專利名稱：一種用于關節炎治療的超聲微泡及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及炎性關節炎治療領域，具體是指一種含有能夠產生可溶性腫瘤壞死因子受體基因質粒的治療型超聲微泡，以及將其用于炎性關節炎方面的治療用途。
背景技術：
腫瘤壞死因子(英文簡寫TNF)是由巨噬細胞淋巴細胞分泌的細胞因子，TNF-α主要由單核巨噬細胞分泌，TNF-β主要由活化的T淋巴細胞分泌。TNF因早期研究發現其對腫瘤具有直接溶解和抑制增殖的作用而得名。近年研究證明，TNF- α參與多種炎癥反應，是一個非常重要的促炎因子。TNF-α在炎性關節炎的發病中起到非常重要的作用，在臨床疾病中體內的TNF-α水平過高，從而介導炎癥反應，造成患者關節的破壞。炎性關節炎(包括類風濕關節炎，各種脊柱關節病，幼年特發性關節炎等)是一組 臨床的常見病，其發病率在我國約在1%左右，且發病年齡多為年輕人。由于該組疾病的病因不明，因而缺乏根治的手段，需要終生長期治療，加之在缺乏有效干預的情況下，患者很快會出現關節破壞，疾病可累及全身的多個臟器，是世界范圍內致死、致殘的重要疾病之一。TNF-α阻滯劑在炎性關節炎治療中的應用給炎性關節炎的治療帶來了革命性的進展，實驗和臨床證明其療效確切，副作用較少。目前，抗腫瘤壞死因子的制劑包括抗-TNF-α抗體、重組TNF受體蛋白等，抗體和重組受體蛋白的作用都是通過阻止TNF-a與其在細胞膜上的受體結合，從而抑制由TNF-α導致的關節炎癥和關節損傷，臨床應用發現不同制劑的作用和療效基本相當。由于這類產品的研發和生產成本較高，且主要來自國際大的醫藥公司，因而其造價昂貴(每月單一藥物價格達6000-12000元)，給患者及家屬帶來了沉重的經濟負擔。尤其在我國，由于這類藥物基本均為自費，使大多數的患者不能享受到這類治療藥物帶來的益處；另一方面，由于這組疾病需要長期的治療，現有的制劑又均為蛋白質制品，其半衰期較短，患者需要每周1-2次到醫院反復注射，給患者帶來生活的不便，反復注射也存在過敏反應、抗藥等副作用；前者使一些患者不得不中斷治療，后者則會造成藥物療效的降低。超聲微泡作為一種新型聲學造影劑在器官、組織的超聲顯像中發揮了巨大的作用，研究發現特定波長的超聲能夠使細胞膜產生空隙，這種特定波長的超聲可以介導基因的轉染。超聲微泡可以作為新的基因運載工具，將特定的基因與微泡造影劑結合起來，加之這種微泡可以在超聲的作用下被破壞，釋放所攜帶的基因，從而使基因得以轉染到特定組織和特定的位置，這種由微泡和超聲波所介導的基因轉染具有操作簡便、靶向性好、轉染率高、安全且重復性好的優點。目前，國內外尚無將腫瘤壞死因子受體基因與超聲微泡相結合，制備成治療型超聲微泡并用于治療炎性關節炎方面的相關文獻報道。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種用于關節炎治療的超聲微泡，通過在微泡中攜帶腫瘤壞死因子受體蛋白的基因質粒，利用微泡可在特定組織定位釋放基因的特點，使基因質粒在患者體內產生TNF-α阻滯劑，在確保療效的基礎上，減輕患者及家屬的經濟負擔，并克服反復注射的不便。本發明所要解決的另一技術問題就是將上述治療型超聲微泡用于炎性關節炎方面的治療用途。本發明的目的通過下述技術方案實現一種用于關節炎治療的超聲微泡，微泡中含有能夠表達腫瘤壞死因子受體蛋白的基因質粒，基因質粒吸附于微泡外表面和/或包裹于微泡內，利用超聲微泡的優點，使其在特定組織釋放并轉染基因到特定的組織，轉染的基因能夠表達可溶性TNF受體，從而控制TNF- α造成的關節炎癥和對關節的破壞，達到治療炎性關節炎的目的，該技術在確保療效的同時降低造價，給患者及家屬減輕經濟負擔。所述的基因質粒為表達質粒，轉染的基因能夠表達可溶性TNF受體。 進一步，所述腫瘤壞死因子受體蛋白的基因質粒中含有腫瘤壞死因子受體(TNFR)的胞外段基因。或者，所述腫瘤壞死因子受體蛋白的基因質粒中含有能夠與腫瘤壞死因子(TNF-α )結合的蛋白或肽段的基因片段。所述的基因質粒轉染體細胞后表達能夠阻滯腫瘤壞死因子與細胞膜上的腫瘤壞死因子受體結合的可溶性蛋白或肽段。所述的微泡采用超聲造影劑微泡，超聲造影劑微泡含有氣體內核，所述的氣體內核成分包括常溫下呈氣態的全氟丙烷、全氟丁烷或六氟化硫中的至少一種。所述的超聲造影劑微泡為脂質超聲造影劑微泡、人血白蛋白超聲造影劑微泡或高分子材料超聲造影劑微泡，所有的微泡均為已知或有文獻報道過的。(I)脂質超聲造影劑微泡包括各種用磷脂或磷脂類衍生物作為成膜材料的脂質微泡，例如聲諾維(SonoVue)、Definity等。上面所述的成膜材料磷脂或磷脂類衍生物，例如1，2-二棕櫚酰基-sn-甘油基-3-磷脂酸甘油基-鈉鹽(DPPG)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰膽堿(DSPC)、1，2- 二棕櫚酰基-sn_甘油基-3-磷脂酸-鈉鹽(DPPA)U, 2- 二棕櫚酰基-sn-甘油基_3_磷脂酰膽堿(DPPC)等。(2)人血白蛋白超聲造影劑微泡包括各種用人血白蛋白作為成膜材料的超聲微泡，如Optison 等。(3)高分子材料超聲造影劑微泡包括微泡殼成分中含有各種高分子作為成膜材料的超聲微泡，如P0INT Biomedical公司的PB127、Acusphere公司的A1-700等。上面所述的高分子材料具體包括分子量在3000至10000的聚乙二醇、乳酸/羥基乙酸共聚物(PLGA )、氰基丙烯酸酯等。制備攜帶腫瘤壞死因子受體基因的微泡時，腫瘤壞死因子受體基因質粒在超聲造影劑微泡形成前或形成后加入
(I)所述腫瘤壞死因子受體基因質粒在超聲造影劑微泡形成前加入的具體方法為將腫瘤壞死因子受體基因質粒與脂質超聲造影劑微泡的成膜材料在脂質混懸液未振蕩成微泡前加入，通過機械振蕩法振蕩后即形成含有大量微氣泡的混懸液(振蕩頻率為400(Γ5500次/分，幅度為1(Γ30毫米，時間為3(Γ90秒)，振蕩后腫瘤壞死因子受體基因質粒通過靜電直接結合到微泡殼內表面或外表面。
(2)所述腫瘤壞死因子受體基因質粒在超聲造影劑微泡形成后加入的具體方法為將制作完成的超聲造影劑微泡混懸液直接與含有腫瘤壞死因子受體基因質粒的溶液混合，再使用旋渦振蕩器或手搖方式使腫瘤壞死因子受體基因質粒充分與微泡混合并結合于微泡外表面。腫瘤壞死因子受體基因質粒在超聲造影劑微泡形成前加入的方法與現有技術相比，區別在于在微泡的制作中加入了腫瘤壞死因子受體基因質粒，而腫瘤壞死因子受體基因質粒在超聲造影劑微泡形成后加入的方法中，直接將已有的微泡產品與腫瘤壞死因子受體基因質粒混合即可。一種將所述的超聲微泡用于治療炎性關節炎疾病的用途，在炎性關節炎的治療領域，目前還沒有采用腫瘤壞死因子受體基因質粒及超聲造影劑微泡混合的先例，其在炎性關節炎領域具有突出的實質性進步，不僅降低了治療成本，為患者及家屬減輕了經濟負擔，而且療效明顯，副作用低。本發明的治療機制為攜帶能夠表達腫瘤壞死因子受體蛋白基因質粒的微泡經肌 肉或關節腔注射到局部組織后，用一定能量的超聲輻照使載基因微泡在患者肌肉或關節滑膜處破裂，定點釋放TNFR基因，并協助基因進入細胞內。本發明與現有技術相比，具有如下的優點和有益效果
(I)本發明應用攜帶腫瘤壞死因子受體基因的超聲微泡，經關節腔或肌肉注射，然后應用超聲波基因轉染的原理，將含可產生可溶性重組腫瘤壞死因子的基因質粒轉染到患者的滑膜或肌肉組織中，使其在患者體內表達可溶性重組腫瘤壞死因子受體，達到控制TNF- α導致的關節炎癥和關節損傷的目的。該技術療效確切，同時由于該基因轉染到患者滑膜或肌肉組織中后可以較長時間表達，克服了目前制劑需長期重復注射的麻煩。并且，由于轉染的質粒具有不插入基因組，一定時間內可以聞效表達，故具有較聞的安全性。(2)本發明將腫瘤壞死因子受體基因與各種超聲微泡結合，利用超聲造影劑微泡的特點，使其在特定組織釋放并轉染腫瘤壞死因子受體基因，使該基因在體內表達TNF受體蛋白，相比于臨床常用的單抗及重組TNF受體蛋白，造價明顯降低，應用更加方便，很大程度上減輕了患者及家屬的經濟和生活負擔。(3)本發明的應用可以使中低收入人群享受到TNF-α阻滯劑這一新的科學進展帶來的益處，提高炎性關節炎的整體治療效果，提高患者的生存質量，減輕患者及家屬生活負擔的同時，也降低了社會的經濟負擔。(4)本發明利用腫瘤壞死因子受體基因在炎性關節炎領域的治療效果，結合超聲造影劑微泡的優點，在確保療效的同時，兼具操作簡便、靶向性好、轉染率高、安全且重復性好的優點。(5)將本發明用于炎性關節炎治療領域，可以為患者提供一種安全、方便、有效的治療手段，并且由于其造價低的優勢，可在炎性關節炎領域大范圍推廣使用。
圖1為結合了腫瘤壞死因子受體基因的治療型超聲微泡模式圖。圖2為腫瘤壞死因子受體基因的質粒作用模式圖。圖3為治療型超聲微泡聯合超聲輻照轉染增強綠色熒光蛋白(EGFP)到肌肉。
圖4為治療型超聲微泡聯合超聲輻照轉染增強綠色熒光蛋白(EGFP)到關節滑膜。圖5為各轉染組sTNFR蛋白Westen blot檢測結果。圖6為TNF-α檢測標準曲線。圖7 為 ELISA 檢測樣本混合液中 TNF-α 含量(η=2，* ρ < 0.05, * ρ〈 O. 01.One Way ANOVA)D圖8為經攜帶分泌型TNF受體質粒的超聲微泡導入治療后，實驗動物的關節炎癥狀對比圖，其中左圖為正常小鼠后足關節，中圖為空質粒治療組，右圖為TNFR質粒微泡超聲治療組。圖9為經攜帶分泌型TNFR基因質粒的超聲微泡治療后關節炎小鼠的關節炎癥在組織學上的對比圖，其中左圖為模型組動物踝關節(未治療)，右圖為TNFR質粒超聲微泡治 療組動物踝關節。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步地詳細說明，但本發明的實施方式不限于此。實施例1 本發明治療型微泡的性質評價
圖1所示為結合了腫瘤壞死因子受體基因的治療型超聲微泡模式圖，腫瘤壞死因子受體基因質粒在超聲造影劑微泡形成前加入，具體方法為將腫瘤壞死因子受體基因質粒與脂質超聲造影劑微泡的成膜材料在脂質混懸液未振蕩成微泡前加入，通過機械振蕩法振蕩后即形成含有大量微氣泡的混懸液，振蕩后腫瘤壞死因子受體基因質粒通過靜電直接結合到微泡殼內表面或外表面。該方法主要針對脂質超聲造影劑微泡，在超聲造影劑微泡形成前，將腫瘤壞死因子受體基因質粒與脂質混懸液(微泡制備液)混合，盛有以上混合液的西林瓶氣體頭部充滿全氟丙烷或者全氟丁烷氣體，再通過高速機械振蕩，在微泡形成的同時將腫瘤壞死因子受體基因質粒整合在微泡膜上或包裹在微泡殼內。機械振蕩時，將盛有造影劑的西林振蕩瓶置于機械振蕩裝置的夾頭上，按設置好的工作參數進行機械振蕩(水平往復式振蕩，工作頻率5500次/分鐘，振動幅度25 ± 1mm，時間65s)，振蕩后即形成整合有腫瘤壞死因子受體基因質粒的脂質氟碳微氣泡的混懸液。當然，腫瘤壞死因子受體基因質粒在超聲造影劑微泡形成后加入，具體方法為將制作完成的超聲造影劑微泡混懸液直接與含有腫瘤壞死因子受體基因質粒的溶液混合，再使用旋渦振蕩器或手搖方式使腫瘤壞死因子受體基因質粒充分與微泡混合并結合于微泡外表面。該方法也可以稱為直接連接法，又稱為被動吸附或靜電吸附法，是文獻中采用較多的超聲造影劑微泡與配體的連接方法。以脂質超聲造影劑微泡為例，大分子脂質是一種卵磷脂的衍生物，具有化學雙極性以及疏水端和親水端，在不添加任何外在化學成分的情況下可通過自身離子鍵、物理吸附(范德華力)等方式將配體直接連接到微泡上。人血白蛋白微泡和高分子材料微泡表面也存在同樣的情況，采用直接連接法也可以成功結合凝血因子。圖2為腫瘤壞死因子受體基因的質粒作用模式圖，FADD (Fas-associatingprotein with a novel death domain),即具有死亡功能區的 Fas 相關蛋白；TRADD (TNFreceptor I associated via death domain),即有死亡區的腫瘤壞死因子受體I相關蛋白；TRAF2 (TNF receptor-associated factor 2),即 TNF 受體相關蛋白 2。A:疾病狀況下，TNF三聚化，與三聚化的TNF II型受體結合，分別通過FADD-Caspase信號通路介導了滑膜細胞等正常組織細胞的凋亡，同時通過TRADD-TRAF2活化NF- K B信號通路，促進了滑膜成纖維細胞的增殖和炎癥細胞因子的分泌。B:治療狀況下，質粒被超聲造影劑包裹后，在超聲作用下，進入細胞內。在細胞內轉錄，翻譯，分泌出可溶性蛋白sTNFR-Fc，該可溶蛋白通過Fe片段中的半胱氨酸二聚化，結合組織液中游離的TNF，阻止了 TNF與細胞膜上固有的TNFII受體結合，從而阻斷了 TNF的生物學效應。圖3為治療型超聲微泡聯合超聲輻照轉染增強綠色熒光蛋白(EGFP)到肌肉；圖4為治療型超聲微泡聯合超聲輻照轉染增強綠色熒光蛋白(EGFP)到關節滑膜。由圖可看出，利用超聲微泡攜帶基因可使微泡所攜帶的基因轉染到特定的組織部位，轉染的基因可在轉 染的組織中高效表達。實施例2本發明體外競爭性阻斷TNF與受體結合的作用1、實驗方法(以sTNFR-Fc/pcDNA3.1為例)
LB液體培養基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉10g/L)37度，振蕩培養分別轉化有 sTNFR-Fc/pcDNA3. 1，pcDNA3. 1，sTNFR-4HA/pcDNA3.1 和 4HA/pcDNA3.1 質粒的4種DH5a菌株。IOOOOg高速離心收集3ml菌液，使用商品化質粒提取試劑盒E.Z. N. A. Plasmid Mini Kit I (Omega Bio,D6943)采用經典的堿裂解法和桂膠梓純化方式，按照說明書步驟提取質粒。紫外分光光度計測定質粒濃度和純度。人胚腎細胞(HEK293)以I X IO5個細胞接種于六孔板中，采用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基培養過夜,待細胞融合率達到90%,使用invitrogen公司Iipofectamin2000脂質體轉染試劑，按說明書進行質粒轉染(每孔細胞轉染4 μ g質粒)。轉染后36h，分別收集細胞培養上清和細胞。細胞采用RIPA裂解液(碧云天生物技術研究所，P0013B)提取細胞總蛋白，BCA蛋白測定試劑盒(碧云天生物技術研究所，P0009)蛋白濃度。40yg蛋白上樣,Western blot檢測目的蛋白sTNFR的表達。使用human TNF- α的ELISA檢測試劑盒(R&D，DTA00C)配置標準品，繪制標準曲線。同時，配置標準品時，將濃度為125pg/ml的人TNF-α標準品與細胞培養上清等比混合，配置為濃度為TNF- a 62. 5pg/ml的混合液，37度孵箱孵育30min。按試劑盒說明書進行檢測并進行計算，通過計算樣本混合液中TNF-α降低比例反推細胞上清液中sTNFR-Fc對TNF-α的結合能力。2、實驗分組
①Control實驗組HEK293細胞未轉染任何質粒
②pcDNA3.1轉染組六孔板每孔HEK293細胞轉染空質粒pcDNA3.1 4 μ g
③sTNFR-Fc/pcDNA3.1轉染組六孔板每孔HEK293細胞轉染sTNFR_Fc/pcDNA3.1質粒
4μ g
④sTNFR-4HA/pcDNA3.1 轉染組六孔板每孔 HEK293 細胞轉染 sTNFR_4HA/pcDNA3.1 質粒4 μ g
⑤4HA/pcDNA3.1轉染組六孔板每孔HEK293細胞轉染4HA/pcDNA3.1質粒4 μ g3、觀察方法
質粒轉染的HEK293細胞內，sTNFR蛋白的表達采用western blot檢測一抗為抗TNFRSF1B抗體(genetxt公司，貨號GTX10502)，針對TNF II受體胞外段，可檢測目的蛋白sTNFR的表達，二抗為兔抗羊IgG/HRP (北京中杉金橋生物技術有限公司，ZDR-5308)，采用化學發光試劑盒(Millipore公司，WBKLS0100)檢測目的條帶，圖像采集使用Bio-Rad公司凝月父米集系統。質粒在HEK293細胞內表達分泌的sTNFR-Fc等結合TNF- α的能力采用ELISA方法檢測，每個樣本為雙復孔，全波長紫外分光光度計450 nm測定最后反應物的吸光度值，根據標準曲線推算樣品中實際的TNF-α含量。實驗結果
①Westen blot檢測結果
如圖5所示為各轉染組sTNFR蛋白Westen blot檢測結果,未轉染組(Control組)，空載體pcDNA3.1及載體4HA/pcDNA3.1轉染組無目的蛋白sTNFR的表達；而sTNFR-Fc/pcDNA3.1和sTNFR-4HA/pcDNA3.1轉染組能檢測到蛋白sTNFR的表達。②ELISA檢測結果(圖6所示為TNF- α檢測標準曲線)
表1、標準曲線測定孔540nm吸光度值
權利要求
1.一種用于關節炎治療的超聲微泡，其特征在于微泡中含有能夠表達腫瘤壞死因子受體(TNFR)蛋白的基因質粒，基因質粒吸附于微泡外表面和/或包裹于微泡內。
2.根據權利要求1所述的一種用于關節炎治療的超聲微泡，其特征在于所述的基因質粒為表達質粒。
3.根據權利要求2所述的一種用于關節炎治療的超聲微泡，其特征在于所述腫瘤壞死因子受體蛋白的基因質粒中含有腫瘤壞死因子受體(TNFR)的胞外段基因。
4.根據權利要求2所述的一種用于關節炎治療的超聲微泡，其特征在于所述腫瘤壞死因子受體蛋白的基因質粒中含有能夠與腫瘤壞死因子(TNF-α )結合的蛋白或肽段的基因片段。
5.根據權利要求3或4所述的一種用于關節炎治療的超聲微泡，其特征在于所述的基因質粒轉染體細胞后表達能夠阻滯腫瘤壞死因子與細胞膜上的腫瘤壞死因子受體結合的可溶性蛋白或肽段。
6.根據權利要求5所述的一種用于關節炎治療的超聲微泡，其特征在于所述的微泡采用超聲造影劑微泡。
7.根據權利要求6所述的一種用于關節炎治療的超聲微泡，其特征在于所述的超聲造影劑微泡含有氣體內核，所述的氣體內核成分包括常溫下呈氣態的全氟丙烷、全氟丁烷或六氟化硫中的至少一種。
8.根據權利要求7所述的一種用于關節炎治療的超聲微泡，其特征在于所述的超聲造影劑微泡為脂質超聲造影劑微泡、人血白蛋白超聲造影劑微泡或高分子材料超聲造影劑微泡。
9.一種將權利要求f 8任一項所述的超聲微泡用于治療炎性關節炎疾病的用途。
全文摘要
本發明公開了一種用于關節炎治療的超聲微泡及其用途，微泡中含有能夠表達腫瘤壞死因子受體(TNFR)蛋白的基因質粒，基因質粒吸附于微泡外表面和/或包裹于微泡內；所述的基因質粒為表達質粒；所述腫瘤壞死因子受體蛋白的基因質粒中含有腫瘤壞死因子受體(TNFR)的胞外段基因或含有能夠與腫瘤壞死因子(TNF)結合的蛋白或肽段的基因片段；基因質粒轉染體細胞后表達能夠阻滯腫瘤壞死因子與細胞膜上的腫瘤壞死因子受體結合的可溶性蛋白或肽段。本發明不僅造價低，可很大程度上減輕患者及家屬的經濟負擔，而且在炎性關節炎治療領域有了突破性的進展，可在該領域內大范圍推廣使用。
文檔編號A61K9/00GK103006538SQ20121044573
公開日2013年4月3日 申請日期2012年11月9日 優先權日2012年11月9日
發明者葉琳 申請人:葉琳