一種改進的SD大鼠克羅恩病造模方法與流程

本發明屬于動物疾病模型
技術領域：
，具體地，涉及一種改進的SD大鼠克羅恩病造模方法，該方法可更好地用于初篩治療克羅恩病的藥物。
背景技術：
：克羅恩病（Crohn’sdisease,CD）是一種主要由免疫反應失調引起的胃腸道慢性肉芽腫性炎癥性疾病。目前在我國，其發病率呈逐年升高趨勢，腸道的慢性炎癥及損傷可導致腸纖維化乃至腸梗阻等嚴重并發癥的發生。目前，CD治療尙缺乏特異有效的藥物，因此，探討CD的發病機制，以尋求新型治療靶點的研究成為熱門方向。三硝基苯磺酸（TNBS）與乙醇合用進行動物克羅恩病（Crohn’sDisease,CD）造模是目前研究CD的常用模型。該模型的機制是乙醇破壞腸黏膜屏障，TNBS作為一種有機酸半抗原滲入結腸組織，與組織蛋白等高分子物質結合，形成全抗原，使T淋巴細胞致敏，溶解與半抗原結合的動物自身細胞，引起腸壁一系列免疫應答和炎癥反應，隨著組織的逐漸修復，可出現一系列腸壁的增生性改變。該法的優點是炎癥癥狀與人類CD相似，而且可以維持較長時間，方法簡便，重復性也較好。但缺點是無急性期表現，動物的死亡率較高。因此，如何在現有克羅恩病研究模型上加以改進，提供更安全更有效的動物疾病模型就顯得尤為重要。技術實現要素：本發明所要解決的技術問題是克服現有技術中克羅恩病模型的缺陷和不足，提供一種改進的SD大鼠克羅恩病造模方法，使該模型符合臨床人類疾病特征，且造模成功率高，動物死亡率低；該改進模型可用于研究克羅恩病的發病機制以及篩選該病的治療藥物。本發明的目的是提供一種改進的SD大鼠克羅恩病造模方法。本發明的上述目的是通過以下技術方案給予實現的。本發明前期研究結果表明，影響造模成功率和動物死亡率的因素主要是手術操作和造模藥TNBS劑量及造模溶液配比的選擇。因此，本發明通過對造模液配比的選擇來尋求更安全有效的動物模型。一種改進的SD大鼠克羅恩病造模方法，所述方法具體包括如下步驟：將SD大鼠禁食，麻醉后，將造模藥物灌腸，在導入造模藥物后采取頭低尾高的體位，防止灌注液體外溢，并倒提大鼠1～2min；所述造模藥物為5%的TNBS水溶液與無水乙醇按1:1體積比混合；所述造模藥物的劑量為50mg/kg。優選地，所述SD大鼠的禁食時間為24小時。優選地，所述麻醉為用8～10%水合氯醛按0.3ml/l00g腹腔注射。優選地，所述灌腸為用灌胃針自肛門插入距肛門6～8cm處，灌入造模藥物。優選地，在灌腸之前用PBS緩沖液清洗腸道。另外，上述造模方法在研究克羅恩病中的應用亦在本發明保護范圍內。與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：（1）本發明所述模型符合臨床人類克羅恩病特征：腹瀉、血便、腸梗阻及體重減輕，結腸潰瘍并且腸管與腸管、腸管與臟器或組織之間發生粘連和膿腫；（2）本發明所述方法造模成功率高；（3）本發明所述造模方法動物死亡率低；（4）本發明所述造模方法簡便，重復性較好。附圖說明圖1為實施例1建立的造模組與對照組大鼠體質量變化圖。圖2為實施例1建立的造模組與對照組大鼠DAI評分。圖3為實施例1建立的對照組大鼠結腸組織病理圖。圖4為實施例1建立的造模組大鼠結腸組織病理圖。具體實施方式下面結合說明書附圖和具體實施例對本發明作出進一步地詳細闡述，所述實施例只用于解釋本發明，并非用于限定本發明的范圍。下述實施例中所使用的試驗方法如無特殊說明，均為常規方法；所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從商業途徑得到的試劑和材料。實施例1改進的SD大鼠克羅恩病造模方法1.造模藥配制取一定體積5%TNBS水溶液與等體積無水乙醇混勻，置于4℃保存待用。2.造模方法（1）SD大鼠體重160g～220g，造模前禁食24h。（2）造模前稱重并記錄體重，腹腔內注射0.3ml/l00g10%水合氯醛麻醉后，注入PBS清洗腸道。（3）將灌胃針自肛門插入距肛門8cm處，灌入造模藥物50mg/kg（5%TNBS與無水乙醇按1:1體積比混合，0.2ml/100g體質量）。在導入造模藥液后采取頭低尾高的體位，防止灌注液體外溢，并倒提大鼠1～2min。對照組SD大鼠以同體積生理鹽水灌腸。（4）造模后大鼠平躺，自然清醒，常規飼養。（5）考察造模成功率，觀察指標如下：一般情況觀察和記錄每天記錄大鼠進食、毛色、活動情況、稱量和記錄大鼠體質量、記錄評價大便性狀：正常大便，成形大便；腹瀉，松散大便或是稀便，不粘附于肛門的糊狀、半成形大便或是可粘附于肛門的稀水樣便。肉眼觀察大便隱血情況。體重變化如圖1所示。按照Murthy等制定的標準進行DAI評分，評分標準見表1，評分結果如圖2所示。結腸標本大體觀察與評分取出距肛門10cm的結腸組織，沿腸系膜縱行切開，用冰生理鹽水沖洗，將黏膜向上展開，觀察豁膜損傷，并按照Walloce和Keenan1990年的評分標準進行結腸黏膜的大體損傷評分，見表2。組織切片觀察與記錄觀察大鼠腸道粘膜改變（光鏡下，HE染色），與空白對照組比較，記錄組織學評分：將石蠟標本經4m連續切片后常規HE染色，觀察形態學改變。對照組和造模組組織病理切片圖如圖3、4所示。根據Cooper等的研究觀察組織學改變并評分，見表3，平均觀察3個100倍視野，取平均值。表1TNBS誘導大鼠IBD的DAI評分標準體重下降（%）糞便性狀便血評分0正常無便血01-5%稀便無便血15-10%稀便少量210-15%腹瀉少量3>15%腹瀉大量4DAI=（體重下降分數+糞便性狀分數+便血分數）/3正常糞便：成形的顆粒狀糞便稀便：不會粘在肛門上的糊狀便腹瀉：粘在肛門上的水樣便表2大體標本形態評分標準大體標本形態表現評分無炎癥和潰瘍0局部充血但無潰瘍1潰瘍但無充血21處潰瘍及炎癥32處或2處以上潰瘍及炎癥4潰瘍延伸超過2cm5表3組織學評分標準組織學光鏡下表現評分正常結腸黏膜0為隱窩腺體丟失1/31為隱窩腺體丟失2/32為隱窩腺體全部丟失，黏膜上皮完整,伴有輕度炎性細胞浸潤3黏膜上皮糜爛、破壞，伴有明顯炎性細胞浸潤43.結果對照組SD大鼠精神佳，進食飲水量正常，排黃色成形軟便。試驗組SD大鼠灌腸24h后精神狀態一般，食欲下降，出現腹瀉、血便、腸梗阻及體重減輕，結腸潰瘍并且腸管與腸管、腸管與臟器或組織之間發生粘連和膿腫，與臨床人類克羅恩病特征接近，且生存率高。實施例2改進的SD大鼠克羅恩病造模方法1.造模藥配制取一定體積1%TNBS水溶液與等體積無水乙醇混勻，置于4℃保存待用。2.造模方法（1）SD大鼠體重160g～220g，造模前禁食24h。（2）造模前稱重并記錄體重，腹腔內注射0.3ml/l00g10%水合氯醛麻醉后，注入PBS清洗腸道。（3）將灌胃針自肛門插入距肛門8cm處，灌入造模藥物50mg/kg（1%TNBS與無水乙醇按1:1體積比混合，0.2ml/100g體質量）。在導入造模藥液后采取頭低尾高的體位，防止灌注液體外溢，并倒提大鼠1～2min；對照組SD大鼠以同體積生理鹽水灌腸。（4）造模后大鼠平躺，自然清醒，常規飼養。（5）考察造模成功率，觀察指標和實施例1一致。3.結果對照組SD大鼠精神佳，進食飲水量正常，排黃色成形軟便。試驗組SD大鼠灌腸24h后精神狀態一般，食欲下降，但腸道和粘膜形態及組織結構均正常，未表現出克羅恩病癥狀。實施例3改進的SD大鼠克羅恩病造模方法1.造模藥配制取一定體積10%TNBS水溶液與等體積無水乙醇混勻，置于4℃保存待用。2.造模方法（1）SD大鼠體重160g～220g，造模前禁食24h。（2）造模前稱重并記錄體重，腹腔內注射0.3ml/l00g10%水合氯醛麻醉后，注入PBS清洗腸道。（3）將灌胃針自肛門插入距肛門8cm處，灌入造模藥物50mg/kg（5%TNBS與無水乙醇按1:1體積比混合，0.1ml/100g體質量）。在導入造模藥液后采取頭低尾高的體位，防止灌注液體外溢，并倒提大鼠1～2min；對照組SD大鼠以同體積生理鹽水灌腸。（4）造模后大鼠平躺，自然清醒，常規飼養。（5）考察造模成功率，觀察指標和實施例1一致。3.結果對照組SD大鼠精神佳，進食飲水量正常，排黃色成形軟便。試驗組SD大鼠灌腸24h后精神狀態較差、厭食、懶動、消瘦，部分大鼠排粘液膿血便，結腸潰瘍并且腸管與腸管、腸管與臟器或組織之間發生粘連和膿腫，伴有明顯炎性細胞浸潤，生存率低。當前第1頁1 2 3