專利名稱：孤雌激活源性胚胎干細胞系的建立方法
技術領域：
本發明涉及一種孤雌激活源性胚胎干細胞系的建立方法，屬于胚胎干細胞系技術領域。
背景技術：
胚胎干細胞(Embryonic stem cell)也稱ES細胞，是由發育5-7天囊胚的內細胞團細胞 在體外進行傳代擴增而得到的，具有無限增殖和多向分化潛能的特征。人類ES細胞可以在體 外誘導分化成為人體的各種細胞，廣泛應用于醫學臨床和科學研究。但由于ES細胞來源于胚 胎，在某些M家和地區受到宗教、道德和倫理的制約，大大限制了ES細胞的研究發展。
胚胎千細胞目前按來源分有三種正常胚胎來源(絕大多數)、核移植來源和孤雌來源(只 要卵子激活，不需精子受精形成胚胎)。孤雌生殖是在無需精子的條件下，自發或經物理、化 學刺激，使卵母細胞有絲分裂激活，而形成胚胎，并可繼續發育至成熟而產生后代，即無雄 性配子的任何作用，由雌性配子產生胚胎。最近有文獻報道,孤雌生殖的胚胎干細胞同樣具有 無限增殖和多向分化潛能，它與胚胎來源的ES細胞一樣，可在體外誘導分化成機體的各種細 胞。這樣一來，若能建立孤雌生殖胚胎干細胞系，就可避免胚胎來源的ES細胞導致的宗教、 道德、倫理上的爭議，為ES細胞的來源提供了一個新的途徑。現有的孤雌激活源性胚胎干細 胞系的建立技術流程--般是促排卵——取卵——化學激活——胚胎培養一一分離內細胞團細 胞^~擴增——傳代。記載孤雌激活源性胚胎干細胞系的建立情況的現有文獻有-
1. 1983年2月《胚胎實驗形態學(J Embryol Exp Morphol)》雜志發表的《來自鼠單 倍體胚胎多能干細胞系的建立》(Establishment of pluripotential cell lines fromh即loid mouse e油ryos.),采用小鼠卵，用7%的酒精激活。
2. 2002年2月《科學(Science)》雜志發表的《非人靈長類單性生殖干細胞系》 (Parthenogenetic stem cells in nonhuman primates.)雜志，采用猴子卵，激活是應用
鈣離子載體A23187處理8分鐘和6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)處理4小時。
3. 2007年2月《干細胞》(Stem Cells)雜志發表的《兔胚胎干細胞系的建立和鑒定》 (Generation and characterization of rabbit embryonic stem cells), 采用兔子卵。
4. 2003年21 (2)丄52-61《干細胞(Stem Cells)》雜志發表的《來源于二級卵母細胞 中期純合子的多能干細胞系》(Multilineage potential of homozygous stem cells derived from raetaphase II oocytes),采用小鼠卵，激活是應用鈣離子載體A23187處理5分鐘和 6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)處理3小時。
5. 2007年9(3):432-49《來源于人單性生殖囊胚的患者特異性干細胞系》 (Patient-specific stem cell lines derived from human parthenogenetic blastocysts). 《克隆干細胞(C]oning Stem Gelis)》雜志，采用人卵。
以上文獻均采用免疫外科法分離內細胞團，免疫反應容易損傷內細胞團細胞，使其活力 下降，耗時長，不利于保護細胞，囊胚率較低。
發明內容
本發明針對現有孤雌激活源性胚胎干細胞系建立技術存在的問題，提供一種孤雌激活源 性胚胎干細胞系的建立方法。本發明的孤雌激活源性胚胎干細胞系的建立方法包括以下步驟
(1) 以孕馬血清促性腺激素(PMSG)作用于雌性動物體，進行超促排卵；
(2) 取卵后應用鈣離子載體A23187和6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)對其進行化學激活 以80u/ml透明質酸酶消化半分鐘，先用人類輸卵管液(human tubalfluidmedium， HTF) 洗3遍，再置于含5umol/L鈣離子載體A23187的人類輸卵管液中，37。C避光放置5分鐘， 再以人類輸卵管液(HTF)洗滌3次后，置于含10wg/ral嘌呤霉素的HTF中，在37'C、 5% C02培養箱中培養4小時進行激活處理，將激活發育的胚胎體外培養至囊胚；
(3)機械法分離內細胞團細胞，在37'C溫臺、避光及保持濕潤的條件下，以細針直接刺 破胚胎囊胚，將內細胞團剝離出來，在鋪有飼養層細胞的培養皿中傳代、擴增培養，建立穩 定的動物孤雌激活ES細胞系。
上述方法適用于各種動物體的孤雌激活源性胚胎干細胞系的建立。
本發明的孤雌激活ES細胞與胚胎來源的ES細胞一樣，能夠在體外可被誘導分化為全身 各種組織細胞，激活處理的效果好，囊胚率可高達96.5%,高于現有的文獻報道，以針刺的 機械法分離內細胞團細胞，避免了免疫反應對內細胞團細胞的損傷，而且耗時短，減少細胞 在培養箱外的暴露時間，最大程度的保護了細胞。本發明不但避免因破壞胚胎所帶來的各種 倫理問題，還能解決胚胎來源ES細胞應用中的免疫原性問題，拓展了 ES細胞的來源和研究 范疇。
圖丄是雌性昆明小鼠的卵母細胞圖。 圖2是激活發育的昆明小鼠2細胞胚胎圖。 圖3是激活發育的昆明小鼠4細胞胚胎圖。 圖4是胚胎體外培養的囊胚圖。 圖5是內細胞團細胞圖。
圖6是雌性昆明小鼠第37代孤雌胚胎干細胞(PGES)圖。 圖7是PGES表達特異性指標SSEA-4圖。 圖8是P(;ES表達特異性指標oct-4圖。 圖9是PGES細胞的純和性鑒定圖。 圖IO是PGES細胞的染色體鑒定(40， XX)圖。 圖11是PGES細胞的體外分化擬胚體圖。 圖12是PGES細胞的體外分化血管樣結構圖。 圖13是PGES細胞的體內分化肌肉組織圖。 圖14是PGES細胞的體內分化原始神經細胞圖。 圖15是PGES細胞的體內分化腺上皮細胞圖。
具體實施例方式
以昆明小鼠為例，本發明的孤雌激活源性胚胎干細胞系的建立技術流程是雌性昆明小 鼠超促排卵~"^取卵——應用鈣離子載體A23187和6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)對其進行 化學激活——機械法分離內細胞團細胞一一將內細胞團細胞置于事先鋪好飼養層細胞的培養
皿中——擴增_一-傳代——鑒定。具體步驟如下。1. 以孕馬血清促性腺激素(PMSG)作用于雌性昆明小鼠，進行超促排卵，雌性昆明小鼠 的卵母細胞如圖1.所示。
2. 取卵后應用鈣離子載體A23187和6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)對其進行化學激活 以80u/ml透明質酸酶消化半分鐘，先用人類輸卵管液(human tubalfluidmedium， HTF) 洗3遍，再置于含5"mo1/L鈣離子載體A23187的人類輸卵管液中，37'C避光放置5分鐘。 再以HTF洗滌3次后，置于含lOu g/ml嘌呤霉素的HTF中，在37。C、 5%0)2培養箱中培養 4小時進行激活處理。激活發育的2細胞昆明小鼠胚胎如圖2所示，激活發育的昆明小鼠的4 細胞胚胎如圖3所示。
再以胚胎培養液G1(瑞典的vitrolife公司)進行胚胎培養，胚胎分裂為8細胞后換液， 以G2(同前)繼續培養至囊胚階段。激活發育的胚胎體外培養的囊胚如圖4所示，上述方法培 養的囊胚率為96.5%,高于現有的文獻報道。
3. 將激活發育的胚胎體外培養至囊胚后，以機械法分離內細胞團細胞(內細胞團細胞如 圖5所示)，就是在37"C溫臺、避光及保持濕潤的條件下，以中醫所用針灸的細針直接刺破 胚胎，將內細胞團剝離出來。
4. 在鋪有飼養層細胞(昆明小鼠胚胎的成纖維細胞，經絲裂霉素處理后停止增殖，即不 消耗培養液的營養成分，只分泌利于干細胞生長的各種因子)的培養皿中傳代、擴增培養， 建立穩定的小鼠孤雌激活ES細胞系。
圖6給出了昆明小鼠第37代孤雌胚胎干細胞(PGES)。圖7給出了昆明小鼠第37代PGES 的表達特異性指標SSEA-4，圖8給出了 PGES表達特異性指標oct-4，圖7和圖8的胚胎干細 胞特異性指標的表達，證明該細胞是胚胎干細胞。圖9給出了PGES細胞的純和性鑒定，證明 是孤雌激活來源的。圖IO給出了 PGES細胞的染色體鑒定(40， XX)。圖11給出了PGES細 胞體外分化的擬胚體，圖12給出了 PGES細胞體外分化的血管樣結構圖。
PGES細胞體內分化，即將細胞打到裸鼠皮下，形成畸胎瘤，病理切片檢測發現包含3個 胚層的組織，證明PGES細胞的多向分化潛能。圖13給出了 PGES細胞體內分化的肌肉組織， 圖14給出了 PGES細胞體內分化的原始神經細胞圖，圖15給出了 PGES細胞體內分化的腺上 皮細胞。
權利要求
1. 一種孤雌激活源性胚胎干細胞系的建立方法，其特征是包括以下步驟(1)以孕馬血清促性腺激素(PMSG)作用于雌性動物體，進行超促排卵；(2)取卵后應用鈣離子載體A23187和6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)對其進行化學激活以80μ/ml透明質酸酶消化半分鐘，先用人類輸卵管液(human tubalfluidmedium，HTF)洗3遍，再置于含5μmol/L鈣離子載體A23187的人類輸卵管液中，37℃避光放置5分鐘，再以人類輸卵管液(HTF)洗滌3次后，置于含10μg/ml嘌呤霉素的HTF中，在37℃、5％CO2培養箱中培養4小時進行激活處理，將激活發育的胚胎體外培養至囊胚；(3)機械法分離內細胞團細胞，在37℃溫臺、避光及保持濕潤的條件下，以細針直接刺破胚胎囊胚，將內細胞團剝離出來，在鋪有飼養層細胞的培養皿中傳代、擴增培養，建立穩定的動物孤雌激活ES細胞系。
全文摘要
本發明提供了一種孤雌激活源性胚胎干細胞系的建立方法，包括以下步驟以孕馬血清促性腺激素(PMSG)作用于雌性動物體，進行超促排卵；取卵后應用鈣離子載體A23187和6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)對其進行化學激活，將激活發育的胚胎體外培養至囊胚；機械法分離內細胞團細胞，以細針直接刺破胚胎囊胚，將內細胞團剝離出來，在鋪有飼養層細胞的培養皿中傳代、擴增培養，建立穩定的動物孤雌激活ES細胞系。本發明激活處理的效果好，囊胚率可高達96.5％，以針刺的機械法分離內細胞團細胞，避免了免疫反應對內細胞團細胞的損傷，而且耗時短，減少細胞在培養箱外的暴露時間，最大程度的保護了細胞，解決了胚胎來源ES細胞應用中的免疫原性問題。
文檔編號C12N5/06GK101429493SQ20081023833
公開日2009年5月13日 申請日期2008年12月15日 優先權日2008年12月15日
發明者晴 宦, 凱 徐, 彥 王, 錢德儉, 陳子江, 多 韋, 選 高 申請人:彥 王