，AMV 緩沖液 4 μ L，RNA 酶抑制劑 0. 5 μ L，AMV 1 μ L 充分混勻，42°C反 應lh，95°C 3min滅活反轉錄酶，冷卻后直接用于PCR反應。PCR反應體系：10XEx Taq緩沖 液2.5 4 1^，2.5臟〇1/1/^1^(1階132 4 1^，25口111〇1/^1^上、下游引物各14 1^，25口111〇1/1丁&9〇嫩 聚合酶0. 125 μ L，加入滅菌去離子水至25 μ L。將25 μ L反應液混勻后，于PCR儀上進行擴 增，循環參數為：95°C預變性 5min ;94°C 45s，52. 5°C lmin，72°C lmin，32 個循環后，72°C延 伸6