本發明屬于干細胞技術領域，具體涉及一種干細胞制劑及其制備方法和應用。
背景技術：
隨著社會進步和人們生活、飲食方式的轉變，糖尿病發病率逐年增高。中國近期一項流行病學研究結果表明，中國的糖尿病患病率已達9.7％，高于世界平均水平6.4％。糖尿病足是導致糖尿病患者殘疾，甚至死亡的嚴重慢性并發癥之一。隨著我國人口老齡化的發展，糖尿病足發病率逐年增高，處理不當有可能會截肢或死亡，而85％截肢起因于潰瘍。糖尿病足潰瘍的發生使糖尿病患者生活質量降低，住院時間延長，給社會和家庭帶來了巨大的經濟負擔，因此需對糖尿病足潰瘍的防治進行綜合評價，及早預防和治療。
臨床上用于治療糖尿病足的方法有藥物治療、血管重建和介入手術，然而，糖尿病患者多年老體弱，常患有心腦血管等疾病，不能耐受手術搭橋等刺激，且血管病變多累及小動脈，部分患者缺乏遠段動脈流出道，不具備行血管搭橋和介入治療的條件。因此，迫切需要尋求一種能促進糖尿病足潰瘍修復的制劑或方法。
技術實現要素：
有鑒于此，本發明的目的在于提供一種干細胞制劑及其制備方法和應用，用于修復糖尿病足潰瘍，降低截肢率，改善患者的生活質量。
本發明的具體技術方案如下：
本發明提供了一種干細胞制劑，包括：脂肪間充質干細胞、富含血小板血漿和表皮生長因子。
優選的，所述脂肪間充質干細胞的細胞密度為1×105～10×105個/ml。
優選的，所述富含血小板血漿的體積百分比濃度為5％。
優選的，所述表皮生長因子的工作濃度為5ng/ml。
優選的，所述脂肪間充質干細胞為第三代至第五代脂肪間充質干細胞。
優選的，所述干細胞制劑的劑型為注射制劑。
優選的，所述干細胞制劑的注射劑量為3～8ml/次。
本發明還提供了上述干細胞制劑的制備方法，將脂肪間充質干細胞、富含血小板血漿和表皮生長因子混合，得到所述干細胞制劑。
本發明還提供了上述干細胞制劑或上述制備方法得到的干細胞制劑在制備修復糖尿病足潰瘍的藥物中的應用。
本發明所提供的一種干細胞制劑，包括：脂肪間充質干細胞、富含血小板血漿和表皮生長因子，各組分配伍合理、協同增效，共同促進了糖尿病足的傷口愈合；本發明采用脂肪間充質干細胞作為種子細胞，采集簡單、容易獲得，而且免疫原性低，無倫理問題，對于糖尿病患者具有重要意義；本發明所提供的制備方法，步驟操作簡單，工藝優化，可實現規模化生產。
具體實施方式
本發明提供了一種干細胞制劑極其制備方法和應用，有助于降低截肢率，改善患者的生活質量。本發明所提供的干細胞制劑包括：脂肪間充質干細胞、富含血小板血漿、表皮生長因子和溶媒。
進一步的，所述脂肪間充質干細胞的細胞密度為1×105～10×105個/ml。
進一步的，所述富含血小板血漿的體積百分比濃度為5％。
進一步的，所述表皮生長因子的工作濃度為5ng/ml。
進一步的，所述脂肪間充質干細胞為第三代至第五代脂肪干細胞。
本發明對脂肪間充質干細胞、富含血小板血漿和表皮生長因子的來源沒有特殊限制，采用本領域技術人員熟知的即可，如市售來源的脂肪間充質干細胞、富含血小板血漿和表皮生長因子，也可采用本領域技術人員熟知的常規制備方法進行制備。
更進一步的，所述干細胞制劑中還包括：溶媒；所述溶媒優選為干細胞生長因子。
本發明對所述溶媒的來源沒有特殊限制，采用本領域技術人員所熟知的干細胞生長因子即可，如市售來源。在本發明的一些實施例中，溶媒為本公司賽斯蘭黛系列的干細胞生長因子，主要成分為人體干細胞生長因子、去離子水、丁二醇、己二醇、丙二醇、復合氨基酸、葡聚糖、蘆薈提取液、聚谷氨酸和維生素e等。
進一步的，所述干細胞制劑的劑型為注射制劑；
所述干細胞制劑的注射劑量優選為3～8ml/次，更優選為5ml/次。
本發明還提供了上述干細胞制劑的制備方法，將脂肪間充質干細胞、富含血小板血漿、表皮生長因子和溶媒混合均勻，得到所述干細胞制劑。
本發明還提供了上述干細胞制劑或上述制備方法在制備修復糖尿病足潰瘍的藥物中的應用。
下面將結合本發明具體實施例對本發明的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例只是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。本領域技術人員應當理解，對本發明的具體實施例進行修改或者對部分技術特征進行同等替換，而不脫離本發明技術方案的精神，均應涵蓋在本發明保護的范圍中。
以下實施例中所使用的富含血小板血漿(prp)制備套裝購自浙江保爾曼生物科技有限公司，溶媒來源于廣州賽萊拉化妝品科技有限公司，654-2是從茄科植物唐古特山莨菪anisodustanguticus(maxim)pascher的根和種子種分離的一種顛茄生物堿，654-2注射液購自國藥集團容生制藥有限公司。
實施例1
1、配方
第三代脂肪間充質干細胞1×105個/ml；
富含血小板血漿(prp)5vol％；
表皮生長因子(egf)5ng/ml；
溶媒補足。
2、制備
(1)收集取p3代脂肪間充質干細胞，吸去培養基，加入消化液進行消化，之后用適量血清終止消化，輕輕吹打成單細胞懸液，再1500rpm離心5min，棄上清，用4℃pbs洗滌細胞3次后重懸混勻，調整細胞密度至107個/ml。
(2)用prp制備套裝制備prp。
(3)在50ml規格的離心管中，按配方比例先后加入prp、egf、溶媒和步驟(1)中制備的p3代脂肪間充質干細胞，充分攪拌混勻。
實施例2
1、配方
第四代脂肪間充質干細胞5×105個/ml；
富含血小板血漿(prp)5vol％；
表皮生長因子(egf)5ng/ml；
溶媒補足。
2、制備
(1)收集取p3代脂肪間充質干細胞，吸去培養基，加入消化液進行消化，之后用適量血清終止消化，輕輕吹打成單細胞懸液，再1500rpm離心5min，棄上清，用4℃pbs洗滌細胞3次后重懸混勻，調整細胞密度至107個/ml。
(2)用prp制備套裝制備prp。
(3)在50ml規格的離心管中，按配方比例先后加入prp、egf、溶媒和步驟(1)中制備的p3代脂肪間充質干細胞，充分攪拌混勻。
實施例3
1、配方
第五代脂肪間充質干細胞1×106個/ml；
富含血小板血漿(prp)5vol％；
表皮生長因子(egf)5ng/ml；
溶媒補足。
2、制備
(1)收集取p3代脂肪間充質干細胞，吸去培養基，加入消化液進行消化，之后用適量血清終止消化，輕輕吹打成單細胞懸液，再1500rpm離心5min，棄上清，用4℃pbs洗滌細胞3次后重懸混勻，調整細胞密度至107個/ml。
(2)用prp制備套裝制備prp。
(3)在50ml規格的離心管中，按配方比例先后加入prp、egf、溶媒和步驟(1)中制備的p3代脂肪間充質干細胞，充分攪拌混勻。
實施例4
對實施例1至實施例3中得到的干細胞制劑進行微生物檢測和內毒素檢測檢測。其中，微生物檢測(細菌、真菌)根據2015年版中華人民共和國藥典第4部通則1100進行檢測；內毒素檢測根據2015年版中華人民共和國藥典第4部通則1143進行檢測。
檢測結果發現實施例1-3制得的生物制劑在細菌、真菌和內毒素的檢測中，均呈陰性，說明了該干細胞制劑的質量合格，可用于創口的修復。
實施例5
隨機選取80例病程為7-20年的糖尿病患者，其中，男37例，女43例，均由各種原因導致糖尿病足。將患者隨機分為4組，其中一組為對照組，其余3組為實驗組。對照組采用由慶大霉素8-16萬u、胰島素4-8u、654-2注射液10mg和生理鹽水組成的混合液進行渦流式沖洗創面，之后用無菌棉球擦干，蓋以無菌紗布，每日一次，持續4周。其余3組實驗組在應用一般治療方案的同時，分別靜脈注射實施例3-5的干細胞制劑，每7天注射一次，每次5ml，持續4周。
表1為患者的預后情況，對照組和3組實驗組均呈現不同程度的好轉，其中實驗組的痊愈人數和顯效人數均高于對照組，說明本發明所提供的干細胞制劑能有效促進糖尿病足患者潰瘍創面的愈合。
以下為評估指標：
痊愈：4周內新生肉芽組織全部長全，創面完全愈合；
顯效：4周內創面縮小75％，新生肉芽組織大部分長出，無炎性滲出液；
好轉：4周內創面縮小，新生肉芽組織部分長出，炎性滲出液較少；
無效：4周內無創面縮小，無新生肉芽組織，炎性滲出液較多。
表1
p<0.05。