來自冬蟲夏草的絲氨酸蛋白酶、編碼基因及其應用的制作方法

來自冬蟲夏草的絲氨酸蛋白酶、編碼基因及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種來自冬蟲夏草中國被毛孢參與水解大分子蛋白質生成小分子蛋白質的絲氨酸蛋白酶、編碼基因及其應用。所述絲氨酸蛋白酶氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示，編碼基因如SEQ?ID?No.1所示。本發明從原理上對絲氨酸蛋白酶在中國被毛孢侵染蝙蝠蛾幼蟲的過程進行了詳細研究，提供了“百令”生產菌冬蟲夏草中國被毛孢參與侵染機制機理的絲氨酸蛋白酶及其編碼基因，本發明所提供的核苷酸序列的克隆DNA可以用來通過轉導、轉化、結合轉移的方法轉入工程菌中，通過調節蛋白水解酶基因的表達，賦予宿主絲氨酸蛋白酶的高表達性，為擴大絲氨酸蛋白酶的生物應用提供了有效途徑，具有重大應用前景。
【專利說明】來自冬蟲夏草的絲氨酸蛋白酶、編碼基因及其應用
(—)

【技術領域】
[0001]本發明涉及來自“百令”生產菌冬蟲夏草中國被毛孢的絲氨酸蛋白酶、編碼基因及其應用。
(二)

【背景技術】
[0002]冬蟲夏草(Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc.)是冬蟲夏草菌寄生在鱗翅目(Lepidoptera)蝙蝠蛾科昆蟲(Hepialus armoricanus Oberthur)幼蟲上的子座及幼蟲尸體上的復合體(包括子座和蟲體)。冬蟲夏草是一類珍惜的傳統真菌藥材資源，具有代謝產物和生物活性多樣的特點，在生物醫藥領域展現出巨大的應用和發展前景。冬蟲夏草以其多種藥用功效廣泛、明顯而備受關注，在世界范圍內備受推崇。中醫認為，冬蟲夏草入肺腎二經，既能補肺陰，又能補腎陽，主治腎虛，陽痿遺精，腰膝酸痛，病后虛弱，久咳虛弱，勞咳痰血，自汗盜汗等，是唯一的一種能同時平衡、調節陰陽的中藥。現代藥理學已證實，冬蟲夏草具有免疫調節、抗菌、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖血脂、性激素樣作用等廣泛的生物活性。
[0003]冬蟲夏草菌是一種子囊菌，在其生活史中具有分生孢子階段(無性型)和子囊孢子階段(有性型)。而在人工培養、液體發酵等實際生產中使用的是無性階段的冬蟲夏草菌，因而冬蟲夏草無性型的鑒定非常重要。國內外學者在冬蟲夏草資源調查、無性型確證、活性成分分離分析和作用機理、開發應用方面做了大量工作。冬蟲夏草中國被毛孢已被證明是冬蟲夏草的無性型存在形式，具有與天然冬蟲夏草相同的活性成分和藥效。
[0004]但是，對冬蟲夏草中國被毛孢機制機理的研究幾乎為空白，尤其在中國被毛孢侵染蝙蝠蛾幼蟲的機制機理上，以及對絲氨酸蛋白酶在中國被毛孢侵染機制中的作用的研究。
[0005]絲氨酸蛋白酶廣泛存在于動物、植物、細菌、病毒、真菌中，并且參與生命的各種反應，比如蛋白質翻譯后后加工、細胞分裂、病原體感染、組織降解、細胞凋亡等，可見絲氨酸蛋白酶具有廣泛的研究和應用價值。
[0006]絲氨酸蛋白酶是一類以絲氨酸為活性中心的重要的蛋白水解酶，在生物有機體中起著重要而廣泛的生理作用，還在胚胎發育、組織重建、細胞分化、血管形成和病原侵入等過程中都發揮著重要的作用。絲氨酸蛋白酶超家族的成員多而廣，它們的活性部位都含Ser> His、Asp,并具有相同的催化機制,但是它們與底物結合部位的差異決定了各自對底物的專一性。
[0007]絲氨酸蛋白酶在結構上為全β蛋白，核心結構由兩個非常相似的結構域(N結構域和C結構域)構成。由于兩個結構域在結構上存在著差異，它們在功能和進化上的作用也就不同。
[0008]1986年，Gershenfeld HK等人在《Science》上發表論文,他們通過RNA雜交競爭協議從小鼠的細胞毒性T淋巴細胞互補DNA文庫中分離出的克隆可以編碼一個新的絲氨酸蛋白酶，并且對它進行了克隆，該基因的堿基序列編碼約為25700道爾頓的氨基酸序列，25%至35%屬于絲氨酸蛋白酶家族，保守的活性位點殘基為His57，Aspl02和Serl95的胰凝乳蛋白酶。Southern雜交分析表明，這個基因在人類，小鼠和雞種保守。此絲氨酸蛋白酶可能在淋巴細胞的裂解和溶解級聯有作用。
[0009]1999年,Kyoko Yamashiroa等人從人結腸腺癌細胞中克隆到了一個新的絲氨酸蛋白酶，該序列包括155bp的5’非編碼區和一個位于551bp的3’非編碼區后的732bp長的開放閱讀框非編碼區，預測的蛋白由244個氨基酸組成，和絲氨酸蛋白酶家族的其他成員顯示一定的相似性，和發現的其他類似胰蛋白酶一樣，這種酶含有作為必要的氨基酸殘基的活性的催化三聯體。
[0010]2003年，李文輝等人利用逆轉錄酶與聚合酶鏈反應相結合的RT-PCR法，擴增出5個竹葉青(Trimeresurus stejnegeri)蛇毒絲氨酸蛋白酶的cDNAs,將擴增的cDNA片段克隆入pGEM-T載體中，再經末端終止法測定核苷酸序列，推導出5個絲氨酸蛋白酶的全序列。5個絲氨酸蛋白酶分別含有1-6個N-型糖基結合位點，表明它們的計算分子量與純化蛋白表觀分子量之間的差異是由糖含量的不同造成，而其氨基酸序列相似度在60% -90%。
[0011]2004年，儲衛華等人根據已發表的氣單胞菌胞外蛋白酶基因核苷酸序列，設計和合成了一對引物，以嗜水氣單胞菌AhJ-1的基因組DNA為模板，通過PCR技術，擴增到約900bp的絲氨酸蛋白酶基因片段，并克隆到質粒載體pGEM-T中進行測序和分析，結果表明擴增的絲氨酸蛋白酶基因片段與已發表的嗜水氣單胞菌絲氨酸蛋白酶Ahe2的同源性有87%，擴增片段編碼343個氨基酸，推測的分子量為35700，計算機軟件分析表明編碼的氨基酸有較高的抗原性，可作為核酸疫苗的侯選基因片段。
[0012]2005年，李江等人從一株具有極強的降解羽毛能力的弗氏鏈霉菌菌株(Streptomyces fradiae var.kll)中純化得到了一種絲氨酸蛋白酶SFP2。經蛋白測序,得到部分氨基酸序列，設計簡并引物，PCR擴增得到部分基因序列，通過構建基因文庫，獲得了包括信號肽序列在內的完整的基因sfp2 (EMBL收錄號AJ784940)，開放閱讀框全長924bp，包括114bp的信號肽編碼序列和810bp的酶原編碼序列，其中成熟蛋白編碼基因長576bp，編碼191個氨基酸，理論分子量為19.112kD。酶原編碼基因和成熟蛋白編碼基因均在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中得到了表達，酶原編碼基因表達產物具有正常的生物學活性，證明了克隆基因的生物學功能。
[0013]2008年，雷迎峰等人在大腸桿菌中進行了 HCVNS3/4A絲氨酸蛋白酶的表達并進行純化。根據NS3與NS4A兩者形成異源二聚體的結構要求，通過基因拼接的方法設計了單鏈NS3/4A絲氨酸蛋白酶的基因。合成相應引物，利用反轉錄PCR從HCV患者血液中擴增出該蛋白酶的編碼基因，克隆入原核表達載體pRSET-A，將重組表達質粒pRSET-A-ns3/4a轉化BL21 (DE3)大腸桿菌，并誘導表達與純化。成功地構建了重組表達質粒pRSET-A-ns3/4a，重組質粒轉化的BL21工程菌經IPTG誘導表達后，表達產物經SDS-PAGE和Western_blot證實為NS3/4A絲氨酸蛋白酶，并用鎳離子親和層析方法獲得純化蛋白酶。獲得的純化NS3/4A絲氨酸蛋白酶為建立其酶活性測定系統奠定了基礎。
[0014]2011年，王俊偉等人根據已經報道的少孢節叢孢菌絲氨酸蛋白酶基因序列，設計特異性引物，通過PCR技術對少孢節叢孢菌新疆分離株(XJ-XA)絲氨酸蛋白酶(命名為Aozl)基因序列進行了擴增，并與國內外少孢節叢孢菌不同地域分離株相應序列進行了同源性分析，構建該基因系統進化樹。結果顯示，XJ-XA Aozl基因全長為1344bp，包含2個外顯子和I個63bp的內含子(第517~579位核苷酸)，編碼426個氨基酸。系統發生分析發現，少孢節叢孢菌不同地域分離株Aozl基因序列具有較高的親緣性，與其他捕食線蟲性真菌Aozl基因親緣性較遠。此項研究為研發家畜線蟲病生物防控制劑奠定了前期基礎。
[0015]2012年，劉海明等人利用粉紋夜蛾Trichoplusia ni圍食膜蛋白多克隆抗體篩選華北大黑觸金龜Holotrichia oblita中腸cDNA表達文庫,首次得到編碼華北大黑觸金龜絲氨酸蛋白酶cDNA序列，命名為HoSPl (GenBank登錄號為FJ573146)。序列分析表明，該基因長902bp，開放閱讀框(ORF)長783bp，編碼260個氨基酸，推測分子量和pi值分別為26.7kDa和4.19，不含有N-糖基化位點，但在Thrl57處有一個O-糖基化位點，含有6個保守的半胱氨酸殘基，組成3對二硫鍵，對于維持蛋白質的三級結構起著重要的作用。通過與幾種絲氨酸蛋白酶的比對發現，該酶具有組氨酸(His)、天冬氨酸(Asp)、絲氨酸(Ser)催化中心,與褐新西蘭肋翅觸金龜Costelytra zealandica的14種絲氨酸蛋白酶有明顯的相似性，其中與CzSP3的序列一致性最高，為52.47%。把該基因與pET21b載體重組后，進行體外表達，以BTEE為底物，測得該酶的活力為0.0378 μ mol/mg.min。
[0016]2010年，Xiaoqing Zhang等人從食用菌真姬燕的新鮮子實體中分離到了一個28kDa的絲氨酸蛋白酶。根據N-末端測序序列，結合使用RACE和TAIL-PCR方法，成功克隆到了這個絲氨酸蛋白酶了基因。這個蛋白酶的序列含有19個氨基酸的信號肽序列，一個82個氨基酸的前區序列，誘導后的蛋白酶具有285個氨基酸和28.07kDa的分子量，并且擁有枯草桿菌蛋白酶家族(S8A)的三個活性位點特征。
[0017]2013年,Ying Huang等人從中華絨螯蟹中克隆到了一個域為特征的發夾狀絲氨酸蛋白酶，并且對它進行了特性研究。
[0018]但是，目前NCBI數據庫中目前還檢索不到中國被毛孢中絲氨酸蛋白酶的基因相關信息。
(三)


【發明內容】

[0019]本發明目的是針對以上存在的不足和需要解決的技術問題，對“百令”生產菌冬蟲夏草中國被毛孢侵染機制中的酶及其編碼基因進行深入研究，提供了“百令”生產菌冬蟲夏草中國被毛孢侵染機制的一種絲氨酸蛋白酶、編碼基因及其應用。
[0020]本發明采用的技術方案是:
[0021]來自冬蟲夏草中國被毛孢參與水解大分子蛋白質生成小分子蛋白質的絲氨酸蛋白酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示(記為serA蛋白)。該酶可催化斷裂大分子蛋白質中的肽鍵，使之成為小分子蛋白質。
[0022]SEQ ID N0.1 序列如下:PDLSPATVKI TNDDSPNKME NSffLLVffKNALADDAIKARRDDFAATLRKR NLGKRDVNGN TIPMEAIHYD IGSLRMTVCNADAKTMNLMV SNAIDAVDYVEANEffIDMFR TENETEAPPA VNATAVADGAEASPGEDGEG TVVYIVDTGI NVNHVAFEDR ATMIANLVRGESEQDLNGHGTHCAGSAAGK EIGVATKALI RGVKVLNAKG SGG⑶SIIGG FRAACNDVKKNGFEGKCVVSMSLGTGRSNA INNAAKQMGQ CGCAIWAAG NDGKDASTVSPASSDDVITV GATDARTNQL AAFSNTGPLVDISTNGVNVI SADANDITGTKELTGTSMSA PQIAGIALVA LNDVDLDCTI DCTDRMRDFLQKKAQQEKPIAISS⑶SDTT PLQIDATDKA PTDPDGPTPI SKKGQQGKQG KKQTGQKGR*
[0023]由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID N0.1所示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其變體，如其保守性變體、生物活性片段或衍生物，只要該肽蛋白的片段或肽蛋白變體與前述氨基酸序列同源性在90%以上，均屬于本發明保護范圍之列。具體的所述改變可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替換；其中，對于變體的保守性改變，所替換的氨基酸具有與原氨基酸相似的結構或化學性質，如用亮氨酸替換異亮氨酸，變體也可具有非保守性改變，如用色氨酸替換甘氨酸。
[0024]本發明還涉及所述的絲氨酸蛋白酶在生物催化水解大分子蛋白質制備小分子蛋白質中的應用，優選所述絲氨酸蛋白酶能夠斷裂大分子蛋白質中的肽鍵，使之成為小分子蛋白質。由于昆蟲幼蟲的表皮主要由蛋白質和幾丁質組成，蟲生真菌在侵染昆蟲幼蟲的時候會分泌絲氨酸蛋白酶來降解蟲體表皮的蛋白質，從而增加蟲生真菌侵染力，可應用于生物防治害蟲。所述的應用為:將含絲氨酸蛋白酶基因的重組工程菌經誘導培養獲得的濕菌體用磷酸鹽緩沖液(50mM、pH8.0)懸浮，超聲細胞破碎后，取破碎混合液離心，取上清液作為催化劑，以10.00mg/mL酪素溶液為底物，40°C下水浴反應，反應結束后,將反應液離心，取上清液即獲得含酪氨酸的混合液，將混合液分離純化，獲得酪氨酸，所述分離純化的方法為本領域公知，通常采用親和層析的方法；所述10.00mg/mL酪素溶液按如下步驟制備:取1.0OOg酪素用0.5mol/L的氫氧化鈉水溶液潤濕，加入pH值為8.0的PBS緩沖液，在沸水浴中邊加熱邊攪拌，直至完全溶解，冷卻后，轉入10ml容量瓶中，用緩沖液稀釋至刻度；所述氫氧化鈉水溶液的體積用量以酪素質量計為5ml/g。
[0025]所述底物的用量以酪素質量計，所述酪素的初始濃度為5mg/mL (終濃度)，所述催化劑的體積用量以破碎前濕菌體的質量計為20g/L(終濃度)。
[0026]所述催化劑按如下方法制備:將含絲氨酸蛋白酶基因的重組工程菌接種于含終濃度50 μ g/ml的Kan抗性的LB液體培養基中，37°C、250r/min培養過夜，取ImL培養物，將其轉接(體積接種量2% )于50mL含有50 μ g/ml Kan抗性的LB液體培養基中，37°C、250r/min培養至菌體濃度0D600為0.6~0.8，向培養物中加入終濃度0.05mmol/L的IPTG誘導培養8h，收集濕菌體，將濕菌體在功率40%、破Is停Is條件下超聲破碎(優選3次，每次5min)，取破碎混合液離心，取上清液即為催化劑。
[0027]本發明還涉及編碼所述絲氨酸蛋白酶的基因。具體的，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所不(記為serA基因，serA基因編碼serA蛋白)。
[0028]由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ ID N0.2所示多核苷酸的變體，只要其與該多核苷酸具有90%以上同源性，均屬于本發明保護范圍之列。所述多核苷酸的變體是指一種具有一個或多個核苷酸改變的多核苷酸序列。此多核苷酸的變體可以使生的變位變異體或非生的變異體，包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個多核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質上改變其編碼的肽蛋白的功能。
[0029]所述的絲氨酸蛋白酶編碼基因在構建能夠生物催化水解大分子蛋白質制備小分子蛋白質的基因工程菌中的應用。所述的基因可用于構建能夠生物催化斷裂大分子蛋白質中的肽鍵，使之成為小分子蛋白質的基因工程菌，以擴大絲氨酸蛋白酶的應用。所述催化水解優選在40°C下進行。具體為:構建含有所述絲氨酸蛋白酶基因的重組載體，將所述重組載體轉化至大腸桿菌(優選E.coli BL2KDE3))中，獲得的重組基因工程菌進行誘導培養，培養液分離純化獲得含有絲氨酸蛋白酶基因的菌體細胞。
[0030]本發明的要點在于提供了 SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列和SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列，在已知該氨基酸序列和核苷酸序列的情況下，該氨基酸序列和核苷酸序列的獲得，以及相關載體、宿主細胞的獲得，對于本領域技術人員來說均是顯而易見的。
[0031]能夠提供本發明所述冬蟲夏草絲氨酸蛋白酶及其編碼基因的菌株為中國被毛孢(Hirsutella sinensis) L0106,該菌種保藏在中國典型培養物保藏中心,保藏編號為CCTCCNo:M2011278,已在先前申請的專利CN102373190A中披露。
[0032]本發明的有益效果主要體現在:本發明從原理上對絲氨酸蛋白酶在中國被毛孢侵染蝙蝠蛾幼蟲的過程進行了詳細研究，提供了“百令”生產菌冬蟲夏草中國被毛孢參與侵染機制機理的絲氨酸蛋白酶及其編碼基因，本發明所提供的核苷酸序列的克隆DNA可以用來通過轉導、轉化、結合轉移的方法轉入工程菌中，通過調節蛋白水解酶基因的表達，賦予宿主絲氨酸蛋白酶的高表達性，為擴大絲氨酸蛋白酶的生物應用提供了有效途徑，具有重大應用前景。
(四)

【專利附圖】

【附圖說明】
[0033]圖1為“百令”生產菌冬蟲夏草中國被毛孢總RNA的甲醛變性凝膠電泳圖；
[0034]圖2為中國被毛孢侵染蝙蝠蛾幼蟲機制和過程注釋圖；
[0035]圖3為絲氨酸蛋白酶基因PCR擴增產物凝膠電泳圖；
[0036]圖4為克隆載體pMD18-T Vector與表達載體pET_28a物理圖譜；
[0037]圖5為重組克隆質粒pMD18_T/serA物理圖譜；
[0038]圖6為重組表達質粒pET_28a/serA構建過程示意圖；
[0039]圖7為重組表達質粒pET_28a/serA物理圖譜；
[0040]圖8為絲氨酸蛋白酶蛋白的SDS-PAGE圖。
(五)

【具體實施方式】
[0041]下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于此:
[0042]實施例1 百令”生產菌冬蟲夏草中國被毛孢的培養
[0043]菌株來源:首先從青海采集天然冬蟲夏草，并將其帶回杭州進行分離篩選，得到了 L0106菌株，并經菌種鑒定該菌株為中國被毛孢(Hirsutella sinensis),該菌種保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC No:M2011278,已在先前申請的專利CN102373190A 中披露。
[0044]將該菌種接種于斜面，培養基配方(此為固化之前的液體配方，按下述比例配制好之后再制成斜面)為:葡萄糖2.0% (w/v，l%表示10mL培養基中含有lg，下同)、玉米粉
1.0%、土豆汁0.5%、糊精0.5%、酵母粉0.5%、麩皮1.0%、蠶蛹粉2.0%、蛋白胨1.0%、硫酸鎂0.05%、磷酸二氫鉀0.05%、瓊脂粉1.0%，余量為水；在12~16°C培養25天；然后將菌種接種于發酵培養基，培養基配方為葡萄糖1.0 %、糖蜜1.0 %、蠶蛹粉0.5 %、黃豆餅粉1.0%、酵母膏0.5%、硫酸鎂0.01 %、磷酸二氫鉀0.02%，余量為水；置于搖床上，溫度12~16°C培養25天，培養結束后在無菌條件下，進行固液分離，并將固體置于無菌器具，備用。
[0045]實施例2 百令”生產菌冬蟲夏草中國被毛孢總RNA的提取
[0046]用TRIzol試劑提取總RNA，步驟具體為:
[0047]I)液氮研磨:取Ig新鮮菌體放入研缽中，反復加入液氮充分研磨至粉末狀，分裝到預冷的1.5mL離心管中，加入ImL TRIzol試劑，混勻，冰上靜置5min，使核酸蛋白復合物完全分離。
[0048]2) RNA分離:加入0.2mL氯仿，用力震蕩混勻15s，冰上靜置2~3min，4 V、12000rpm離心15min,分層,取上層水相,約600 μ L。
[0049]3) RNA沉淀:加入500 μ L異丙醇，在冰上靜置lOmin，4°C、12000rpm離心10min，棄上清。
[0050]4) RNA洗滌:加入lmL75% (v/v)乙醇，將沉淀懸起，冰上靜置lOmin，4°C、7500rpm離心15min ;重復上面洗漆步驟,再洗一遍。
[0051]5)溶解RNA:將離心管置于冰上敞開干燥5~lOmin，加適量DEPC水溶解。
[0052]實施例3 百令”生產菌冬蟲夏草中國被毛孢RNA樣品測序
[0053]提取樣品總RNA后，用帶有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA。加入fragmentat1nbuffer將mRNA打斷成短片段(200~700bp)，以mRNA為模板，用六堿基隨機引物(randomhexamers)合成第一條cDNA鏈,然后合成第二條cDNA鏈,再經過QiaQuick PCR試劑盒純化并加EB緩沖液洗脫之后做末端修復、加polyA并連接測序接頭，然后用瓊脂糖凝膠電泳進行片段大小選擇，最后進行PCR擴增，建好的測序文庫用Illumina GA IIx進行測序。測序得到的原始圖像數據經base calling轉化為序列數據，即raw data或raw reads。除去原始測序reads中只含adaptor序列的reads,備以后續分析。
[0054]實施例4 百令”生產菌冬蟲夏草中國被毛孢RNA短讀序列組裝
[0055]使用短reads 組裝軟件 SOAPdenovo (Li, Zhu et al.De novo assembly ofhuman genomes with massively parallel short read sequencing[J].GenomeRes, 2010, 20:265-272.)做轉錄組從頭組裝。SOAPdenovo首先將具有一定長度overlap的reads連成更長的不含N的Contig片段。然后將reads比對回Contig,通過paired-endreads確定來自同一轉錄本的不同Contig以及這些Contig之間的距離，SOAPdenovo將這些Contig連在一起，中間未知序列用N表示，這樣就得到Scaffold。進一步利用paired-end reads對Scaffold做補洞處理,最后得到含N最少,兩端不能再延長的Unigene序列。最后，將Unigene序列與蛋白數據庫nr、Swiss-Prot、KEGG和COG做blastx比對(evalue〈0.00001),取比對結果最好的蛋白確定Unigene的序列方向。如果不同庫之間的比對結果有矛盾，貝丨』按nr、Swiss-Prot、KEGG和COG的優先級確定Unigene的序列方向，跟以上四個庫皆對比不上的 Unigene 用軟件 ESTScan (Iseli, Jongeneel et al.ESTScan:aprogram for detecting, evaluating, and reconstructing potential coding reg1ns inEST sequences[J].1n Proceedings of9th Internat1nal Conference on IntelligentSystems for Molecular B1logy.AAAIPress, Menlo Park, CA, pp.1999, 138-148.)預測其編碼區并確定序列的方向。對于能確定序列方向的Unigene給出其從5’到3’方向的序列，對于無法確定序列方向的Unigene給出組裝軟件得到的序列。
[0056]實施例5 百令”生產菌冬蟲夏草中國被毛孢Unigene功能注釋
[0057]功能注釋信息給出Unigene的蛋白功能注釋、Pathway注釋、COG功能注釋和Gene Ontology(GO)功能注釋。首先,通過blastx將Unigene序列比對到蛋白數據庫nr、Swiss-Prot、KEGG和COG (evalue〈0.00001),得到跟給定Unigene具有最高序列相似性的蛋白，從而得到該Unigene的蛋白功能注釋信息。根據KEGG注釋信息能進一步得到Unigene的Pathway注釋。將Unigene和COG數據庫進行比對,預測Unigene可能的功能并對其做功能分類統計。根據nr注釋信息,使用Blast2G0軟件(Conesa, Gotz et al.Blast2G0:auniversal tool for annotat1n, visualizat1n and analysis in funct1nal genomicsresearch [J].B1informatics, 2005, 21 (18): 3674-3676.)得到 Unigene 的 GO 注釋信息。得到每個Unigene 的GO注釋后，用 WEGO軟件(Ye, Fang et al.WEGO: a web tool for plottingGO annotat1ns [J].Nucleic Acids Research, 2006，34:293-297.)對所有 Unigene 做 GO功能分類統計，從宏觀上認識該物種的基因功能分布特征。
[0058]實施例6 百令”生產菌冬蟲夏草中國被毛孢侵染機制和過程的分析
[0059]圖2是中國被毛孢侵染蝙蝠蛾幼蟲機制和過程注釋圖，每年7-8月冬蟲夏草子實體成熟后，子囊孢子彈出隨雨水滲入土中，經過發育變化形成分生孢子。此時如附在蝙蝠蛾幼蟲表，經2-3天后即開始萌發伸出芽管，通過酶和機械力的協同作用侵入幼蟲體內。吸收體液養分生長并斷裂成菌絲段，以酵母狀出芽發迅速增值不斷擴大體積。前期其代謝產物在血液中不斷積累，造成血液酸堿度變化，使血液失去原有的透明性而變渾濁。但不產生毒素與寄主幼蟲共生。后期，由于菌體增多，彌漫于幼蟲血腔，腸道亦受機械封阻，血液梨花性質發生改變造成病理傷害，出現代謝紊亂，幼蟲行動癡呆，不取食。這時菌絲體迅速向體表蔓延，在幼蟲體表上出現細線稀疏的白色菌絲，菌絲體大量吸收幼蟲體內水分，致使幼蟲干硬僵死形成僵蟲(即菌核)。通常，中國被毛孢會產生一些降解寄主昆蟲的細胞壁、細胞膜和細胞內物質的酶，如幾丁質酶、絲氨酸蛋白酶、脂酶等，以降解體壁含有的幾丁質、蛋白質、類脂等成份，從而有利于侵襲。從中國被毛孢轉錄組測序以及注釋信息中檢測到了絲氨酸蛋白酶的Unigene。通過NCBI中的ORF Finder軟件在線檢測，找出了這個基因的開放閱讀框(SEQ ID N0.2)并得到了相應的蛋白質序列(SEQ ID N0.1)。
[0060]實施例7 百令”生產菌冬蟲夏草中國被毛孢絲氨酸蛋白酶基因引物設計
[0061]運用GENE RUNNER引物設計軟件根據預測得到的各基因開放閱讀框DNA序列設計引物，用于克隆“百令”生產菌中國被毛孢合成代謝侵染機制的絲氨酸蛋白酶基因，引物由上海桑尼生物科技有限公司合成，引物序列如下所列:
[0062]serA 基因:正向引物 5’ AGAGAATTCCCGGACCTGTCGCCGGCCAC3’
[0063]反向引物 5 ’ ATAGCGGCCGCTTACCGTCCTTTTTGCCC3，
[0064]serA 基因長度為 l290bp。
[0065]實施例8 百令”生產菌冬蟲夏草中國被毛孢cDNA第一鏈的制備
[0066]先按照實施例1提供的方法培養出中國被毛孢發酵菌絲體后，再按照實施例2所提供的方法對中國被毛孢進行總RNA的提取，得到總RNA后按下述進行“百令”生產菌冬蟲夏草中國被毛孢cDNA第一鏈的合成，用于后續各基因克隆實驗。
[0067]米用PrimeScriptlstStrand cDNA Synthesis Kit試劑盒(TaKaRa)從Total RNA中反轉錄合成cDNA第一鏈，實驗步驟如下:
[0068]I)在Microtube管中配制下列混合液。
[0069]

【權利要求】
1.一種來自冬蟲夏草的絲氨酸蛋白酶，其特征在于所述絲氨酸蛋白酶氨基酸序列如SEQ ID N0.1 所示。
2.如權利要求1所述的絲氨酸蛋白酶在生物催化酪素制備酪氨酸中的應用。
3.如權利要求2所述的應用，其特征在于所述的應用為:將含絲氨酸蛋白酶基因的重組工程菌經誘導培養獲得的濕菌體用pH8.0磷酸鹽緩沖液懸浮，超聲破碎后，取破碎混合液離心，取上清液作為催化劑，以10.00mg/mL酪素溶液為底物，40°C下水浴反應，反應結束后，將反應液離心，取上清液即獲得含酪氨酸的混合液；所述10.00mg/mL酪素溶液按如下步驟制備:取1.0OOg酪素用0.5mol/L的氫氧化鈉水溶液潤濕，加入pH值為8.0的PBS緩沖液，在沸水浴中邊加熱邊攪拌，直至完全溶解，冷卻后，轉入10ml容量瓶中，用緩沖液稀釋至刻度；所述氫氧化鈉水溶液的體積用量以酪素質量計為5ml/g。
4.如權利要求2所述的應用，其特征在于:所述底物的用量以酪素質量計，所述酪素的初始濃度為5mg/mL，所述催化劑的體積用量以破碎前濕菌體的質量計，終濃度為20g/L。
5.如權利要求3所述的應用，其特征在于所述催化劑按如下方法制備:將含絲氨酸蛋白酶的重組工程菌接種于含終濃度50μ g/ml的Kan抗性的LB液體培養基中，37°C、250r/min培養過夜，取培養物，以體積濃度2 %接種量轉接于含有50 μ g/ml Kan抗性的LB液體培養基中，37°C、250r/min培養至菌體濃度0D600為0.6~0.8，向培養物中加入終濃度.0.05mmol/L的IPTG誘導培養8h，收集濕菌體，將濕菌體在功率40%、破Is停Is條件下超聲破碎，取破碎混合液即為催化劑。
6.一種編碼權利要求1所述絲氨酸蛋白酶的基因。
7.如權利要求6所述的編碼基因，其特征在于所述編碼基因的核苷酸序列如SEQIDN0.2所示。
8.如權利要求6或7所述的編碼基因在構建能夠生物催化酪素制備酪氨酸的基因工程菌中的應用。
9.如權利要求8所述的應用，其特征在于所述的應用為:構建含有所述絲氨酸蛋白酶基因的重組載體，將所述重組載體轉化至大腸桿菌中，獲得的重組基因工程菌進行誘導培養，培養液分離純化獲得含有絲氨酸蛋白酶基因的菌體細胞。
【文檔編號】C12N1/21GK104130994SQ201410308921
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年6月30日 優先權日:2014年6月30日
【發明者】柳志強, 鄭裕國, 林善, 薛亞平, 吳暉, 李邦良, 許靜, 許峰, 王鴻艷 申請人:浙江工業大學, 杭州中美華東制藥有限公司