一種蛇毒絲氨酸蛋白酶、其編碼基因及應用的制作方法

專利名稱：一種蛇毒絲氨酸蛋白酶、其編碼基因及應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種蛇毒絲氨酸蛋白酶、其編碼基因及應 用。
背景技術：
絲氨酸蛋白酶(serineproteases)是一類蛋白水解酶，在蛇毒蛋白酶中占據著獨特 的位置，特別是蛙亞科和蝮亞科。其活性中心有His (Arg)-Asp-Ser三聯體殘基結構，因 而得名。其活性可被絲氨酸修飾劑苯甲基磺酰氟(PMSF)或者二異丙基氟磷酸(DFP)抑 制。另外，其氨基酸質序列與胰蛋白酶、激肽釋放酶有較大同源性，均具有一個共同活 性中心和相同的酶催化機制。蛇毒絲氨酸蛋白酶具有高度的序列相似性(6% -75% ), 相同的活性中心構造和酶催化機制，但底物專一性卻具較大的分化，這是由于活性中心 外可變區序列的差異造成的，因而進一步體現為生物學和藥理學功能的差異。根據其所 具有的活性，蛇毒絲氨酸蛋白酶大致可以分為三類。第一類為類凝血酶具有催化血纖 蛋白原降解為血纖蛋白的活性；第二類是類激肽釋放酶有幾種蛇毒絲氨酸蛋白酶具有 裂解激肽原釋放舒緩激肽的活性，其功能相當于哺乳動物的激肽釋放酶或激肽原酶，因 此被稱為“類激肽釋放酶”；第三類是有獨特活性的蛇毒絲氨酸蛋白酶包括激活C蛋 白、血小板、凝血因子V以及纖溶酶原等。綜合以上這些特性使絲氨酸蛋白成為蛋白酶結構與功能研究的優良模型，并在 臨床醫學診斷及心血管疾病治療中得到廣泛應用，絲氨酸蛋白不僅具廣闊的藥物開發前 景，更是藥理研究的優良工具。由于許多蛇毒絲氨酸蛋白酶的功能與凝血、溶血栓相 關，有可能開發出治療腦血栓和各種心血管疾病的藥物，因此有關蛇毒絲氨酸蛋白酶研 究也是國內外目前研究的熱點領域之一。至今有相當一部分蛇毒絲氨酸蛋白酶已獲得一 級結構序列。隨著分子生物學技術的發展，越來越多的蛇毒絲氨酸蛋白酶的基因得到了 分離、鑒定和表達，并且一些已經達到了商品化。

發明內容
本發明的目的是提供一種蛇毒中的絲氨酸蛋白酶、其編碼基因及應用。本發明從江浙蝮蛇(Agkistrodonhalyspallas)蛇毒中獲得一種絲氨酸蛋白酶，其
氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。全長233aa，理論分子量為25.495KD。實驗表明該 蛋白酶具有較高的精氨酸酯酶活性，具有抗血液凝結的活性。應當理解，本領域技術人 員可根據本發明公開的氨基酸序列，在不影響其活性的前提下，例如在非活性位點，取 代、缺失和/或增加一個或幾個氨基酸，得到由該蛋白衍生的蛋白。這些衍生的蛋白也 屬于本發明的范圍。本發明還包括編碼前述絲氨酸蛋白酶的基因。優選地，其核苷酸序列如SEQ ID Nal所示。此外，應當理解，與SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列具有較高同源性的核苷 酸序列也能編碼具有與上述絲氨酸蛋白酶具有同等活性的蛋白。例如，同源性在80%以上的核苷酸序列。因此，本發明基因還包括與SEQ ID Nal所示核苷酸序列同源性在80% 以上的編碼具有上述絲氨酸蛋白酶活性的核苷酸序列。具體地，本發明的目的可采用以下技術措施進一步實現1、江浙蝮蛇中絲氨酸蛋白酶的分離純化取江浙蝮蛇蛇毒凍干粉(來源于遼寧省清源縣)，用Tris-HCl緩沖液溶解，離心 取上清透析后，過DEAE-Sepharase陰離子交換柱，得到活性洗脫液；取少量的活性洗脫 液制作免疫親和層析柱，將經過陰離子交換層析后的活性組分通過該親和柱，即親和色 譜法純化，得到的活性組分，進一步經過高效液相色譜HPLC檢測，最終得到高純度的 絲氨酸蛋白酶。2、總 RNA 提取切下江浙蝮蛇的蛇頭，立即取出毒腺，與液氮中速凍，置于-70°C備用，采用酸 性硫氰酸胍-酚-氯仿一步法(參閱 Chomczynski P.等，Analytical Biochemistry. 1987， 162 156)抽提毒腺總RNA03、引物設計、合成的方法根據測定的絲氨酸蛋白酶成熟蛋白N端的氨基酸序列(VIGGDECNINEHRSL)， 設計了 上游寡核苷酸引物，即 5，-GTCATTGGAGGTGATGAATGTAACATA-3，； 根據其它蛇種絲氨酸蛋白酶氨基酸序列上的同源性(Serrano，M.T.S.，Hagiwara, Y.，Murayama, N.等，1998.Purification and characterization of a kinin-releasing and fibrinogen-clotting serine proteinase (KN-BJ) from the venom of Bothrops jararaca， and molecular cloning and sequence analysis of its cDNA.Eur.J.Biochem.251, 845-853.)在 3，端 的保守區段設計了下游寡核苷酸引物，即5，-TCACGGGGGGCATGTCA-3，。4、反轉錄、PCR擴增和基因克隆以江浙蝮蛇毒腺總RNA為模板，以5，-TCACGGGGGGCATGTCA-3，為引
物進行反轉錄，以得到的cDNA為模板，用上、下游引物進行PCR擴增，產物大小約 700bp。回收PCR產物，將回收的PCR產物插入pGEM-T easy載體，并轉入DH 5 α大
腸感受態細胞，經藍白斑篩選和酶切鑒定，獲得10個陽性克隆。對陽性克隆進行DNA測 序，得到本發明的江浙蝮蛇蛇毒中的絲氨酸蛋白酶編碼基因的DNA序列，其序列如SEQ IDNo.l所示，共702bp。使用DNAMAN軟件，根據這個蛇毒絲氨酸蛋白酶編碼基因的 DNA序列，得出該蛇毒絲氨酸蛋白酶的蛋白質的一級結構(氨基酸序列如SEQIDNo.2所 不，共 233aa)。實驗表明，本發明絲氨酸蛋白酶具有較高的精氨酸酯酶活性，可以用于制備各 種抗血栓藥物。進而，本發明還提上述絲氨酸蛋白酶、其編碼基因在制備抗血栓藥物中的 應用，尤其是腦血栓及心血管血栓，以及在制備治療血栓引起的疾病的藥物中的應用。本發明的優點在于由于蛇毒資源有限，其絲氨酸蛋白酶的活力及療效遠優于 其他來源的絲氨酸蛋白酶，本發明克隆得到絲氨酸蛋白酶基因并測定其基因序列，為開 發研制基因工程產品創造了良好的條件。


圖1為本發明絲氨酸蛋白酶cDNA的PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳圖。1 : PCR產物；2 陰性對照；3 DL 2000Marker。圖2為本發明絲氨酸蛋白酶純化譜峰，A DEAE-Sepharose離子交換色譜； B 親和色譜；C 高效液相(HPLC)色譜。圖3為本發明去糖基化修飾后絲氨酸蛋白酶的SDS-PAGE電泳圖。1:去糖基 化修飾后的絲氨酸蛋白酶；2:蛋白Marker。圖4為本發明MALDI-TOF-MS測得的絲氨酸蛋白酶分子量譜圖，峰值為 13125.4的峰為溶劑峰，峰值為26244.5的峰為目標蛋白峰。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。實施例1江浙蝮蛇蛇毒中的絲氨酸蛋白酶的編碼基因的獲得1、總 RNA 提取切下江浙蝮蛇的蛇頭，立即取出毒腺，于液氮中速凍，置于-70°C備用。取出 IOOmg毒腺組織，加Iml溶液D (含4M異硫氰酸胍，25mM檸檬酸鈉，pH7.0 ； 5%十二 烷基肌氨酸鈉(Sarcosyl)，Ο.ΙΜβ-巰基乙醇)，在組織勻漿器中充分勻漿后，將勻漿液 轉入IOml離心管中，再加入0.1ml 2M的乙酸鈉(pH4)，Iml的水飽和酚和0.2ml的氯仿 異戊醇(49 1)混合物，充分振蕩混勻后，在冰上靜置15min。樣品在日立冷凍離心機 (Hitach Centrifoge 20PR-52D)以IOOOOg于4°C離心20min，吸取上層水相，與等體積異丙 醇混勻，置_20°C冷凍至少1小時。以IOOOOg離心20min收集沉淀并溶于0.3ml溶液D， 加入0.03ml 2M乙酸鈉和0.3ml異丙醇，混勻，置于_20°C冷凍1小時。以IOOOOg離心 20min收集沉淀再溶于0.3ml焦炭酸二乙酯(DEPC)處理過的H2O,再加入0.03ml乙酸鈉 和0.75ml乙醇，混勻，置于_20°C冷凍1小時，以IOOOOg離心20min收集沉淀，用75% 洗滌RNA沉淀，自然干燥后將RNA溶于DEPC處理過的水中，分裝，置于_70°C備用。2、引物設計、合成的方法本發明根據測定的絲氨酸蛋白酶成熟蛋白N端的氨基酸序列，即 VIGGDECNINEHRSL,設計上游寡核苷酸引物為5，-GTCATTGGAGGTGATGAATG TAACATA-3’ ；根據其它蛇種絲氨酸蛋白酶氨基酸序列上的同源性(Serrano，M.T.S.， Hagiwara, Y.，Murayama, N.等，1998.Purification and characterization of a kinin-releasing and fibrinogen-clotting serine proteinase (KN-BJ) from the venom of Bothrops jararaca，and molecular cloning and sequence analysis of its cDNA.Eur.J.Biochem.251, 845-853.)在 3，端 的保守區段設計了下游寡核苷酸引物，即5’ -TCACGGGGGGCATGTCA-3，。弓丨物由 上海生工生物技術有限公司合成。3、反轉錄、PCR擴增和基因克隆以江浙蝮蛇毒腺總RNA為模板，5，-TCACGGGGGGCATGTCA-3，為引物進
行反轉錄。反轉錄試劑盒購自天根生物科技有限公司，操作按其說明書進行。以得到的cDNA為模板，用上、下游引物進行PCR擴增。反應的總體積為 30 μ 1,其中10XPCR緩沖液3μ1，dNTP的終濃度為0.2m M，Taq DNA聚合酶0.3 μ 1 (購 自Takara公司)。反應條件為95°C變性5min; 95°C變性30s，59°C退火40s，72°C延伸 30s,進行40個循環；最后72°C保溫lOmin。取8 μ 1反應產物經1 %瓊脂糖電泳檢測。PCR擴增出一條700bp左右的DNA片段，PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳見圖1。產物用 天根生化科技有限公司的膠回收試劑盒進行膠回收。將回收的PCR產物插入pGEM-T easy載體(質粒載體購自Promega公司)，連接 體系10 μ 1，其中PCR產物1 μ 1，pGEM-T easy載體0.5 μ 1，Τ4連接酶Ιμ ，2 X連接緩
沖液5μ1，(1(1Η20 2.5μ ，4°C過夜。將連接產物轉入DH 5 α大腸感受態細胞，經藍白 斑篩選和酶切鑒定，獲得10個陽性克隆。對陽性克隆進行DNA測序，得到本發明的江 浙蝮蛇蛇毒中的絲氨酸蛋白酶編碼基因的DNA序列。使用DNAMAN軟件，該蛇毒絲氨 酸蛋白酶編碼基因的DNA序列，得出該蛇毒絲氨酸蛋白酶的一級結構(氨基酸序列)。實施例2江浙蝮蛇蛇毒中的絲氨酸蛋白酶的分離純化及其生物活性測定1.絲氨酸蛋白的分離純化(I)DEAE-Sephar0se離子交換色譜稱取來源于遼寧省清源縣的江浙蝮蛇蛇毒 凍干粉15g，用0.02mol/L pH7.8的Tris-HCl緩沖液溶解，以4000r/min離心20min，取 上清，透析12h后，以6.0mL/min的流速上陰離子交換柱(DEAE-Sepharose)，上樣完畢 后以0.02mol/LpH7.8的Tris-HCl緩沖液洗去未吸附的雜蛋白。(2)親和色譜法①免疫抗體親和層析柱的制備取上述離子交換色譜活性洗 脫液，用高效液相色譜法純化，色譜條件為TSK2000凝膠層析柱，0.1mOl/LpH7.8磷 酸鹽為流動相，檢測波長為280nm，流速l.Oml/min，進樣量20 μ 1。經定性得到蛇毒絲
氨酸蛋白酶。取該蛇毒絲氨酸蛋白酶50g與等量的完全佐劑(制備方法將弗氏完全佐劑 IOml,羊毛脂1份，石蠟油5份，卡介苗IOmg 200mg混合后100°C IOmin滅活處理， 即得)混合乳化作為刺激物，對7周齡的BALB/c小鼠皮下注射免疫，每次0.2mL，每周 1次，共免疫6次。在采集血清前3d取0.2mL刺激物小鼠尾靜脈注射加強免疫。用抗原 親和層析柱純化抗體。用溴化氰活化4B-Sephar0Se瓊脂糖凝膠，把得到的蛇毒激肽原酶 抗體偶聯到多糖基質上，從而制成免疫親和層析柱。②親和色譜法純化蛇毒激肽原酶 將經離子交換純化的酶用平衡液透析，上抗體親和層析柱。用親和層析洗脫液(0.02mOl/ L Tris-HCl緩沖液，pH7.2，含0.5mol/L NaCl，70g/LArg溶液)洗脫。收集洗脫峰，冷 凍干燥保存。(3)純度檢測取主峰組分適當稀釋，用高效液相色譜(HPLC)法檢測。色譜 條件TSK-2000SW凝膠柱，280nlTl檢測，流速l.Oml/min，0.5mol/L磷酸鹽緩沖液 (PH7.0)為流動相，進樣量20μ1。最終得到高純度的絲氨酸蛋白酶。(見圖2)2.精氨酸酯酶活性的定量測定以BAEE為底物測定。測定方法在253nm波長處，以底物溶液為空白，準確 讀取1分鐘的吸光度Al和3分鐘的吸光度A3，Δ A值(Δ A = Α3-Α1)的平均值代入下 式計算
效價/mg=樣品溶液ΔA χ標準品溶液的單位數χ稀釋倍數
標準品溶液ΔΑ χ樣品量(mg)結果與粗毒(樣品溶液)相比，提純高的絲氨酸蛋白酶比活提高了約300倍，回收率可達60%以上，水解BAEE的比活可達到800單位/mg以上(表1)。
表1各提取過程中蛇毒類絲氨酸蛋白酶的水解BAEE比活變化
權利要求
1.一種蛇毒絲氨酸蛋白酶，其為1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列構成的蛋白；或2) SEQ ID No.2所示氨基酸序列經取代、缺失和/或添加一個或幾個氨基酸且同等功 能的由1)衍生的蛋白。
2.編碼權利要求1所述絲氨酸蛋白酶的基因。
3.如權利要求2所述的基因，其特征在于，其具有SEQID Nal所示的核苷酸序列， 或與SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列同源性在80%以上的核苷酸序列。
4.擴增權利要求3所述基因的引物，該引物的序列為上游引物5，-GTCATTGGAGGTGATGAATGTAACATA-3 ‘ 下游弓丨物5' -TCACGGGGGGCATGTCA-3‘。
5.權利要求1所述的絲氨酸蛋白酶、權利要求2和3所述基因在制備抗血栓藥物中的應用。
6.如權利要求5所述的應用，其特征在于，所述抗血栓藥物為抗腦血栓藥物或心血管 血栓藥物。
7.權利要求1所述的絲氨酸蛋白酶、權利要求2和3所述基因在制備治療血栓引起的 疾病的藥物中的應用。
8.含有權利要求1所述絲氨酸蛋白酶的抗血栓藥物。
全文摘要
本發明提供一種從蛇毒中分離得到的絲氨酸蛋白酶，測得該酶N端15個氨基酸的序列(VIGGDECNINEHRSL)，據此設計上游引物；然后根據與其它蛇毒絲氨酸蛋白酶3’端非編碼區同源性較高區域設計下游引物。從蛇毒毒腺中提取總RNA，通過PCR擴增出該絲氨酸蛋白酶的基因，克隆后經全序列測定表明該成熟蛋白的cDNA為702bp。本發明提供的江浙蝮蛇蛇毒中的絲氨酸蛋白酶與其粗毒相比，具有很高的活力，克隆得到該絲氨酸蛋白酶基因并測定其基因序列，為開發研制基因工程產品創造了良好的條件。
文檔編號A61K38/48GK102021160SQ20101054243
公開日2011年4月20日 申請日期2010年11月11日 優先權日2010年11月11日
發明者商穎, 宋夢薇, 張雅楠, 羅云波, 許文濤, 馬骉, 黃昆侖 申請人:中國農業大學, 北京賽生藥業有限公司