專利名稱：一種建立大鼠葡萄膜炎模型的方法
技術領域：
本發明涉及建立大鼠葡萄膜炎模型的方法，具體涉及采用霍亂弧菌內毒素建立大鼠葡萄膜炎模型的方法。
背景技術：
葡萄膜炎(EIU)是一種常見的眼部炎癥，易反復發作且牽涉到眼內多種組織，其具體發病機制目前尚不清楚，因此有必要建立合適的動物模型以進行研究。已有研究表明， 內毒素注射可以誘導動物的實驗性葡萄膜炎。內毒素誘導的葡萄膜炎動物模型已成為人們研究葡萄膜炎重要的動物模型，它對人們了解葡萄膜炎的發病機制及治療葡萄膜炎做出了重要貢獻。細菌內毒素(endotoxin)首先由Broivin等于1933年用三氯醋酸自鼠傷寒桿菌中提出。當時因一般蛋白質反應呈陰性，故稱為“脂多糖”(Lipopolysaccharide，LPS)抗原，后人稱為Borirn型抗原。細菌內毒素主要由革蘭氏陰性菌產生，存在于細菌細胞內，為細胞壁結構成份，細菌細胞崩解時才釋放出來。化學成分主要為磷脂-多糖-蛋白質復合物。我們曾對6種革蘭氏陰性菌內毒素誘導大鼠葡萄膜炎模型，結果只有霍亂弧菌內毒素誘導成功率高，并且以18001株，古典生物型，小川血清型的霍亂弧菌內毒素誘導大鼠葡萄膜炎的方法報道的比較多。其中《眼科新進展》2002年12月第22卷第6期，本發明的發明人盧弘發表的“霍亂弧菌內毒素誘導大鼠葡萄膜炎的組織切片研究”中報道了霍亂弧菌內毒素誘導的葡萄膜炎模型，該發明中采用LPS與PBS和完全福氏佐劑(或稱弗氏佐劑)、LPS與PBS和百日咳兩種配方作為誘導劑，其中LPS與PBS和完全福氏佐劑用于足墊部的注射，每只0. 4ml ；LPS 與PBS和百日咳用于腹腔注射，每只0. 15ml。免疫佐劑是指與抗原同時或預先應用，能促進、延長或增強對抗原特異性免疫應答的物質。弗氏佐劑(Freimd’ sadjuvant, FA)是目前動物實驗中最常用的佐劑，分為不完全弗氏佐劑(FIA)和完全弗氏佐劑(FCA)。不完全弗氏佐劑是液體石蠟與羊毛脂混合而成， 組分比為1-5 1，可根據需要而定，通常為2 1。不完全佐劑中加卡介苗(最終濃度為 2-20mg/ml)或死的結核分枝桿菌，即為完全弗氏佐劑。FCA是標準的誘生體液免疫和細胞免疫的佐劑，它誘導I型輔助T細胞(T helpercell ；Thl型)細胞因子，而FIA則是典型的只誘導Th2型細胞因子誘生抗體的佐劑。免疫佐劑作用機理免疫系統受到抗原物質刺激后，抗原可被抗原提呈細胞如巨噬細胞、樹突狀細胞攝取，加工處理，降解為多肽片斷，通過主要組織相容性復合物(major histocompatibility complex ;MHC)或MHC類分子途徑提呈給T淋巴細胞。T淋巴細胞被激活、復制、增殖、分化，成為效應T淋巴細胞，主要包括CTL和⑶4+Th細胞。前者分泌細胞毒素及誘導細胞凋亡以殺死帶抗原的靶細胞；后者受細胞因子、抗原特性等因素的影響，向 Thl細胞或Th2細胞分化。Thl細胞偏向分泌白介素-2 (IL-2)、干擾素-γ (IFN-γ)，與介導遲發型超敏反應的TDTH細胞和CTL細胞的增殖、分化、成熟有關，可促進細胞介導的免疫應答，也可輔助特異性IgGh亞類抗體的產生，即Thl應答。Th2細胞偏向分泌IL-4、IL-5、 IL-6、IL-10與B細胞增殖、成熟和促進IgGl亞類和IgE抗體生成有關，可增強抗體介導的免疫應答，即Th2應答[本實驗中百日咳桿菌的作用是第二佐劑。在實驗性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveoretinitis,EAU)模型中必須加用第二佐劑才能誘導出炎癥。用弗氏完全佐劑和百日咳桿菌作為LPS的佐劑誘導葡萄膜炎進行葡萄膜炎發病機制的研究有許多混雜因素。為了克服現有模型的缺點，使得該模型更符合倫理學要求，發明人提到了進行了大量的試驗，最終確定本發明。
發明內容
本發明的目的是提供一種霍亂弧菌內毒素誘導的大鼠葡萄膜炎模型的建立方法。本發明提供的一種建立大鼠葡萄膜炎模型的方法，包括以下步驟1)大鼠選用6-8周齡，180-200g, SPF級封閉群雄性Wistar大鼠；2)腹腔注射150_400μ g霍亂弧菌內毒素，誘導的模型即為大鼠葡萄膜炎模型。本發明提供的霍亂弧菌內毒素誘導的大鼠葡萄膜炎模型具有以下優勢1、該模型臨床及組織學特征穩定，重復性好，誘導成功率高可以達到100% ；2、本發明提供的模型為進一步研究EIU發病機制提供了重要工具；3、避免因以往弗氏佐劑造成對研究中的干擾現象；4、WiStar大鼠國內購買資源方便，便捷、符合標準；目前國內實驗用大鼠大部分為SPF級(即無特定病原體動物)，此級別可以滿足絕大部分實驗用途；鑒于急性前葡萄膜炎的臨床特點，幼年鼠或老齡鼠有可能對模型有影響，因此選擇成年大鼠誘導模型。另外成年鼠各系統已發育成熟，誘導葡萄膜炎模型較穩定，6-8周齡的Wistar大鼠為成年大鼠，此周齡的大鼠體重大約在180-200g ；5、本研究表明單獨使用霍亂弧菌內毒素(18001株，古典生物型，小川血清型)腹腔注射成功地誘導出的模型與臨床可見的急性前葡萄膜炎相類似，發病迅速，眼前節受累為主，為臨床研究、預防和治療提供了重要的參考模型；6、腹腔注射較以往常規的足底注射更符合倫理學、及SCI雜志對動物實驗的要求。
圖1 內毒素誘導的葡萄膜炎的臨床表現注射LPS后M小時，箭頭顯示瞳孔區滲出膜；圖2 注射LPS后M小時組織學改變(HE 200X)。后房內大量炎性細胞滲出(箭頭)。Lens 晶狀體；i 虹膜；cor 角膜；cb 睫狀體；圖3 注射LPS后M小時組織學改變(HE 200X)。前房內大量炎性細胞浸潤。 Lens 晶狀體；cor 角膜；
圖4 注射LPS后M小時組織學改變(HE 400X)。前房內大量炎性細胞滲出(箭頭)° ac 前房；cor 角膜；圖5 內毒素誘導的葡萄膜炎前房血性滲出，瞳孔區白色滲出；圖6 急性前葡萄膜炎前房積膿；圖7 前房、后房的炎性細胞浸潤；圖8 不同方法誘導的前葡萄膜炎臨床分級評分其中1為100μ g組配方1腹腔注射0. Iml ；2為150 μ g組配方1腹腔注射0. 15ml ；3為300 μ g組配方1腹腔注射 0. 3ml ；4為400 μ g組配方1腹腔注射0.;5為500 μ g組配方1腹腔注射0. 5ml ；6為 LPS+完全佛氏佐劑組配方2腹腔注射0. 2ml ;7為LPS+完全佛氏佐劑+百日咳桿菌組腹腔注射配方10. 12ml，配方3腹腔注射0. 15ml ；8為正常對照組腹腔滅菌生理鹽水0. 2mL·
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。實驗例1 1、實驗藥物180-20(^，6-8周齡5 級封閉群雄性衍計￡11~大鼠，由北京維通利華實驗動物技術有限公司中心提供。2、實驗材料霍亂弧菌內毒素(LPQ和百日咳桿菌溶液購自蘭州生物制品研究所；完全弗氏佐劑(FCA)購自Sigma, St. Louis, MO。3、實驗分組將大鼠隨機分為4組，每組6只其中LPS組給予200 μ g LPS腹腔注射；LPS+佐劑組給予200 μ g LPS和弗氏完全佐劑FCA 0. Iml腹腔注射；LPS+佐劑組+百日咳組LPS 200 μ g+百日咳桿菌2 μ g腹腔注射，足墊部注射弗氏完全佐劑0. 06ml ；正常對照組腹腔注射滅菌生理鹽水。4、實驗方法按照分組的要求注射相關藥物。5、檢測結果每隔2小時進行裂隙燈顯微鏡檢查，詳細記錄發病眼數、發病時間、 高峰時間、疾病嚴重程度和疾病持續時間，對臨床觀察進行炎癥分級，并行病理組織學觀察，觀察炎癥細胞浸潤及滲出情況。6、結果6. 1炎癥反應除正常對照組外，其余3組注射LPS后大鼠眼部均出現一系列臨床可見的炎癥反應，其癥狀(見圖5:內毒素誘導的葡萄膜炎前房血性滲出，瞳孔區白色滲出。) 與急性前葡萄膜炎的臨床表現(見圖6 急性前葡萄膜炎前房積膿。)一致。6. 2LPS組大鼠常規切片HE染色病理學檢查結果與臨床表現一致。6. 3 24小時組織學檢查可見角膜內皮后中性粒細胞團塊狀粘附；前房、后房均可見大量炎性細胞浸潤及纖維蛋白性滲出；虹膜血管擴張，虹膜睫狀體內有多數炎性細胞浸潤，基質增厚，上皮細胞破壞，失去正常結構，玻璃體腔有少量炎癥細胞(如圖7所示)。實驗例2
5
1、實驗藥物180-20(^，6-8周齡5 級封閉群雄性衍計￡11~大鼠，由北京維通利華實驗動物技術有限公司中心提供。2、實驗材料霍亂弧菌內毒素(LPQ和百日咳桿菌溶液購自蘭州生物制品研究所；完全弗氏佐劑(FCA)購自Sigma, St. Louis, MO。3、實驗分組將LPS溶于滅菌生理鹽水中，分別配制成以下幾種配方配方1 lmg/ml LPS 溶液 2ml ；配方2 :2mg/ml LPS溶液^il+完全佛氏佐劑2ml ；配方3 0. 5mg/ml LPS溶液Iml+百日咳桿菌溶液12 μ 1。按照分組分別對各組大鼠給予以下處理1) LPS組配方1腹腔注射0. 2ml ；2) LPS+完全佛氏佐劑組配方2腹腔注射0. 2ml ；3) LPS+完全佛氏佐劑+百日咳桿菌組腹腔注射配方10. 12ml，配方3腹腔注射 0. 15ml ； 4)正常對照組腹腔滅菌生理鹽水0. 2ml。4、實驗方法按照分組的要求注射相關藥物。5、監測指標5. 1臨床觀察免疫大鼠后每隔2小時進行裂隙燈顯微鏡檢查，詳細記錄發病眼數、發病時間、高峰時間、疾病嚴重程度和疾病持續時間，并根據Lajavardi L的標準對大鼠臨床表現進行臨床評價與記分，其中0 =無炎癥；1 =輕度虹膜和結膜血管擴張；2 =中度虹膜和結膜充血及中度前房閃輝；3 =重度虹膜充血并前房閃輝；4 =除嚴重虹膜充血前房閃輝外出現瞳孔區纖維素滲出。5. 2組織學檢查LPS免疫大鼠后M小時過量戊巴比妥鈉(100mg/kg)處死大鼠，摘取眼球放置于福爾馬林溶液中固定M小時，固定后組織浸入50%乙醇溶液中1小時，洗去固定液，依次浸入 75%、80%、90%、100%乙醇溶液中各脫水1小時，二甲苯處理30分鐘，浸蠟1小時X 3，包埋，切成4 μ m厚切片，蘇木素-伊紅染色，光鏡下觀察。6、結果6. 1臨床觀察除正常對照組外，其余3組注射LPS后大鼠眼部均出現一系列臨床可見的炎癥反應，其癥狀與急性前葡萄膜炎的臨床表現一致。LPS注射后4小時開始出現結膜水腫，睫狀充血，虹膜血管迂曲擴張。6-8小時虹膜血管擴張更明顯，12-16小時出現前房閃輝與細胞，瞳孔縮小，虹膜紋理模糊。隨著時間推移，這些臨床表現逐漸加重，22- 小時所有LPS免疫大鼠均達到炎癥反應的高峰，表現為瞳孔顯著縮小，瞳孔緣處出現纖維素樣滲出，甚至瞳孔膜閉，晶體前囊有灰白色絮狀沉著物 (見圖1)。然后炎癥開始逐漸減輕，第48小時前房纖維素樣滲出部分吸收，但仍有前房閃輝。臨床評分結果見表1 表1 :LPS免疫大鼠后不同時間點的臨床評分
權利要求
1.一種建立大鼠葡萄膜炎模型的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟1)大鼠選用6-8周齡，180-200g,SPF級封閉群雄性Wistar大鼠；2)腹腔注射150-400μg霍亂弧菌內毒素，誘導的模型即為大鼠葡萄膜炎模型。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述霍亂弧菌內毒素選自18001株。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述霍亂弧菌內毒素選自古典生物型、小川血清型。
全文摘要
本發明涉及一種建立大鼠葡萄膜炎模型的方法，包括以下步驟1)大鼠選用6-8周齡，180-200g，SPF級封閉群雄性Wistar大鼠；2)腹腔注射150-400μg霍亂弧菌內毒素，誘導的模型即為大鼠葡萄膜炎模型。該方法建立的動物模型臨床及組織學特征穩定，重復性好，誘導成功率高，且采用腹腔注射較以往常規的足底注射更符合倫理學及SCI雜志對動物實驗的要求。
文檔編號A61K49/00GK102166344SQ201110096610
公開日2011年8月31日 申請日期2011年4月18日 優先權日2011年4月18日
發明者盧弘, 張偉, 陳巍 申請人:首都醫科大學附屬北京朝陽醫院