絲氨酸蛋白酶抑制物及其制備方法

專利名稱：絲氨酸蛋白酶抑制物及其制備方法
技術領域：
本發明屬生物技術領域，涉及絲氨酸蛋白酶抑制物的長效重組，且涉及其制備方法。
背景技術：
絲氨酸蛋白酶抑制物(TFPI)，分子量約40kd，前體有304個氨基酸，成熟蛋白則有276個氨基酸，后者由氨基末端、三個串聯的K皿itz型結構域和梭基末端組成，動物和人體實驗證實TFPI能有效治療嚴重感染、濃毒血癥、彌漫性血管內凝血(DIC)、多臟器功能衰竭(MOF)、高凝狀態、血栓栓塞性疾病和腫瘤等具有良好療效，是一種具有良好應用前景的蛋白質。大多數TFPI由血管內皮細胞合成和分泌，平滑肌細胞、心肌細胞和纖維母細胞在一定條件下也可產生TFPI 。無論是人體自身的TFPI，還是給予的重組野生型TFPI，它的半衰期都很短，只有2分鐘左右，會很快從血液中清除。TFPI進入血液循環后，迅速與肝細胞膜上的LRP結合，然后被降解和代謝。半衰期短是TFPI在發揮治療作用時最大的缺點，必須連續72 — 96小時給藥才能保持療效，每個療程約需160 —犯omg，如此大的劑量給病人帶來了巨大的經濟負擔。因此，延長TFPI的半衰期，減少其用藥量，是急需解決的問題。

發明內容
本發明的目的是提供半衰期長，具有良好抗凝功能的絲氨酸蛋白酶抑制物。
為實現上述目的，本發明采用的技術方案為，本發明首先在計算機工作站上模建了 TFPI和LRP分子，然后將兩者進行對接，發現TFPI梭基末端的某些關鍵氨基酸在TFPI和LRP的相互作用發揮關鍵作用。本發明將TFPI梭基末端267 — 304區域內的某些氨基酸進行不同程度的替代和缺失突變后，兩者的結合能力出現了不同程度的下降，所述LTFPI的半衰期較TFPI延長10倍以上，并具備抗組織因子、凝血因子V工工/Vila和凝血因子X/Xa功能。其中將269、252、288和289位賴氨酸全部替換為丙氨酸的突變效果為佳。
本發明還提供了制備LTFPI的方法，包括制備至少包含表達生物活性的LTFPI編碼序列部分的cDNA，在適合表達的載體中克隆CDNA片斷，用該載體轉染宿主細胞，在適于表達該cDNA片斷的條件下培養該宿主細胞，以及從培養物中回收和純化所需LTFPI。
本發明中LTFPI基因的制備包括經過點突變后的基因，與相關質粒重組，DNA限制性內切酶酶切鑒定篩選陽性克隆，核普酸序列分析驗證基因是否正確。將本發明的LTFPICDNA片斷與表達載體重組，形成重組表達質粒。本發明不限于特定的表達質粒，包括真核表達載體pP工CgK或原核表達載體pET28或pLY — 4。 本發明使用pET28原核表達載體，上述重組表達載體可按常規方法導入適宜宿主細胞，包括原核表達宿主細胞是BLZI或JF1125和真核表達宿主細胞GS115。本發明使用大腸桿菌BLZI作為特定的宿主細胞，本發明的表達產物以包涵體形式存在于宿主細胞的胞體中，破菌分離包涵體，高濃度尿素或鹽酸肌溶解包涵體，分離純化LTFPI，經適當復性后即獲得有活性的LTFP。
以上技術方案中所有基本分子生物學操作均參照〈分子克隆實驗指南>。
本發明的有益效果 本發明應用基因工程方法對LTFPI進行生產，所得產品具有高效的抗凝、抗血小板和抗炎功能，與野生TFPI性質比較表明，LTFPI半衰期明顯延長，其余功能類似。LT即工為注射劑和非注射劑研究提供了原料，可用于預防和治療嚴重感染性疾病和血栓栓塞性疾病等。
具體實施方式
實施例l (1) TFPI和LRP在計算機工作站上的對接與分析 應用InsightH軟件，在計算機工作站上對TFPI和L即進行對接，尋找到了 TFP工梭基末端269、282、288和289位賴氨酸是兩者相互作用的關鍵位點。
(2)LTFPI的設計、制備和性質鑒定將TFPI梭基末端269、282、288和289位賴氨酸替換為丙氨酸。序列使用PCR點
突變獲得基因，與PUC19重組，酶解篩選陽性克隆，核普酸序列分析證實基因序列正確。然
后將LTFP工基因切出，與原核表達載體pET28重組，構成原核表達質粒rLTFP工一 pET28。
轉化大腸桿菌JM109，提取質粒，以相應限制性內切酶酶解鑒定，獲得特征性片斷，證實獲得
陽性克隆。 實施例2 LTFP工基因獲取方法如下 (1)采用重疊延伸法，選用pET28多克隆位點Notl后400bp的一段序列設計下游引物5'〉CCA CTA CGT GAA CCA TCA CCC TAA TCA AGT〈3'重疊延伸引物1 :其中斜體密碼從左到右依次為K254A，K241A。 5'> 口尤AAT TAG GCC TCC TTI'TGA '隊T TCT TTG GATGAA ACC '況，TTT ACATGC CCT CAG ACA〈3'重疊延伸引物2 :斜體密碼從左到右依次為K254A，K260A，K261A。 5， >AAA GGA GGC CTA ATT優谷ACC AAA AGA AAA AGA隴谷優若CAGAGA GTG AAA ATA GCA TAT〈3'以質粒pET28 — TFPI為模板，上游引物與重疊延伸引物1配對，下游引物與重疊延伸引物2配對，分別pCR，回收產物后用作中間體，加上游引物和下游引物做PCR， Ncol+Notl雙酶切PCR產物，即得K241A， K254A， K260A， K261A突變的LTFPIO限制性內切酶購自BRL公司，大腸桿菌JM109、質粒puC19Invitrogen公司。pLy4的構建按已知方法進行。 (2)篩選高拷貝高效表達菌株 將質粒rLTFP I — pLy4電轉化大腸桿菌BL21，使其與大腸桿菌染色體發生重組，
G418篩選高效表達菌株。 宿主菌大腸桿菌BL21 培養液LBK Kan工作濃度30ug/ml IPTG工作濃度lmM ①挑單克隆菌落接種至5ml LBK medium, 37oC X 250rpm至0D600 = 1 — 2。②接種至500ml LBK medium, 37°C x250rpm至0D6Qo = 1 — 2。
②接種至25L LBK medium，37。Cx 600rpm，溶氧50% ，至0D6的=0. 6 — 0. 5。
加IM IPTG至終濃度I lnM，誘導表達3h。
③4。C x4000rpmx35min，收集菌體。
50mM Tri 5. HCI pHS. 0洗滌菌體1次，收集菌體，稱重。 ⑤挑取上述陽性克隆接種于IOml低營養液BMG巨.34% YNB， (4x10 — 5)生物 素，1%甘油習中，30°。決速振遙(250RPM)，培養過夜。次日測定光密度0，離心棄除BMG培 液，用無菌水洗滌后用B匪培液巨.34% YNB， (4x10 — 5)生物素，O. 5%甲醇習稀釋至0D6 訓=1。每天補加體積百分數為0. 5%的甲醇。甲醇誘導培養7天，每隔24小時取樣lml， 測定抗TF/Fvlla(rhTFPI — API)或抗Fxa(rhTFPI — APZ)活性。離心棄沉淀，上清于一 2(TC保存。直接取培液上清與Zx上樣緩沖液等體積混合后取20ul上樣，作還原性SDS — 以GE電泳。考馬斯亮藍R — 250染色后，Pharmacia工magenastervDs掃描定純度、分子 量。可見誘導后上清液在分子量約6kd處有一濃集的條帶，經掃描，目的蛋白約占上清總蛋 白的84% :結果表明表達產物rhTFPI — API有明顯的抗TF/FVlla作用，rhTFPI — APZ有 明顯的抗FXa作用。上述還原性SDS — PA(況按Lael' nlnli方法進行。
(3)發酵表達工程菌 按上述篩選高表達菌株作為工程菌，然后以5L發酵罐進行高密度發酵。從一7(TC 深低溫冰箱中取出種子菌，室溫下解凍，在種子菌培養室IOO級潔凈度條件下劃YPD平板， 3(TC溫箱培養2 — 3天。從平板上挑取單菌落，同樣在100級潔凈度條件下接種于IOml BMG 培養液中，3(TC培養過夜，此為一級種子液。再將一級種子液加入140ml培養液中，3(TC培 養6 — 8小時，直至0D6。。 =6，此為二級種子液。種子菌接入后，自然增值，待基礎培養基 中預加的甘油被耗盡以后，開始補充甘油，補充速度16ml/L/h，待0D60。達到120左右，停 止補加甘油。待培養液中甘油全部耗盡后，開始甲醇誘導。甲醇補料速度從lml/L/h逐漸 升高至12ml/L/h，以后一直維持此速度。本發明的發酵技術是用低鹽培養基擴增工程菌，誘 導前用含微量元素的甘油溶液進行補料，到達一定菌體濃度后用含微量元素的甲醇溶液進 行誘導表達。 甲醇誘導40h以后，停止發酵，從發酵罐中立即放出菌液進行離心，分離沉淀菌 體，收集上清進行純化。上清中rhTFPI — API對TF/FVlla的抑制常數達Ki = 0. 12uM， rhTFP工一 APZ對FXa的抑制常數達Ki = 0. 09uM。發酵參數為溫度30°C ，氧容量控制在 35±5%，pH = 5，攪拌速度與D0連動。
(4)超濾濃縮脫鹽將離心所獲上清以l : 10稀釋，經Mi llipore超濾裝置(NMWL :3000，Millipore 公司)超濾濃縮至1. OL，脫去無機鹽。
(5)凝膠過濾 S印hadexG — 50 (Pharmacia公司)柱用20nunol/L PB (pH7. 4)平衡后，將超濾濃 縮液上樣，加樣時注意勿攪動S印hadexG — 50膠面。然后用PB洗脫，流速10ml/min，收集 活性峰。 (6)Q — S印harose Fast Flow柱層析 以1(H咅體積的50mmol/L PB(pH 7. 4)平衡Q — S印harose F. F. (Pharmacia公司) 柱，凝膠過濾后收集的抗凝活力部分以SOml/min的速率將其吸附到Q — S印harose F. F.柱上。用PB洗柱直至0DZ、《)達O. OO，然后用0 — lmol/L NaCI (50Inlnol/L PB PH 7.4)線性梯度洗脫，收集有抗凝活性部分，分裝，冷凍干燥，一 4(TC保存。
本發明的色譜操作均為常規操作。
(7)純度鑒定及分子量測定 樣品進行16. 5% SDS —PAGE電泳，考馬斯亮藍R — 250染色后，Pharmacia工nagemaster⑧VDS掃描測定純度、分子量。所得產品純度97%以上，分子量約6kD。
(8)抗TF/FVlla活性測定使用稀釋后的凝血酶原時間(d 1 1 utedprothrombintime， dPT)測定，方法如下。 將凝血活酶干粉試劑加ZmL生理鹽水稀釋至終濃度5000U/L，此為凝血活酶原液，再用生理鹽水分別稀釋10、 100和500倍，置37t:備用。取100pL正常人混合血漿，加10pL蛋白溶液，分別加100協L不同濃度的凝血活酶溶液，37t:孵育lmin，加100p L 30Inlno1/L Cacl2溶液，開始計時血漿凝固時間。反應體系中TFP11 — 276和TFP11 — 161終濃度均為0. 2p mol/L，取3次實驗平均值記為實驗結果，所有試劑均需37t:預熱，全部操作2h內完成。結果表明LTFP工使dPT明顯延長。
(9)抗FXa測定應用發色低物發測定，方法如下 采正常人全血，109mM構椽酸鈉1 : 9抗凝，4。C離心15min， 4000r/min，等體積混合30份正常人新鮮血槳，56t:孵育巧min，置37。C備用，此為參照血槳。每毫升此參照血槳中的TFPI定義為1個活性單位(1U)。 將野生型TFPI和LTFpl分別溶于TS(20mM TriS/HCI pH 7. 8+150InM NaCI)96孔板，每孔加100pL待測定溶液，再加100pL反應液(100ng/mL FXa+0. 2% BSA)，室溫孵育30min，加發色底物SpeCtrozymeXa至終濃度0. 25InM，測0D10 :。結果表明LTFPI的抗Xa活性與野生型TFPI類似。
權利要求
絲氨酸蛋白酶抑制物，其特征在于，首先在計算機工作站上模建了TFPI和LRP分子，然后將兩者進行對接，發現TFPI梭基末端的某些關鍵氨基酸在TFPI和LRP的相互作用發揮關鍵作用。本發明將TFPI梭基末端267一304區域內的某些氨基酸進行不同程度的替代和缺失突變后，兩者的結合能力出現了不同程度的下降，所述LTFPI的半衰期較TFPI延長10倍以上，并具備抗組織因子、凝血因子V工工/Vlla和凝血因子X/Xa功能。其中將269、252、288和289位賴氨酸全部替換為丙氨酸的突變效果為佳。
2. 絲氨酸蛋白酶抑制物的制備方法，其特征在于，包括制備至少包含表達生物活性 的LTFPI編碼序列部分的cDNA，在適合表達的載體中克隆CDNA片斷，用該載體轉染宿主 細胞，在適于表達該cDNA片斷的條件下培養該宿主細胞，以及從培養物中回收和純化所需 LTFPI。
全文摘要
絲氨酸蛋白酶抑制物及其制備方法屬生物技術領域，涉及絲氨酸蛋白酶抑制物的長效重組，且涉及其制備方法。本發明是提供半衰期長，具有良好抗凝功能的絲氨酸蛋白酶抑制物。本發明首先在計算機工作站上模建了TFPI和LRP分子，然后將兩者進行對接，將TFPI梭基末端267—304區域內的某些氨基酸進行不同程度的替代和缺失突變后，所述LTFPI的半衰期較TFPI延長10倍以上，并具備抗組織因子、凝血因子V工工/Vlla和凝血因子X/Xa功能。本發明還提供了制備LTFPI的方法，包括制備至少包含表達生物活性的LTFPI編碼序列部分的cDNA，在適合表達的載體中克隆CDNA片斷，用該載體轉染宿主細胞，在適于表達該cDNA片斷的條件下培養該宿主細胞，以及從培養物中回收和純化所需LTFPI。
文檔編號C12N15/63GK101747431SQ20081022959
公開日2010年6月23日 申請日期2008年12月11日 優先權日2008年12月11日
發明者肖懿 申請人:肖懿