制備無飼養細胞、無異源的人胚胎干細胞的方法以及使用該方法制備的干細胞培養物的制作方法

專利名稱：制備無飼養細胞、無異源的人胚胎干細胞的方法以及使用該方法制備的干細胞培養物的制作方法
技術領域：
及背景技術本發明涉及使用無飼養細胞(如飼養細胞層，也稱作飼養層)、無異源(xeno-free)的培養體系來制備人胚胎干細胞系的方法，另外還涉及在該無異源污染物和飼養細胞的培養物中，能夠維持其未分化、具有多能性和可增殖狀態的干細胞。
胚胎干細胞(ESCs)是全能性的，其具有分化為任意類型的細胞并生成任意類型的組織、器官或部分軀體包括完整有機體的能力。同樣，人們預期如果能夠根據需要而獲得常態人ESCs克隆并且能夠控制其分化，則將提供一種強有力的工具，將對生物醫學、工業和科學研究領域產生根本性的推動作用。ESCs潛在的用途非常廣泛，包括藥物的發現和測試、用于移殖的細胞、組織和器官的產生、生物分子的制備、化合物的毒性和/或致畸性測試、以及促進有關發育和其它生物進程的研究。例如，目前預期一些疾病，包括Parkinson’s病(帕金森病)、心肌梗塞、幼年型糖尿病和白血病，均能夠通過治療性移殖ESCs或ESC衍生細胞而加以治療(Gearhart J.Science 1998，2821061；Rossant和Nagy，Nature Biotech.1999，1723)。
然而，在開發利用人ESCs的實踐中仍然存在著非常大的障礙。
為了使人ESC處于一種未分化狀態，必須補充能夠維持細胞增殖、抑制ES細胞分化并保持細胞多能性的因子到ES培養物中。
另外，如果用于細胞置換和組織再生治療時，人ESCs必須在一種完全無動物成分的環境中并且在特定的能夠使ES培養物進行完全繁殖的培養條件下進行培養。
現有的ES培養方法主要是基于使用飼養細胞層，該細胞層能夠分泌干細胞增殖所需的因子，同時又抑制干細胞的分化。無飼養細胞體系也已經應用于ES細胞培養，上述體系使用了添加血清、細胞因子、和生長因子的基質，使用該基質代替飼養細胞層。
基于飼養層的培養小鼠飼養層-最常用的培養ES細胞的方法是基于小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)作為飼養細胞層，其中添加了含有血清或白血病抑制因子(LIF)的組織培養基，上述因子能夠維持ES細胞的增殖和其多能性[Thomson JA，Itskovitz-Eldor J，Shapiro SS，Waknitz MA，SwiergielJJ，Marshall VS，Jones JM.(1998).Embryonic stem cell lines derivedfrom human blastocysts.Science 2821145-7；Reubinoff BE，Pera MF，Fong C，Trounson A，Bongso A.(2000).Embryonic stem cell lines fromhuman blastocystssomatic differentiation in vitro.Nat.Biotechnol.18399-404]。MEF來自于12-13天的小鼠胚胎，在條件培養基中添加了胎牛血清。在這樣的條件下，小鼠ES細胞能夠在培養物中作為多能性干細胞被維持，保留其表型和功能特性。然而，與鼠ES細胞不同，所添加的外源LIF不能防止人ES細胞的分化(Thomson等，1998，Science 2821145-7；Reubinoff等，2000，Nat.Biotechnol.18399-404)。此外，使用飼養細胞極大提升了生產成本，并且不能實現人ES細胞的規模化培養。另外，飼養細胞是代謝失活的，以防止其使干細胞過分生長，因此對于人ES的每次分離培養，均需要補充新鮮的飼養細胞。因為現在從大規模制備的胚胎細胞中還不能有效地分離出飼養細胞組分，因此由飼養細胞層制備的ES培養物還不能適用于人類的治療。
還可以在無血清的條件下以MEF培養ES細胞，其中使用了添加基本成纖維細胞生長因子(bFGF)的血清替代品[Amit M，CarpenterMK，Inokuma MS，Chiu CP，Harris CP，Waknitz MA，Itskovitz-EldorJ，Thomson JA.(2000).Clonally derived human embryonic stem celllines maintain pluripotency and proliferative potential for prolongedperiods of culture.Dev.Biol.227271-8]。在上述條件下，ES細胞的克隆效率比胎牛血清條件下高出4倍。另外，在使用血清替代品的條件下，在6個月的培養時間之后，根據其形成含有全部三個胚胎原基層的畸胎瘤的能力，顯示出ES細胞仍然保持了其多能性。雖然上述體系使用了明確的培養條件，但是培養物中小鼠細胞的存在使人培養物暴露于病原體之下，這限制了其在細胞治療中的應用。
以人胚胎成纖維細胞或成人法洛皮歐(fallopian)上皮細胞作為飼養細胞層-可以使用人胚胎成纖維細胞或成人法洛皮歐上皮細胞來生長和維持人ES細胞。當在上述人飼養細胞上生長時，人ES細胞顯示出正常的染色體組型，表現出堿性磷酸酶活性，表達了Oct-4和其它胚胎細胞表面標記物，包括SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、和GCTM-2，能夠在體內形成畸胎瘤，并保留所有關鍵性的形態學特性[RichardsM，Fong CY，Chan WK，Wong PC，Bongso A.(2000).Human feederssupport prolonged undifferentiated growth of human inner cell massesand embryonic stem cells.Nat.Biotechnol.20933-6]。然而，使用人胚胎成纖維細胞或成人法洛皮歐管上皮細胞作為飼養細胞的一個主要的缺點是上述兩個細胞系的傳代能力是有限的，只有8-10次，因而對延長ES的生長時間的能力造成了制約。為了使培養時間延長，必須在來源于幾個受試者的人飼養細胞上生長ES細胞，這增大了培養條件的可變性。
包皮飼養層-使用人包皮飼養層也能培養人ES細胞，此項技術公開在美國專利申請號10/368,045中。來自包皮的飼養細胞層由一種完全無動物成分的環境組成，適用于培養人ES細胞。另外，包皮細胞可以在培養物中從其衍出出來后傳代42次，從而為ES細胞提供了一個相對恒定的環境。在上述條件下，發現人ES細胞在功能上不同于替代方案所生長的細胞(如MEF方案)。在分化之后，ES細胞在體外能夠表達與全部三個胚胎原基層相關的基因，并且在體內能夠形成畸胎瘤，該畸胎瘤包括了由全部三個胚原基層所生成的組織。另外，不同于人法洛皮歐上皮細胞或人胚胎成纖維細胞，在包皮飼養層上培養的人ES細胞在培養中處于多能性和未分化狀態的時間能夠維持至少87次傳代。然而，盡管包皮細胞能夠在培養中保持很長的時間(即42次傳代)，但是包皮培養體系不能很明確地確定下來，這是因為不同批次之間存在差異。另外，基于人飼養層的培養體系仍然需要飼養層和hES細胞的同時生長。因此發展了無飼養細胞的培養體系。
無飼養細胞培養在存在培養基的條件下，干細胞可以在固相表面生長，如細胞外基質(如MatrigelRTM或層粘連蛋白)。基于飼養細胞的培養需要飼養細胞和干細胞的同時生長，并由此可能導致出現混合細胞群體，與此不同，在無飼養細胞體系中生長干細胞，能夠很容易地從表面分離干細胞。使干細胞生長的培養基中包含能夠有效抑制分化和促進其生長的因子，如MEF條件培養基和bFGF。然而，通常所使用的無飼養細胞培養體系使用了一種動物來源的基質(如MatrigelRTM)，其中添加小鼠或牛血清，或添加MEF條件培養基[Xu C，等(2001).Feedercells-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.NatBiothchnol.19971-4]，這其中存在動物病原體交叉傳染給人ES細胞的危險，因此給進一步的臨床應用造成了困難。
美國專利申請號10/368,045公開的進一步的技術方案中，可以在添加了包皮來源的條件培養基的基質表面培養干細胞。然而，上述條件培養基盡管是無動物成分體系，但在培養物組成上仍沒有完全清楚限定。
在培養人胚胎干細胞方面，近期的一些研究給出了更加明確的培養物組成，其中利用了Matrigel或層粘連蛋白表面和生長因子混合物。然而，根據美國專利申請號20030017589的記載，在上述條件下，僅有50-70％的細胞表現出未分化細胞形態。另外，上述干細胞還表現出相對短的倍增時間，為19個小時，這提示干細胞轉變為腫瘤源性(參見Amit等，2000，Dev.Biol.227271-8)。
因此非常有必要提供一種能夠使人ES細胞保持其增殖性、多能性和未分化狀態的無飼養細胞、無異源的培養體系，以避免前面所述的各種不足，這將是非常有益的。
發明概述根據本發明的一個方面，提供了一種建立不含飼養細胞、能夠維持未分化、多能性和增殖狀態的人胚胎干細胞系的方法，該方法包含(a)獲取人胚胎干細胞，和(b)在不含飼養細胞、包括基質和添加了TGFβ1、bFGF和/或LIF的組織培養基的培養條件下，培養人胚胎干細胞，從而獲得無飼養細胞的人胚胎干細胞系。
根據所描述的優選的實施方式的進一步的特征，該方法進一步包含在所述培養條件下，從步驟(b)得到的人胚胎干細胞系中克隆細胞。
根據本發明的另一個方面，提供了一種在不含飼養細胞的培養條件下，繁殖處于未分化、多能性和增殖狀態的人胚胎干細胞系的方法，該方法包含在基質上和添加了TGFβ1、bFGF和/或LIF的組織培養基中，培養人胚胎干細胞系的細胞，從而使人胚胎干細胞系的細胞保持未分化、多能性和增殖的狀態。
根據本發明的另外一個方面，還提供一種建立無飼養細胞、能夠維持未分化、多能性和增殖狀態的人胚胎干細胞系的方法，該方法包含(a)獲取人胚胎干細胞，和(b)在不含飼養層細胞、包括纖連蛋白基質和添加了TGFβ1、bFGF和/或LIF的組織培養基的培養條件下，培養人胚胎干細胞，從而獲得無飼養細胞的人胚胎干細胞系。
根據本發明的另外一個方面，提供了一種在不含飼養細胞的培養條件下，繁殖處于未分化、多能性和增殖狀態的人胚胎干細胞系的方法，該方法包含在纖連蛋白基質上和添加了TGFβ1、bFGF和/或LIF的組織培養基中，培養人胚胎干細胞系的細胞，從而使人胚胎干細胞系的細胞保持一種未分化、多能性和增殖的狀態。
根據本發明的另外一個方面，提供了一種建立無異源、無飼養細胞的，能夠維持未分化、多能性和增殖狀態的物種胚胎干細胞系的方法，該方法包含(a)獲取胚胎干細胞，和(b)在不含飼養細胞和異源污染物、包括來源于物種的基質和組織培養基的培養條件下，培養胚胎干細胞，從而獲得無異源、無飼養細胞的該物種的胚胎干細胞系。
根據本發明的另外一個方面，提供了一種在不含飼養細胞和異源污染物的培養條件下，繁殖處于未分化、多能性和增殖狀態的物種胚胎干細胞系的方法，該方法包含在來源于物種的基質上和組織培養基中，培養該物種的胚胎干細胞系的細胞，從而使該物種的胚胎干細胞系的細胞保持未分化、多能性和增殖的狀態。
根據本發明的另外一個方面，提供了一種細胞培養物，其包含存在于培養基中的未分化、具有多能性和可增殖的人胚胎干細胞，其中該細胞培養物基本上不含異源污染物和/或飼養細胞污染物。
根據本發明的又一個方面，提供了一種無異源、無飼養細胞的培養體系，其包含基質和組織培養基，所選出的上述無異源、無飼養細胞的培養體系能夠使其中所培養的人胚胎干細胞保持增殖、多能性和未分化狀態。
根據本發明的又一個方面，提供了一種治療需要細胞置換和/或組織再生的個體的方法，該方法包含給所述個體施用無異源污染物和無飼養細胞污染物的人胚胎干細胞制品。
根據優選的實施方式的其他特點，該方法進一步包含在施用前制備所述人胚胎干細胞制品，所述制備是通過下述步驟實現的(a)獲取人胚胎干細胞，和(b)在不含飼養細胞和異源污染物、包括來源于人的纖連蛋白基質和添加了TGFβ1、bFGF和/或LIF的組織培養基的培養條件下，培養人胚胎干細胞，從而制備出人胚胎干細胞制品。
根據本發明的又一方面，提供了一種在不含飼養細胞的培養條件下，使人胚胎干細胞保持未分化、多能性和增殖狀態的方法，所述方法包含在包括基質和添加了至少一種生長因子的組織培養基的培養條件下，培養所述人胚胎干細胞，其中所選擇的生長因子的濃度范圍能夠使干細胞維持至少56次傳代，倍增時間為至少25小時。
根據優選的實施方式的進一步的特征，所述基質是纖連蛋白基質。
根據又一優選實施方式的進一步的特征，所述纖連蛋白選自牛纖連蛋白、重組牛纖連蛋白、人纖連蛋白、重組人纖連蛋白、小鼠纖連蛋白、重組小鼠纖連蛋白、和合成纖連蛋白。
根據優選的實施方式的進一步的特征，所述培養條件中基本上不含有異源污染物，同時所述基質選自人血漿纖連蛋白基質、重組人血漿纖連蛋白基質、人細胞纖連蛋白基質、重組人細胞纖連蛋白基質、人工合成纖連蛋白基質。
根據優選的實施方式的進一步的特征是所述人胚胎干細胞系包含至少85％的未分化人胚胎干細胞。
根據優選的實施方式的進一步的特征是所述人胚胎干細胞系的所述細胞所維持的倍增時間至少為25小時。
根據優選的實施方式的進一步的特征，所述組織培養基進一步包括血清和/或血清替代品。
根據優選的實施方式的進一步的特征，所述血清和/或血清替代品的濃度至少是10％。
根據優選的實施方式的進一步的特征，所述血清和/或血清替代品的濃度是15％。
根據優選的實施方式的進一步的特征，所述TGFβ1的濃度至少是0.06ng/ml。
根據優選的實施方式的進一步的特征，所述TGFβ1的濃度是0.12ng/ml。
根據優選的實施方式的進一步的特征，所述bFGF的濃度至少是2ng/ml。
根據優選的實施方式的進一步的特征，所述bFGF的濃度是4ng/ml。
根據優選的實施方式的進一步的特征，所述LIF的濃度至少是500u/ml。
根據優選的實施方式的進一步的特征，所述LIF的濃度是1000u/ml。
根據優選的實施方式的進一步的特征，所述基質是物種來源的纖連蛋白基質。
根據優選的實施方式的進一步的特征，所述無飼養細胞的培養條件中基本上不含異源污染物。
根據優選的實施方式的進一步的特征，所述物種胚胎干細胞系的細胞所維持的倍增時間至少是20個小時。
根據優選的實施方式的進一步的特征，所述組織培養基包括來源于物種的血清和/或血清替代品。
根據優選的實施方式的進一步的特征，來源于物種的血清的濃度至少是5％。
根據優選的實施方式的進一步的特征，所述組織培養基進一步包括至少一種生長因子。
根據優選的實施方式的進一步的特征，所述的至少一種生長因子選自TGFβ1、bFGF、LIF。
根據優選的實施方式的進一步的特征，所述組織培養基是來源于物種的條件培養基。
根據優選的實施方式的進一步的特征，所述人胚胎干細胞能夠保持未分化、多能性和增殖狀態至少38次傳代。
根據優選的實施方式的進一步的特征，所述TGFβ1的濃度范圍是0.06-0.24ng/ml。
根據優選的實施方式的進一步的特征，所述bFGF的濃度范圍是2-8ng/ml。
根據優選的實施方式的進一步的特征，所述LIF的濃度范圍是500-2000u/ml。
根據優選的實施方式的進一步的特征，所述培養條件包括濃度為15％的血清替代品、濃度為0.12ng/ml的TGFβ1、濃度為1000u/ml的LIF、和濃度為4ng/ml的bFGF。
本發明提供了一種利用無飼養細胞、無異源的培養體系來建立和繁殖人胚胎干細胞系的方法，并提供了存在于無異源污染物和飼養細胞的培養物中的、能夠保持未分化、多能性和增殖狀態的干細胞，從而成功地克服了現有已知技術方案的不足。
除非另有說明，本申請所使用的所有科技術語的含義均等同于本發明所屬技術領域普通技術人員的一般理解。下面對實施本發明所適用的方法和材料進行詳細描述，不過與上述方法和材料類似或等價的方法和材料同樣適用于實施或檢驗本發明。如果存在歧義，則以本專利說明書包括定義為準。另外，下述的材料、方法和實施例僅是對本發明的說明，而不是限定本發明。
附圖簡述參考后面的附圖并給合實施例對本發明進行描述。下面詳細參考附圖，應當強調的是附圖所顯示出了各種細節僅作為例子，用于解釋本發明所優選的實施方式，并為了有助于在原理上和概念上更容易地理解本發明。從這點上來說，附圖不需要顯示出本發明更為詳細的結構細節，其只要能夠滿足對本發明的基本理解就可以了，帶有附圖的本說明書能夠使本領域技術人員很顯然地得出本發明所包含的幾種實施方式。
關于附圖附

圖1a-d是顯微照片，顯示在無飼養細胞體系中，在來源于牛纖連蛋白基質上生長的ES細胞克隆和ES單細胞。明亮區域顯示在存在血清替代品和各種生長因子組合的條件下，在纖連蛋白上生長的各種ES細胞系。附圖1a顯示在存在TGFβ1、LIF和bFGF(TLF)的培養條件下生長的I-6ES細胞系，進行31次傳代后的情況(尺寸條代表100μm)。附圖1b顯示在存在TLF的培養條件下生長的I-3ES細胞系，進行21次傳代后的情況(尺寸條代表50μm)；附圖1c顯示在存在TLF的培養條件下生長的I-6ES細胞系，進行31次傳代后的情況(尺寸條代表50μm))；附圖1d顯示TGFβ1和bFGF(TF)條件下生長的I-3ES細胞系，進行20次傳代后的情況(尺寸條代表38μm)。記錄細胞之間的間隔(附圖1a-c)和人ES細胞典型的高核/細胞質比。
附圖1e-h是免疫組織化學顯微照片，顯示在無飼養細胞的體系中，在來源于牛的纖連蛋白基質上生長的人I-3和I-6ES細胞系，其表面標記物的表達情況，該標記物的表達是未分化細胞的典型特征。熒光圖象分別顯示在存在TF的條件下生長傳代17次并用抗-SSEA4抗體標記的人ES細胞(I-3細胞系)(附圖1e，尺寸條代表50μm)；在存在TLF的條件下生長傳代38次并用抗-SSEA4抗體標記的I-3ES細胞(附圖1f，尺寸條代表6μm)；在存在TLF的條件下生長傳代30次并用抗-TRA-60抗體標記的I-6ES細胞(附圖1g，尺寸條代表6μm)；在存在TF的條件下生長傳代21次并用抗-TRA-81抗體標記的I-3ES細胞(附圖1h，尺寸條代表6μm)。獲取熒光圖象既可以使用倒置熒光顯微鏡(附圖1e)，也可以使用共聚焦顯微鏡(附圖1f-h)。
附圖2a-c顯示在無飼養細胞的培養體系下，在牛來源的纖連蛋白基質上生長的hES細胞在體外的分化情況。顯示無飼養細胞培養體系中生長的細胞所衍生出的EBs組織切片。附圖2a是24小時時的簡單EB，來源于在TF中生長傳代28次后的I-3細胞系(尺寸條代表100μm)；附圖2b是14天的EB，其來源于在TF中生長傳代28次后的I-3細胞系(尺寸條代表50μm)；附圖2c是14天的EB，其來源于在TLF中生長傳代30次的I-3細胞系(尺寸條代表25μm)。注意EB的外部保護上皮(附圖2b，箭頭)和由柱形上皮組成的被間充質組織包圍的球狀結構(附圖2c)。
附圖2d-f顯示在本發明的無飼養細胞體系中，在不同條件培養基下在牛來源的纖連蛋白基質上生長的ES細胞所形成的14天的Ebs的細胞中，中胚層和外胚層代表性標記物的表達情況。用不同的抗體探針對來源于各種ES細胞系的EB細胞進行熒光免疫染色。附圖2d顯示在TLF中生長傳代22次的I-6細胞系，對其進行免疫染色使用的是抗神經特異性微管蛋白的抗體(尺寸條代表6μm)。附圖2e顯示在TLF中生長傳代30次的I-3細胞系，對其免疫染色使用的是抗平滑肌肌動蛋白的抗體(尺寸條代表6μm)。附圖2f顯示在TF中生長傳代28次的I-3細胞系，對其免疫染色使用的是抗CD-31的抗體(尺寸條代表6μm)。
附圖3顯示了用RT-PCR確定I-3或I-6ES細胞和由其形成的胚胎樣小體(EBs)的分化階段，其中I-3和I-6ES細胞是在無飼養細胞體系中在來源于牛的纖連蛋白基質上生長的。從I-3、I-6ES細胞或由其形成的EBs中提取RNA樣品，然后對該樣品進行RT-PCR反應。泳道1顯示在TF中生長傳代19次的I-3ES細胞；泳道2顯示在TLF中生長傳代20次的I-3ES細胞；泳道3顯示在TLF中生長傳代23次的I-3ES細胞所衍生出的14天的EBs；泳道4顯示在TF中生長傳代28次的I-3ES細胞所衍生出的14天的EBs；泳道5顯示在TLF中生長傳代30次的I-3ES細胞所衍生出的14天的EBs；泳道6顯示在TLF中生長傳代29次的I-3ES細胞所衍生出的14天的EBs；泳道7顯示在TLF中生長傳代22次的I-6ES細胞所衍生出的14天的EBs。在不存在RNA的情況下驗證上述反應的特異性(附圖3，泳道8)。注意泳道3-6的EBs樣品來自于四種不同批次的I-3ES細胞。
附圖4a-c顯示I-3和I-6ES細胞系在無飼養細胞的含TLF的體系中在牛來源的纖連蛋白基質上分別生長傳代26次和19次后，所衍生出的畸胎瘤的組織切片。畸胎瘤切片包括有髓神經(附圖4a)、透明軟骨的細節(附圖4b)和杯形細胞中富含的分泌性上皮(附圖4c)。尺寸條代表25μm。
附圖5a-c是形態學顯微照片，顯示在無飼養細胞的體系中在人來源的纖連蛋白基質上生長的ES細胞的集落。顯示的是在存在血清替代品和TF生長因子組合的條件下在人細胞纖連蛋白上生長傳代22次的I-3ES細胞系的亮區圖像。
附圖5d-f是免疫組織化學顯微照片，顯示在無飼養細胞體系中，在人來源的纖連蛋白基質上生長的人I-3和H-9ES細胞系，其表面標記物的表達情況，該標記物的表達是未分化細胞特有的。熒光圖象分別顯示在存在TF的條件下，在人細胞纖連蛋白上培養傳代16次，并用抗-TRA-1-60抗體(附圖5d)或抗-TRA-1-81抗體(附圖5e)標記的人I-3ES細胞系；在存在TLF的條件下，在人血漿纖連蛋白上培養傳代10次，并用抗-SSEA4抗體標記的人H-9ES細胞系(附圖5f)。
附圖6a-c顯示在無異源、無飼養細胞的條件下，在人纖連蛋白基質上生長的hES細胞在體外的分化情況。圖象顯示在不同培養條件下生長的I-3ES細胞所衍生出的14天時的EBs。附圖6a是在存在TLF生長因子條件下，在人細胞纖連蛋白基質上生長傳代17次；附圖6b是在存在TF生長因子條件下，在人細胞纖連蛋白基質上生長傳代17次；附圖6c是在存在TLF生長因子條件下，在人血漿纖連蛋白基質上生長傳代16次。
附圖7顯示通過RT-PCR確定I-3ES細胞和由其形成的胚胎樣小體(EBs)的分化階段，其中I-3ES細胞是在無飼養細胞體系中在來源于人的纖連蛋白基質上生長的。從I-3ES細胞或由其形成的EBs中提取RNA樣品，然后對該樣品進行RT-PCR反應。泳道1顯示在TF中生長傳代22次的I-3ES細胞；泳道2顯示在TLF中生長傳代18次的I-3ES細胞；泳道3顯示在TLF中生長傳代17次的I-3ES細胞；泳道4顯示在TF中生長傳代17次的I-3ES細胞所衍生出的14天的EBs；泳道5顯示在TLF中生長傳代17次的I-3ES細胞所衍生出的14天的EBs；泳道6顯示在TLF中生長傳代16次的I-3ES細胞所衍生出的14天的EBs。在不存在RNA的情況下驗證上述反應的特異性(附圖7，泳道7)。
附圖8a-c顯示I-3(附圖8a)、I-6(附圖8b)和H-9(附圖8c)hES細胞系在不同培養條件下的生長速度。顯示了I-3、I-6和I-9hES細胞系在如下培養條件下的生長速度，分別是在存在TLF(分別是附圖8a、b和c的粉紅曲線)或TF生長因子組合(分別是附圖8a、b和c的黑色曲線)的條件下，在牛纖連蛋白基質上培養；在存在TF生長因子組合的條件下，在人纖連蛋白基質上(分別是附圖8a、b和c的亮藍色曲線)，或在MEFs飼養細胞上培養(分別是附圖8a、b和c的暗藍色曲線)。
附圖8d是柱狀圖，顯示不同的培養條件維持未分化hES細胞生長的能力。人ES細胞是在如下的培養條件下培養的小鼠胚胎成纖維細胞(MEFs)；牛纖連蛋白，在存在TGFβ、LIF和bFGF(TLF BF)條件下；人纖連蛋白，在存在TGFβ、LIF和bFGF(TLF BF)條件下；牛纖連蛋白，在存在TGFβ和bFGF(TF BF)條件下；人纖連蛋白，在存在TGFβ和bFGF(TF BF)條件下；牛纖連蛋白，在存在LIF和TGFβ(LT)條件下；牛纖連蛋白，在存在LIF和bFGF(LF)條件下；牛纖連蛋白，在單獨存在TGFβ(T)條件下；和牛纖連蛋白，在單獨存在bFGF(F)的條件下。以兩天的增長測定未分化細胞的百分率。
附圖9a-f顯示在無飼養細胞體系中在不同的培養條件下生長的人ES細胞和人ES細胞集落。顯示的是在無飼養細胞體系中生長的各種ES細胞系的亮區圖像。附圖9a顯示在存在TLF條件下，在包皮基質上生長傳代5次的I-6細胞系(尺寸條表示75μm)；附圖9b顯示在存在MEF條件培養基的條件下，在MatrigelRTM上生長傳代12次的I-3.2細胞系(尺寸條表示50μm)；附圖9c顯示在存在TLF條件下，在MEF基質上生長傳代幾次的I-6細胞系(尺寸條表示75μm)；附圖9d顯示在存在TF條件下，在纖連蛋白上生長傳代21次的I-3細胞系(尺寸條表示50μm)；附圖9e顯示在存在TLF條件下，在MatrigelRTM上生長傳代12次的I-6細胞系(尺寸條表示75μm)；附圖9f顯示在存在TF條件下，在纖連蛋白上生長傳代20次的I-3細胞系(尺寸條表示38μm)。
附圖10a-f顯示在纖連蛋白(附圖10a和b)、MEF基質(附圖10c、e和f)或MatrigelRTM(附圖10d)上生長的I-6和I-3ES細胞系在SCID-beige小鼠中所形成的畸胎瘤的組織切片。用蘇木精和曙紅對畸胎瘤切片進行染色，包括類似腸的上皮，包括杯形細胞(附圖10a)、成熟軟骨組織(附圖10b和c)、胚胎肌管(附圖10d)、分層的表皮(附圖10e)和有髓神經(附圖10f)。尺寸條表示40μm。
優選實施方式的說明本發明涉及使用無飼養細胞、無異源的培養條件來建立和繁殖人胚胎干細胞系的方法。本發明進一步涉及不含異源污染物、能夠在培養中維持其未分化、多能性和可增殖狀態，并由此高度適用于人類治療用途的人胚胎干細胞系。
參考附圖和隨后的說明，將能夠更好地理解本發明所提供制備不含飼養細胞和異源污染物的人胚胎干細胞系的方法的原理和操作過程。
在對本發明的實施方式進行詳細說明之前，應當指出本發明在應用方面并不局限于本申請下面的詳細說明或作為舉例的實施例的細節。本發明還可以具有其它的實施方式，可以通過各種途徑來實施和實現本發明。另外，還應當理解，本申請所使用的措辭和術語僅用于描述本發明，而不是對本發明的限制。
為了使人ES細胞維持其未分化的狀態，ES培養物必須為細胞提供使其維持細胞增殖、抑制ES細胞分化、并保持多能性的條件。典型的培養條件是通過使用飼養細胞層而獲得的，其中該細胞層能夠分泌干細胞增殖所需的因子、并同時抑制干細胞分化。
為了克服與使用飼養細胞層相關的局限性，如飼養細胞污染、不確定的培養體系，人們發展了更加確定的無飼養細胞培養體系。在無飼養細胞的培養體系中使用了基質和培養基，ES細胞附著在基質上，培養基為ES細胞提供細胞增殖所需的細胞因子和生長因子并同時抑制細胞分化。
常用的基質包括從Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤中提取的基底膜產品(如MatrigelRTM)、或牛纖連蛋白/層粘連蛋白。這樣的基質通常添加小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)條件培養基，或添加了牛血清和生長因子的人工合成條件培養基。
先前使用無飼養細胞的培養體系來培養人ES細胞的嘗試中，使用了添加新鮮培養基和生長因子混合物的MatrigelRTM或層粘連蛋白基質(美國專利申請號20030017589)。可是，上述無飼養細胞基質是來源于動物的組織，因而有可能使人ES細胞暴露于動物性病原體之下。另外，上述試驗中聯合使用了六種不同的生長因子，其濃度非常高，有可能對所培養的細胞造成不可逆轉的損害。事實上，根據美國專利申請號20030017589的描述，ES細胞的倍增時間大約為19個小時，這提示了腫瘤源性表型。此外，在上述培養條件下，在無飼養細胞的培養體系中經過14次傳代后，表現出未分化細胞形態的細胞僅為50-70％。
這樣的培養條件對于研究目的可能是適用的，但如果是應用于人類的細胞置換治療或組織再生，則必須在非常明確的基本上不含動物成分的條件下培養人ES細胞。
在實現本發明的過程中，發明人設計出了不含異源污染物、同時還能使人干細胞在培養中維持至少38次傳代的無飼養細胞的培養條件。正如下面實施例部分所描述的，在上述條件下干細胞系保持了所有ES細胞的特性，包括多能性、不死亡、未分化的增殖能力和正常的核型。因此，本發明的無飼養細胞培養體系首次提供了一種完全無動物成分的培養環境，其能夠使人ES細胞處于增殖狀態同時又保持ES多能性的時間至少維持38次傳代。另外，在上述條件下培養的ES細胞，其中有超過85％的細胞表現出未分化細胞形態，其倍增時間在30-35小時之間。
因此，根據本發明，提供了一種建立能夠維持其未分化、多能性和增殖狀態，并基本上不含異源污染物的人胚胎干細胞系的方法。
在此所使用的短語“干細胞系”指的是這樣的細胞，其能夠分化為具有特殊、專門功能的其它類型的細胞(即“完全分化”的細胞)，或能夠維持未分化狀態的細胞，下文稱為“多能性干細胞”。
本發明的干細胞可以是來自任意年齡個體骨髓組織或新生個體臍帶血的造血干細胞，還可以是來自妊娠后所形成的胚胎組織(如胚泡)的胚胎干細胞(ES)，或者是胚胎生殖細胞(EG)。干細胞的衍生和制備方法將在后面加以描述。本發明優選的干細胞是人胚胎干細胞。
根據本發明的一個方面，實施該方法的過程是獲取人胚胎干細胞，然后在無飼養細胞、包括基質和含有生長因子的組織培養基的培養條件下，培養人胚胎干細胞，從而建立起人胚胎干細胞系。
根據本發明的上述方面，培養過程是將干細胞平鋪到基質上，細胞的密度應當是能夠有利于細胞生存和增殖、同時限制其分化的密度。典型的，所采用的鋪板密度在約15,000細胞/cm2和約200,000細胞/cm2之間。
可以理解，雖然一般采用干細胞的單細胞懸浮液接種，但也可以采用小的細胞簇。對于后者，使用酶消化細胞簇，使細胞簇斷開(參見下面實施例部分的實施例1)，在干細胞完全分散之前終止酶解，然后用洗液管將細胞搗碎，形成細胞團(即10-200個細胞)。但是，需要進行檢測以避免產生巨大的、能夠導致細胞分化的細胞簇。
可以使用公知的細胞培養方法來獲得本發明的干細胞。例如，可以從人胚泡分離出人胚胎干細胞。典型的，人胚泡獲自人體內植入前胚胎或獲自體外受精(IVF)胚胎。可選擇的，可以將單細胞的人胚胎擴展到胚泡階段。為了分離人ES細胞，去掉胚泡上的透明帶，并利用免疫外科手術方法分離內細胞團(inner cell mass，ICM)，其中將滋養外胚層細胞裂解，并用微量吸管將其從完整ICM中去除。然后將TCM平鋪到含有能夠使之長出生長暈的合適條件培養基的組織培養瓶中。9-15天之后，采用物理分離方法或酶降解的方法，將ICM衍生的生長暈分離成細胞團，然后再將細胞平鋪到新鮮的組織培養基上。用微量吸管挑選出表現為未分化形態的克隆，采用物理方法將其分離為細胞團，然后再進行平板培養。將所得到的ES細胞每1-2周進行一次例行分離。要想獲得更加詳細的制備人ES細胞的方法，請參見下述文獻，Thomson等，[美國專利號5,843,780；Science 2821145，1998；Curr.Top.Dev.Biol.38133，1998；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 927844，1995]；Bongso等，[Hum Reprod 4706，1989]；Gardner等，[Fertil.Steril.6984，1998]。
可以理解，根據本發明的上述方面，還可以使用商品化干細胞。可以從NIH人胚胎干細胞登記處購買人ES細胞(http//escr.nih.gov)。商品化的胚胎干細胞系實例包括但不限于BG01、BG02、BG03、BG04、CY12、CY30、CY92、CY10、TE03和TE32。
本發明使用的干細胞還可以衍生自人胚胎生殖(EG)細胞。使用本領域技術人員公知的實驗室技術，從來自人妊娠約8-11周胎兒的原生殖細胞制備人EG細胞。分離生殖嵴，將其切成小塊，然后使用機械分裂方法將其分解為細胞。然后在含有合適條件培養基的組織培養瓶中使EG細胞生長。在培養上述細胞時，每天更換條件培養基，直到出現與EG細胞一致的細胞形態，一般要經過7-30天或1-4次傳代。更加詳細的制備人EG細胞的方法，參見下述文獻，Shamblott等，[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9513726，1998]，和美國專利號6,090,622。
正如上面所提到的，優選使用無飼養細胞體系培養干細胞，該無飼養細胞體系包括的是基質，而不是飼養細胞層。在此所使用的術語“基質”指的是能夠代替飼養細胞實現細胞附著功能的任意基質。典型的，這樣的基質包含可以使干細胞附著的細胞外成分，從而提供合適的培養基層(substrate)。
特別適用于本發明使用的是來自基底膜的細胞外基質成分，或形成粘著分子受體-配體偶聯部分的細胞外基質成分。Matrigel，一種商品化的基質(Becton Dickinson，USA)，是適于本發明使用的一個實例。Matrigel是來自Engelbreth-Holm-Swarm瘤細胞的一種可溶性產品，在室溫下成為凝膠狀，形成一種重構基底膜；Matrigel還是一種生長因子減少的產品。適用于本發明的其它細胞外基質成分和成分混合物包括層粘連蛋白、纖連蛋白、蛋白聚糖、觸覺蛋白(eatactin)、硫酸乙酰肝素等，單獨使用一種或聯合使用幾種。本發明優選的基質是來源于纖連蛋白的基質。
當需要完全不含動物成分的培養條件時，優選人來源的基質或使用重組技術人工合成的基質。例如，這樣的基質包括人來源的纖連蛋白、重組纖連蛋白、人來源的層粘連蛋白、包皮成纖維細胞基質或人工合成的纖連蛋白基質。人來源的纖連蛋白可以是血漿纖連蛋白，或是細胞纖連蛋白，上述兩種纖連蛋白均可以從Sigma，St，Louis，MO，USA購買。人來源的層粘連蛋白和包皮成纖維細胞基質也可以從上述公司購買。人工合成纖連蛋白基質同樣也可以從上述公司購買。
基質蛋白的重組合成可以使用表達載體來進行。將編碼基質蛋白(如人血漿纖連蛋白)的多核苷酸片段連接到市售的、適于轉化哺乳動物細胞如HeLa細胞，并適于指導該酶在轉化細胞中表達的表達載體上。可以理解，可以通過常規的重組技術修飾上述市售載體系統，以取代、復制或突變現有的啟動子或增強子，和/或導入其它附加的多核苷酸序列，如編碼額外選擇標記的序列、或編碼報告多肽的序列，等等。
合適的哺乳動物表達載體包括，但不限于，購自Invitrogen公司的pcDNA3、pcDNA3.1(+/-)、pZeoSV2(+-)、pSecTag2、pDisplay、pEF/myc/cyto、pCMV/myc/cyto、pCR3.1，購自Promega公司的pCI，購自Strategene公司的pBK-CMV，購自Clontech公司的pTRES，以及它們的衍生物。
根據本發明優選的實施方式，培養基包括細胞增殖所需的細胞因子和生長因子[如堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和白血病抑制因子(LIF)]，以及抑制干細胞分化的因子，如轉化生長因子β1(TGFβ1)。
上述培養基可以是添加了血清、血清替代品和/或生長因子的人工合成組織培養基，如KoDMEM(Gibco-Invitrogen Corporationproducts，Grand Island，NY，USA)。
血清可以是任意來源的血清，包括胎牛血清、山羊血清或人血清。為了給人ES細胞培養提供一種不含動物成分的環境，優選使用人血清或血清替代品TM(Gibco-Invitrogen Corporation，Grand Island，NYUSA)。
血清替代品TM包括白蛋白或白蛋白替代品、氨基酸、維生素、鐵傳遞蛋白或鐵傳遞蛋白替代品、抗氧化劑、胰島素或胰島素替代品、膠原前體和微量元素(國際專利
發明者M·阿米特, J·伊特斯科維茨-埃多爾 申請人:技術研究及發展基金有限公司