一種pH響應和腫瘤靶向的雙載藥納米粒子及制備方法與應用與流程
本發明涉及一種ph響應和腫瘤靶向的雙載藥納米粒子及制備方法與應用。
背景技術：
近年來，癌癥成為臨床上一類主要的致死疾病，一般的腫瘤療法主要包括手術治療、化學治療和放射治療等。盡管這些療法目前依然是臨床上較為有效的方法，它們的一些不足之處也值得注意：侵入性的治療手段以及各種毒副作用常常給病人帶來較大痛苦；傳統的給藥方式使得小分子藥物在體內隨機分布，不能有效富集在腫瘤部位，而大量用藥又會帶來抗藥性；這些治療手段不能區分正常細胞與腫瘤細胞，使得體內隨機分布的藥物在殺傷腫瘤細胞的同時對其他正常細胞造成損害。
基于靶向納米載體的藥物遞送是一種克服傳統療法缺點的重要策略，它通過連接靶向配體的納米載體將其負載的抗腫瘤藥物精準地遞送到腫瘤組織并實現藥物的控制釋放。靶向納米藥物有如下優點：基于納米載體有效增加疏水性藥物的溶解度；通過親水性基團的修飾來延長藥物在體內的循環時間；借助靶向配體改善藥物在體內的生物分布。采用這一策略使得藥物能夠富集在腫瘤組織并且特異性地殺傷腫瘤細胞，提高療效的同時減少毒副作用。同時，聚合物納米粒子是一類可生物降解的材料，具有良好的生物相容性，被廣泛應用于藥物載體。因此，靶向聚合物納米藥物載體具有提高療效的前景以及實現的可能性。
納米粒子表面的靶向分子修飾是其中的關鍵技術，直接在納米粒子表面修飾以及預先制備聚合物-靶向分子共聚物的方法具有以下缺點：采用的偶聯劑、催化劑等需要通過復雜的純化過程予以剔除；復雜的反應機理大大增加了合成的難度，降低了方法的通用性。聚多巴胺是一種具有良好生物相容性并且可以粘附在多種材料表面的表面改性劑。基于michaladdition或schiffbasereactions，具有氨基或巰基的靶向分子可以在堿性條件下方便地連接到粘附在納米粒子表面的聚多巴胺分子上從而實現靶向納米粒子的制備。這種方法可以實現靶向納米粒子的簡單并且通用的制備工藝。
葉酸受體介導的靶向給藥主要是以葉酸受體為靶點，通過葉酸與腫瘤細胞表面過表達的葉酸受體特異性結合，進而將藥物載體內吞進入細胞。研究表明，葉酸受體在包括乳腺癌、宮頸癌、肺腺癌、子宮內膜癌和卵巢癌等在內的多種惡性腫瘤表面均過表達，有時可比正常組織高出100～300倍。因此，葉酸受體介導的納米藥物可以適用于包括乳腺癌和宮頸癌在內的多種惡性腫瘤的治療。
兒茶酚和硼酸在中性或堿性條件下會生成穩定地共價相連的結構，同時該結構在酸性條件下會裂解為兒茶酚與硼酸，具有可逆性，這一過程如下圖所示。由于聚多巴胺分子上充足的兒茶酚基團以及具有硼酸結構的抗癌藥物硼替佐米(btz)，可以設計如下載藥策略：在中性或堿性條件下聚多巴胺表面修飾的載藥納米粒子可以負載硼替佐米，在中性的血液循環中聚多巴胺與硼替佐米穩定結合有效抑制了藥物的活性，在酸性的腫瘤組織中釋放藥物并殺傷腫瘤細胞。該策略能夠同時達到雙載藥與ph響應的效果，可以大大提高療效。
技術實現要素：
本發明提供一種ph響應和腫瘤靶向的雙載藥納米粒子及其制備方法與應用。
具體地，本發明一個方面提供了一種ph響應和腫瘤靶向的雙載藥納米粒的制備方法，其包括如下步驟：
(1)制備載疏水性藥物的聚合物納米粒；
(2)以聚多巴胺修飾載疏水性藥物的聚合物納米粒；
(3)以主動靶向配體對聚多巴胺修飾載疏水性藥物的聚合物納米粒子進行修飾，得到主動靶向配體和聚多巴胺修飾的載疏水性藥物的聚合物納米粒；
(4)將具有硼酸結構的藥物負載在主動靶向配體和聚多巴胺修飾的載疏水性藥物的聚合物納米粒上，得到ph響應和腫瘤靶向的雙載藥納米粒。
在本發明的技術方案中，在步驟4)中，藥物負載在ph為7.5-12的弱堿性水溶液中進行，將具有硼酸結構的藥物溶于有機溶劑中，加入混懸主動靶向配體和聚多巴胺修飾的載疏水性藥物的聚合物納米粒的弱堿性水溶液中，至反應完全，分離后得到雙載藥納米粒；
更優選地，主動靶向配體和聚多巴胺修飾的納米粒與硼替佐米的質量比為100:1-20，更優選為100:8-16。
所述有機溶劑選自丙酮、二氧六環、二甲基亞砜、二氯甲烷、乙腈、四氫呋喃或n,n-二甲基甲酰胺。
在本發明的技術方案中，步驟1)為將聚合物和疏水性藥物溶于有機溶劑中，并加入聚乙二醇維生素e琥珀酸酯水溶液中，反應至有機溶劑揮發完全，分離沉淀，得到載疏水性藥物的聚合物納米粒子；
其中，所述聚合物選自聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-羥基乙酸共聚物、聚己內酯、聚乙二醇-聚乳酸-羥基乙酸共聚物、膽酸-聚乳酸-羥基乙酸共聚物、聚乙二醇1000維生素e琥珀酸酯-聚乳酸中的一種或多種；
所述疏水性藥物選自紫杉醇、多烯紫杉醇、香豆素-6、順鉑、布洛芬、10-羥基喜樹堿中的一種或多種；
所述有機溶劑選自丙酮、二氧六環、二甲基亞砜、二氯甲烷、乙腈、四氫呋喃或n,n-二甲基甲酰胺。
在本發明的技術方案中，步驟2)為將載疏水性藥物的聚合物納米粒混懸于ph為7.5-12的弱堿性水溶液中，加入多巴胺鹽酸鹽，反應至完全，分離沉淀，得到聚多巴胺修飾的載疏水性藥物的聚合物納米粒。
在本發明的技術方案中，步驟3)為聚多巴胺修飾的載疏水性藥物的聚合物納米粒混懸于ph為7.5-12的弱堿性水溶液中，將主動靶向配體加入到上述溶液中，反應至完全，分離沉淀得到主動靶向配體和聚多巴胺修飾的載疏水性藥物的聚合物納米粒；
在本發明的技術方案中，主動靶向配體選自葉酸聚乙二醇氨基、半乳糖胺(gal)、一種多肽(arg-gly-asp,rgd)、核酸適體巰基(aptamer-sh)。
在本發明的技術方案中，步驟2、3)或4)中ph為7.5-12的弱堿性水溶液獨立的選自pbs緩沖溶液、tris緩沖溶液、碳酸鈉水溶液、碳酸氫納水溶液或氫氧化鈉水溶液中的一種；
優選地，ph為8-9，更優選為8.5。
本發明的另一個方面提供了前述的制備方法制備的雙載藥納米粒。
本發明的再一個方面提供了一種雙載藥納米粒，其包含以聚合物形成的納米粒載體骨架，納米粒載體骨架上負載疏水性藥物，納米粒載體骨架表面覆蓋有聚多巴胺，聚多巴胺上黏附有主動靶向配體，聚多巴胺上的兒茶酚基團還結合有具有硼酸基團的藥物；所述雙載藥納米粒為ph響應的納米粒，在酸性條件下釋放藥物。
在本發明的技術方案中，雙載藥納米粒中的所述聚合物選自聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-羥基乙酸共聚物、聚己內酯、聚乙二醇-聚乳酸-羥基乙酸共聚物、膽酸-聚乳酸-羥基乙酸共聚物、聚乙二醇1000維生素e琥珀酸酯-聚乳酸中的一種或多種；
所述疏水性藥物選自紫杉醇、多烯紫杉醇、香豆素-6、順鉑、布洛芬、10-羥基喜樹堿中的一種或多種；
具有硼酸結構的藥物選自硼替佐米；
主動靶向配體選自葉酸聚乙二醇氨基、半乳糖胺(gal)、一種多肽(arg-gly-asp,rgd)、核酸適體巰基(aptamer-sh)。
本發明的再一個方面提供了前述的雙載藥納米粒子在制備抗腫瘤藥物的應用。所述腫瘤選自乳腺癌、宮頸癌、肺腺癌、子宮內膜癌和卵巢癌。
本發明的具體技術方案包括：
一種葉酸和聚多巴胺修飾的ph響應的腫瘤靶向雙載藥納米粒子的制備方法，包括如下步驟：
(1)載藥納米粒子的制備：按比例，稱取100mg聚合物，2-10mg疏水性藥物，溶于8-10ml有機溶劑中，在室溫攪拌的條件下，逐滴加入到100ml的0.03％(w/v)的聚乙二醇維生素e琥珀酸酯水溶液中，繼續室溫攪拌10-15小時以揮發有機溶劑，15000-18000rpm離心15-30分鐘，棄上清液，沉淀用去離子水洗滌3次，得到載疏水性藥物的聚合物納米粒子，冷凍干燥后備用；
(2)聚多巴胺的修飾：按比例，稱取50mg(1)中所制備的納米粒子重懸于50ml的ph＝7.5-12的弱堿性水溶液中，稱取10-50mg多巴胺鹽酸鹽，在室溫攪拌的條件下加入到上述溶液中，反應3-6小時后15000-18000rpm離心15-30分鐘，棄上清液，沉淀用去離子水洗滌3次，得到聚多巴胺修飾的載疏水性藥物的聚合物納米粒子，冷凍干燥后備用；
(3)靶向配體葉酸的修飾：按比例，稱取50mg(2)中所制備的納米粒子重懸于50ml的ph＝7.5-12的弱堿性水溶液中，稱取50-100mg腫瘤靶向配體葉酸聚乙二醇氨基，在室溫攪拌的條件下加入到上述溶液中，反應3-6小時后15000-18000rpm離心15-30分鐘，棄上清液，沉淀用去離子水洗滌3次，得到葉酸和聚多巴胺修飾的載疏水性藥物的聚合物納米粒子，冷凍干燥后備用；
(4)雙載藥：按比例，稱取50mg(3)中所制備的納米粒子重懸于50ml的ph為7.5-12的弱堿性水溶液中，稱取4-8mg硼替佐米溶于200-300μl有機溶劑中，在室溫攪拌的條件下，逐滴加入到上述納米粒子的混懸液中，繼續攪拌10-15小時以揮發有機溶劑，15000-18000rpm離心15-30分鐘，棄上清液，沉淀用去離子水洗滌3次，得到葉酸和聚多巴胺修飾的ph響應的腫瘤靶向雙載藥納米粒子，冷凍干燥后備用。
聚合物選自聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-羥基乙酸共聚物、聚己內酯、聚乙二醇-聚乳酸-羥基乙酸共聚物、膽酸-聚乳酸-羥基乙酸共聚物或聚乙二醇1000維生素e琥珀酸酯-聚乳酸。
疏水性藥物選自紫杉醇、多烯紫杉醇、香豆素-6、順鉑、布洛芬或10-羥基喜樹堿。
有機溶劑選自丙酮、二氧六環、二甲基亞砜、二氯甲烷、乙腈、四氫呋喃或n,n-二甲基甲酰胺。
弱堿水溶液選自pbs緩沖溶液、tris緩沖溶液、碳酸鈉水溶液、碳酸氫納水溶液或氫氧化鈉水溶液。
上述方法制備的葉酸和聚多巴胺修飾的ph響應的腫瘤靶向雙載藥納米粒子。
上述葉酸和聚多巴胺修飾的ph響應的腫瘤靶向雙載藥納米粒子在制備抗腫瘤藥物的應用。
本發明方法簡單，適應性廣，所制備的納米粒子具有良好的生物相容性、生物可降解性以及多種腫瘤的靶向性，雙載藥以及ph響應特性使其具有良好的治療效果，實驗證明，可靶向乳腺癌，并對乳腺癌有治療作用。
附圖說明
圖1為動態光散射測的實施例1制備的葉酸和聚多巴胺修飾的腫瘤靶向納米粒子ca-plga@pda-peg-fa/nps(載多烯紫杉醇)的粒度分布。
圖2為實施例1制備的葉酸和聚多巴胺修飾的腫瘤靶向納米粒子ca-plga@pda-peg-fa/nps(載多烯紫杉醇)的透射電子顯微鏡(tem)圖譜。
圖3為實施例1制備的載多烯紫杉醇的四種納米粒子(ca-plga/nps、ca-plga@pda/nps、ca-plga@pda-peg-fa/nps、ca-plga@pda-peg-fa+btz/nps)的x射線光電子能譜(xps)的全譜掃描圖。
圖4為實施例1制備的載多烯紫杉醇的納米粒子(ca-plga/nps、ca-plga@pda/nps、ca-plga@pda-peg-fa/nps)的多烯紫杉醇的體外釋放曲線。
圖5為實施例1制備的的葉酸和聚多巴胺修飾的ph響應的腫瘤靶向雙載藥納米粒子ca-plga@pda-peg-fa+btz/nps(載多烯紫杉醇)的硼替佐米的體外釋放曲線。
圖6為實施例1制備的載多烯紫杉醇的納米粒子(ca-plga@pda-peg/nps、ca-plga@pda-peg-fa/nps、ca-plga@pda-peg-fa+btz/nps)與不載藥的ca-plga@pda-peg-fa/nps納米粒子(與載藥納米粒子相同濃度)在24小時和48小時內對mcf-7細胞的細胞活性實驗結果，臨床用的的多烯紫杉醇制劑
圖7為治療14天后各組腫瘤的照片。各組分別注射實施例1制備的載多烯紫杉醇ca-plga@pda-peg/nps、ca-plga@pda-peg-fa/nps、ca-plga@pda-peg-fa+btz/nps，臨床用的的多烯紫杉醇制劑
圖8為腫瘤的體積隨著治療時間的變化圖(t-test,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001)。
圖9為裸鼠的體重隨著治療時間的變化圖。
圖10為治療14天后各組裸鼠的主要器官和腫瘤的組織切片圖。1，2，3，4和5分別代表生理鹽水，
圖11為實施例2制備的載香豆素-6的納米粒子處理mcf-7細胞0.5小時和2小時后的激光共聚焦顯微鏡(clsm)圖片。1，2，3和4分別代表ca-plga@pda-peg/nps(載香豆素-6)、ca-plga@pda-peg-fa/nps(載香豆素-6)、ca-plga@pda-peg-fa+btz/nps(載香豆素-6)和ca-plga@pda-peg-fa/nps(載香豆素-6)+游離葉酸。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明作進一步闡述，但本發明并不限于以下實施例。所述方法如無特別說明均為常規方法。所述原材料如無特別說明均能從公開商業途徑而得。
膽酸-聚乳酸-羥基乙酸共聚物(ca-plga)
聚乳酸(pla)
聚乙二醇氨基(nh2-peg)
葉酸聚乙二醇氨基(nh2-peg-fa)
紫杉醇(paclitaxel,ptx)
多烯紫杉醇(docetaxel,dtx)
硼替佐米(bortezomib,btz)
香豆素-6(coumarin-6，c6)
實施例1
一種葉酸和聚多巴胺修飾的ph響應的腫瘤靶向雙載藥納米粒子的制備方法及其在乳腺癌靶向治療中的應用，包括如下步驟：
(1)載藥納米粒子的制備：按比例，稱取100mg膽酸-聚乳酸-羥基乙酸共聚物(ca-plga)，10mg多烯紫杉醇，溶于8ml丙酮中，在室溫攪拌的條件下，逐滴加入到100ml的0.03％(w/v)的聚乙二醇維生素e琥珀酸酯水溶液中，繼續室溫攪拌12小時以揮發丙酮，18000rpm離心15分鐘，棄上清液，沉淀用去離子水洗滌3次，得到載多烯紫杉醇(docetaxel,dtx)的納米粒子ca-plga/nps，冷凍干燥后備用；
(2)聚多巴胺的修飾：按比例，稱取50mg(1)中所制備的納米粒子重懸于50ml的10mm，ph＝8.5的tris緩沖液中，稱取25mg多巴胺鹽酸鹽，在室溫攪拌的條件下加入到上述溶液中，反應3小時后18000rpm離心15分鐘，棄上清液，沉淀用去離子水洗滌3次，得到聚多巴胺(polydopamine,pda)修飾的載多烯紫杉醇的納米粒子ca-plga@pda/nps，冷凍干燥后備用；
(3)靶向配體葉酸的修飾：按比例，稱取50mg(2)中所制備的納米粒子重懸于50ml的10mm，ph＝8.5的tris緩沖液中，稱取50mg腫瘤靶向配體葉酸聚乙二醇氨基(nh2-peg-fa)，在室溫攪拌的條件下加入到上述溶液中，反應3小時后18000rpm離心15分鐘，棄上清液，沉淀用去離子水洗滌3次，得到葉酸和聚多巴胺修飾的載多烯紫杉醇的納米粒子ca-plga@pda-peg-fa/nps，冷凍干燥后備用；
(4)雙載藥：按比例，稱取50mg(3)中所制備的納米粒子重懸于50ml的10mm，ph＝8.5的tris緩沖液中，稱取6mg硼替佐米溶于200μl二甲基亞砜中，在室溫攪拌的條件下，逐滴加入到上述納米粒子的混懸液中，繼續攪拌12小時以揮發二甲基亞砜，18000rpm離心15分鐘，棄上清液，沉淀用去離子水洗滌3次，得到葉酸和聚多巴胺修飾的ph響應的腫瘤靶向雙載藥納米粒子ca-plga@pda-peg-fa+btz/nps(載多烯紫杉醇)，冷凍干燥后備用。
將步驟(3)中的nh2-peg-fa替換為nh2-peg可以得到聚乙二醇和聚多巴胺修飾的載多烯紫杉醇的納米粒子ca-plga@pda-peg/nps。
步驟(1)、(2)、(3)、(4)中的納米粒子的水合粒徑(由動態光散射測量)分別為103.4nm、160.8nm、166.4nm、168.7nm，均在100-200nm之間且分布比較均勻，有利于腫瘤細胞的攝取；另外，上述四種納米粒子的zete電位分別為-22.5mv、-18.4mv、-11.7mv、-11.2mv，絕對值均比較大，有利于納米粒子在分散相中穩定存在。其中，圖1為動態光散射測得的實施例1制備的納米粒子ca-plga@pda-peg-fa/nps(載多烯紫杉醇)的粒徑分布圖，平均粒徑大約為168.7nm且分布比較均勻；圖2為實施例1制備的納米粒子ca-plga@pda-peg-fa/nps(載多烯紫杉醇)的透射電鏡結果，納米粒子為具有核殼結構的光滑的球形結構，說明表面經過了聚多巴胺和葉酸的修飾，由此估計的粒徑約為85nm且大小均一；兩種方法測得的粒徑差距較大的原因是納米粒子在干燥過程中的收縮和塌陷。
實施例1制備的載多烯紫杉醇的四種納米粒子(ca-plga/nps、ca-plga@pda/nps、ca-plga@pda-peg-fa/nps、ca-plga@pda-peg-fa+btz/nps)的xps全譜掃描結果如圖3所示。由圖3可知，后三種納米粒子的譜圖均出現n1s峰，證明聚多巴胺的修飾；ca-plga@pda-peg-fa/nps的n1s峰強于ca-plga@pda/nps，證明葉酸的修飾；ca-plga@pda-peg-fa+btz/nps出現b1s峰，證明硼替佐米的負載。
實施例1制備的載多烯紫杉醇的四種納米粒子(ca-plga/nps、ca-plga@pda/nps、ca-plga@pda-peg-fa/nps、ca-plga@pda-peg-fa+btz/nps)的多烯紫杉醇載藥量分別為9.96％、9.78％、9.67％、9.01％，說明表面修飾對納米粒子的載藥量影響不大；另外，ca-plga@pda-peg-fa+btz/nps的硼替佐米的載藥量為9.18％。
如圖4所示，透析法測定納米粒子的多烯紫杉醇緩釋曲線。步驟(1)、(2)、(3)制備的載多烯紫杉醇的納米粒子ca-plga/nps、ca-plga@pda/nps、ca-plga@pda-peg-fa/nps分別稱取5mg溶解于1ml的釋放介質pbst溶液(pbs溶液，包含0.1％w/v的吐溫-80，ph7.4)，轉移到透析袋(mwco＝3500，上海生工)中并封口，再浸沒在裝有15ml釋放介質pbst溶液的50ml離心管中，最后置于恒溫水浴搖床上于37℃震蕩。在一定的時間間隔從離心管中取出1ml溶液用于分析，再補充等量的新鮮溶液。取出的1ml溶液中加入1ml二乙醚萃取，棄去水相后通氮氣揮發二乙醚，待二乙醚揮發完全，加入1ml流動相乙腈：水(50/50，v/v)經超聲分散并由0.1μm濾膜過濾后，取20μl加入到hplc中進行測量。測量條件為：流動相為乙腈：水(50/50，v/v)；流動相速度為1.0ml/min；采用反相c-18柱子(150×4.6mm,5μm,c18,安捷倫)；檢測波長為227nm。根據多烯紫杉醇的標準曲線繪制出其隨時間變化的釋放曲線如圖4：三種納米粒子均表現相同的釋放模式，即第一個階段的突釋(前兩天釋放約50％)和第二個階段的緩釋(最終緩慢釋放至80％左右)。
如圖5所示，透析法測定實施例1制備的載多烯紫杉醇的納米粒子ca-plga@pda-peg-fa+btz/nps的硼替佐米的緩釋曲線。具體過程與上述透析法相似，僅替換以下條件：分三個ph值(ph7.4，ph6.5，ph5.0)測定其釋放曲線；流動相替換為乙腈：水(80/20，v/v)；檢測波長為270nm。得到的硼替佐米釋放曲線如圖5所示，在ph7.4的條件下經過12小時金釋放約25％；在ph6.5的條件下釋放量少量增加；在ph5.0的條件下，兩個小時硼替佐米釋放超過50％，最終經過12小時釋放量大約為80％。通過對比發現，在ph5.0的條件下硼替佐米的釋放速度與釋放量都大大提高，證明了硼替佐米釋放的ph響應性。
如圖6所示，用mtt法測定了納米粒子在24小時和48小時對乳腺癌細胞mcf-7的細胞毒性。將mcf-7細胞以1×104細胞/孔的密度接種到96孔板上，培養過夜并貼壁后，分別用納米粒子ca-plga@pda-peg-fa/nps(不載藥)、
結果表明：ca-plga@pda-peg-fa/nps(不載藥)在各個濃度均沒有表現出細胞毒性，排除了藥物載體的細胞毒性；其余多烯紫杉醇配方均表現出細胞毒性，其中三種載藥納米粒子的細胞毒性均大于臨床用的多烯紫杉醇制劑
圖7為治療14天后各組腫瘤的照片。各組分別注射實施例1制備的三種載多烯紫杉醇的納米粒子(ca-plga@pda-peg/nps、ca-plga@pda-peg-fa/nps、ca-plga@pda-peg-fa+btz/nps)，另外一組注射生理鹽水(saline)作為空白對照，一組注射臨床用的多烯紫杉醇制劑
圖8為腫瘤的體積隨著治療時間的變化圖。當皮下注射mcf-7細胞的裸鼠的腫瘤長到50mm3時，將其隨機分為五組(每組5只)分別腹腔注射載多烯紫杉醇的ca-plga@pda-peg/nps、ca-plga@pda-peg-fa/nps、ca-plga@pda-peg-fa+btz/nps以及生理鹽水和
如圖10所示，顯示了經過14天治療的裸鼠的主要器官(心、肝、脾、肺、腎)和腫瘤的組織切片圖。圖中顯示
實施例2
一種葉酸和聚多巴胺修飾的ph響應的腫瘤靶向雙載藥納米粒子的制備方法及其在乳腺癌靶向治療中的應用，包括如下步驟：
(1)載藥納米粒子的制備：按比例，稱取100mg膽酸-聚乳酸-羥基乙酸共聚物(ca-plga)，2mg香豆素-6，溶于8ml丙酮中，在室溫攪拌的條件下，逐滴加入到100ml的0.03％(w/v)的聚乙二醇維生素e琥珀酸酯水溶液中，繼續室溫攪拌12小時以揮發丙酮，18000rpm離心15分鐘，棄上清液，沉淀用去離子水洗滌3次，得到載香豆素-6(coumarin-6,c6)的納米粒子ca-plga/nps，冷凍干燥后備用；
(2)聚多巴胺的修飾：按比例，稱取50mg(1)中所制備的納米粒子重懸于50ml的10mm，ph＝8.5的tris緩沖液中，稱取25mg多巴胺鹽酸鹽，在室溫攪拌的條件下加入到上述溶液中，反應3小時后18000rpm離心15分鐘，棄上清液，沉淀用去離子水洗滌3次，得到聚多巴胺(polydopamine,pda)修飾的載香豆素-6的納米粒子ca-plga@pda/nps，冷凍干燥后備用；
(3)靶向配體葉酸的修飾：按比例，稱取50mg(2)中所制備的納米粒子重懸于50ml的10mm，ph＝8.5的tris緩沖液中，稱取50mg腫瘤靶向配體葉酸聚乙二醇氨基(nh2-peg-fa)，在室溫攪拌的條件下加入到上述溶液中，反應3小時后18000rpm離心15分鐘，棄上清液，沉淀用去離子水洗滌3次，得到葉酸和聚多巴胺修飾的載香豆素-6的納米粒子ca-plga@pda-peg-fa/nps，冷凍干燥后備用；
(4)雙載藥：按比例，稱取50mg(3)中所制備的納米粒子重懸于50ml的10mm，ph＝8.5的tris緩沖液中，稱取6mg硼替佐米溶于200μl二甲基亞砜中，在室溫攪拌的條件下，逐滴加入到上述納米粒子的混懸液中，繼續攪拌12小時以揮發二甲基亞砜，18000rpm離心15分鐘，棄上清液，沉淀用去離子水洗滌3次，得到葉酸和聚多巴胺修飾的ph響應的腫瘤靶向雙載藥納米粒子ca-plga@pda-peg-fa+btz/nps(載香豆素-6)，冷凍干燥后備用。
將步驟(3)中的nh2-peg-fa替換為nh2-peg可以得到聚乙二醇和聚多巴胺修飾的載香豆素-6的納米粒子ca-plga@pda-peg/nps。
圖11為用共聚焦顯微鏡觀察mcf-7細胞對載香豆素-6的三種納米粒子(ca-plga@pda-peg/nps、ca-plga@pda-peg-fa/nps、ca-plga@pda-peg-fa+btz/nps)的攝取結果，另外還有一組同時加入ca-plga@pda-peg-fa/nps(載香豆素-6)和游離的葉酸用于證明葉酸介導的細胞內吞作用。將mcf-7細胞接種到玻底培養皿中，培養過夜并貼壁后，分別加入250μg/ml的載香豆素-6的納米粒子，其中驗證組為加入ca-plga@pda-peg-fa/nps(載香豆素-6)(125μg/ml)和游離葉酸(125μg/ml)。培養0.5小時和2小時后，用pbs將細胞洗滌3次，用4％的多聚甲醛溶液固定15分鐘，用pbs將細胞洗滌3次，用dapi染細胞核10分鐘，用pbs將細胞洗滌3次，之后用共聚焦顯微鏡觀察細胞攝取情況。如圖11所示，培養0.5小時細胞就已經開始攝取納米粒子，培養2小時后細胞攝取的納米粒子的熒光增強，其中細胞對載香豆素-6的ca-plga@pda-peg-fa/nps和ca-plga@pda-peg-fa+btz/nps的攝取量相差不大，熒光強度均明顯強于載香豆素-6的ca-plga@pda-peg/nps，這說明葉酸介導的細胞內吞作用明顯增加了細胞對納米粒子的攝取，而且負載硼替佐米這一工藝沒有影響其主動靶向作用。另外加入游離葉酸的驗證組的熒光明顯減弱，這進一步驗證了葉酸介導的主動靶向作用。
實施例3
一種葉酸和聚多巴胺修飾的ph響應的腫瘤靶向雙載藥納米粒子的制備方法，包括如下步驟：
(1)載藥納米粒子的制備：按比例，稱取100mg聚乳酸-羥基乙酸共聚物(plga)，10mg紫杉醇，溶于10ml四氫呋喃中，在室溫攪拌的條件下，逐滴加入到100ml的0.03％(w/v)的聚乙二醇維生素e琥珀酸酯水溶液中，繼續室溫攪拌12小時以揮發四氫呋喃，18000rpm離心15分鐘，棄上清液，沉淀用去離子水洗滌3次，得到載紫杉醇(paclitaxel,ptx)的納米粒子plga/nps，冷凍干燥后備用；
(2)聚多巴胺的修飾：按比例，稱取50mg(1)中所制備的納米粒子重懸于50ml的10mm，ph＝8.5的tris緩沖液中，稱取10mg多巴胺鹽酸鹽，在室溫攪拌的條件下加入到上述溶液中，反應6小時后18000rpm離心15分鐘，棄上清液，沉淀用去離子水洗滌3次，得到聚多巴胺(polydopamine,pda)修飾的載紫杉醇的納米粒子plga@pda/nps，冷凍干燥后備用；
(3)靶向配體葉酸的修飾：按比例，稱取50mg(2)中所制備的納米粒子重懸于50ml的10mm，ph＝8.5的tris緩沖液中，稱取50mg腫瘤靶向配體葉酸聚乙二醇氨基(nh2-peg-fa)，在室溫攪拌的條件下加入到上述溶液中，反應3小時后18000rpm離心15分鐘，棄上清液，沉淀用去離子水洗滌3次，得到葉酸和聚多巴胺修飾的載紫杉醇的納米粒子plga@pda-peg-fa/nps，冷凍干燥后備用；
(4)雙載藥：按比例，稱取50mg(3)中所制備的納米粒子重懸于50ml的10mm，ph＝8.5的tris緩沖液中，稱取4mg硼替佐米溶于200μl二甲基亞砜中，在室溫攪拌的條件下，逐滴加入到上述納米粒子的混懸液中，繼續攪拌12小時以揮發二甲基亞砜，18000rpm離心15分鐘，棄上清液，沉淀用去離子水洗滌3次，得到葉酸和聚多巴胺修飾的ph響應的腫瘤靶向雙載藥納米粒子plga@pda-peg-fa+btz/nps(載紫杉醇)，冷凍干燥后備用。
實驗證明，用聚乳酸-羥基乙酸共聚物(plga)替代實施例1的膽酸-聚乳酸-羥基乙酸共聚物(ca-plga)，得到的葉酸和聚多巴胺修飾的ph響應的腫瘤靶向雙載藥納米粒子plga@pda-peg-fa+btz/nps的表征數據與實施例1無實質性差別。
實施例4
一種葉酸和聚多巴胺修飾的ph響應的腫瘤靶向雙載藥納米粒子的制備方法，包括如下步驟：
(1)載藥納米粒子的制備：按比例，稱取100mg聚乙二醇-聚乳酸-羥基乙酸共聚物(peg-plga)，10mg紫杉醇，溶于10ml四氫呋喃中，在室溫攪拌的條件下，逐滴加入到100ml的0.03％(w/v)的聚乙二醇維生素e琥珀酸酯水溶液中，繼續室溫攪拌12小時以揮發四氫呋喃，18000rpm離心15分鐘，棄上清液，沉淀用去離子水洗滌3次，得到載紫杉醇(paclitaxel,ptx)的納米粒子peg-plga/nps，冷凍干燥后備用；
(2)聚多巴胺的修飾：按比例，稱取50mg(1)中所制備的納米粒子重懸于50ml的10mm，ph＝8.5的tris緩沖液中，稱取10mg多巴胺鹽酸鹽，在室溫攪拌的條件下加入到上述溶液中，反應6小時后18000rpm離心15分鐘，棄上清液，沉淀用去離子水洗滌3次，得到聚多巴胺(polydopamine,pda)修飾的載紫杉醇的納米粒子peg-plga@pda/nps，冷凍干燥后備用；
(3)靶向配體葉酸的修飾：按比例，稱取50mg(2)中所制備的納米粒子重懸于50ml的10mm，ph＝8.5的tris緩沖液中，稱取50mg腫瘤靶向配體葉酸聚乙二醇氨基(nh2-peg-fa)，在室溫攪拌的條件下加入到上述溶液中，反應3小時后18000rpm離心15分鐘，棄上清液，沉淀用去離子水洗滌3次，得到葉酸和聚多巴胺修飾的載紫杉醇的納米粒子peg-plga@pda-peg-fa/nps，冷凍干燥后備用；
(4)雙載藥：按比例，稱取50mg(3)中所制備的納米粒子重懸于50ml的10mm，ph＝8.5的tris緩沖液中，稱取4mg硼替佐米溶于200μl二甲基亞砜中，在室溫攪拌的條件下，逐滴加入到上述納米粒子的混懸液中，繼續攪拌12小時以揮發二甲基亞砜，18000rpm離心15分鐘，棄上清液，沉淀用去離子水洗滌3次，得到葉酸和聚多巴胺修飾的ph響應的腫瘤靶向雙載藥納米粒子peg-plga@pda-peg-fa+btz/nps(載紫杉醇)，冷凍干燥后備用。
實驗證明，用聚乙二醇-聚乳酸-羥基乙酸共聚物(peg-plga)替代實施例1的膽酸-聚乳酸-羥基乙酸共聚物(ca-plga)，得到的葉酸和聚多巴胺修飾的ph響應的腫瘤靶向雙載藥納米粒子peg-plga@pda-peg-fa+btz/nps的表征數據與實施例1無實質性差別。
實施例5
一種葉酸和聚多巴胺修飾的ph響應的腫瘤靶向雙載藥納米粒子的制備方法，包括如下步驟：
(1)載藥納米粒子的制備：按比例，稱取100mg聚乳酸(pla)，10mg順鉑，溶于8ml二甲基亞砜中，在室溫攪拌的條件下，逐滴加入到100ml的0.03％(w/v)的聚乙二醇維生素e琥珀酸酯水溶液中，繼續室溫攪拌12小時以揮發二甲基亞砜，18000rpm離心15分鐘，棄上清液，沉淀用去離子水洗滌3次，得到載順鉑的納米粒子pla/nps，冷凍干燥后備用；
(2)聚多巴胺的修飾：按比例，稱取50mg(1)中所制備的納米粒子重懸于50ml的10mm，ph＝8.5的tris緩沖液中，稱取50mg多巴胺鹽酸鹽，在室溫攪拌的條件下加入到上述溶液中，反應3小時后18000rpm離心15分鐘，棄上清液，沉淀用去離子水洗滌3次，得到聚多巴胺(polydopamine,pda)修飾的載順鉑的納米粒子pla@pda/nps，冷凍干燥后備用；
(3)靶向配體葉酸的修飾：按比例，稱取50mg(2)中所制備的納米粒子重懸于50ml的10mm，ph＝8.5的tris緩沖液中，稱取100mg腫瘤靶向配體葉酸聚乙二醇氨基(nh2-peg-fa)，在室溫攪拌的條件下加入到上述溶液中，反應3小時后18000rpm離心15分鐘，棄上清液，沉淀用去離子水洗滌3次，得到葉酸和聚多巴胺修飾的載順鉑的納米粒子pla@pda-peg-fa/nps，冷凍干燥后備用；
(4)雙載藥：按比例，稱取50mg(3)中所制備的納米粒子重懸于50ml的10mm，ph＝8.5的tris緩沖液中，稱取8mg硼替佐米溶于300μl二甲基亞砜中，在室溫攪拌的條件下，逐滴加入到上述納米粒子的混懸液中，繼續攪拌12小時以揮發二甲基亞砜，18000rpm離心15分鐘，棄上清液，沉淀用去離子水洗滌3次，得到葉酸和聚多巴胺修飾的ph響應的腫瘤靶向雙載藥納米粒子pla@pda-peg-fa+btz/nps(載順鉑)，冷凍干燥后備用。
實驗證明，用聚乳酸(pla)替代實施例1的膽酸-聚乳酸-羥基乙酸共聚物(ca-plga)，得到的葉酸和聚多巴胺修飾的ph響應的腫瘤靶向雙載藥納米粒子pla@pda-peg-fa+btz/nps的表征數據與實施例1無實質性差別。
實施例6
一種葉酸和聚多巴胺修飾的ph響應的腫瘤靶向雙載藥納米粒子的制備方法，包括如下步驟：
(1)載藥納米粒子的制備：按比例，稱取100mg聚乙二醇1000維生素e琥珀酸酯-聚乳酸(tpgs-pla)，10mg順鉑，溶于8ml二甲基亞砜中，在室溫攪拌的條件下，逐滴加入到100ml的0.03％(w/v)的聚乙二醇維生素e琥珀酸酯水溶液中，繼續室溫攪拌12小時以揮發二甲基亞砜，18000rpm離心15分鐘，棄上清液，沉淀用去離子水洗滌3次，得到載順鉑的納米粒子tpgs-pla/nps，冷凍干燥后備用；
(2)聚多巴胺的修飾：按比例，稱取50mg(1)中所制備的納米粒子重懸于50ml的10mm，ph＝8.5的tris緩沖液中，稱取50mg多巴胺鹽酸鹽，在室溫攪拌的條件下加入到上述溶液中，反應3小時后18000rpm離心15分鐘，棄上清液，沉淀用去離子水洗滌3次，得到聚多巴胺(polydopamine,pda)修飾的載順鉑的納米粒子tpgs-pla@pda/nps，冷凍干燥后備用；
(3)靶向配體葉酸的修飾：按比例，稱取50mg(2)中所制備的納米粒子重懸于50ml的10mm，ph＝8.5的tris緩沖液中，稱取100mg腫瘤靶向配體葉酸聚乙二醇氨基(nh2-peg-fa)，在室溫攪拌的條件下加入到上述溶液中，反應3小時后18000rpm離心15分鐘，棄上清液，沉淀用去離子水洗滌3次，得到葉酸和聚多巴胺修飾的載順鉑的納米粒子tpgs-pla@pda-peg-fa/nps，冷凍干燥后備用；
(4)雙載藥：按比例，稱取50mg(3)中所制備的納米粒子重懸于50ml的10mm，ph＝8.5的tris緩沖液中，稱取8mg硼替佐米溶于300μl二甲基亞砜中，在室溫攪拌的條件下，逐滴加入到上述納米粒子的混懸液中，繼續攪拌12小時以揮發二甲基亞砜，18000rpm離心15分鐘，棄上清液，沉淀用去離子水洗滌3次，得到葉酸和聚多巴胺修飾的ph響應的腫瘤靶向雙載藥納米粒子tpgs-pla@pda-peg-fa+btz/nps(載順鉑)，冷凍干燥后備用。
實驗證明，用聚乙二醇1000維生素e琥珀酸酯-聚乳酸(tpgs-pla)替代實施例1的膽酸-聚乳酸-羥基乙酸共聚物(ca-plga)，得到的葉酸和聚多巴胺修飾的ph響應的腫瘤靶向雙載藥納米粒子tpgs-pla@pda-peg-fa+btz/nps的表征數據與實施例1無實質性差別。
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