專利名稱：作為3－羥基－3－甲基戊二酰輔酶A(HMG－CoA)還原酶抑制劑的柚皮苷和柚苷配基的制作方法
技術領域：
本發明涉及抑制哺乳動物中3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶活性的藥物組合物，該組合物包括有效量之作為活性成分的柚皮苷或柚苷配基以及藥物學上可接受的載體，本發明還涉及用于抑制HMG-CoA還原酶活性的食品或飲料組合物，該組合物包含有效量的柚皮苷或柚苷配基。
背景技術：
近些年來，冠狀心血管循環疾病，例如動脈粥樣硬化和高膽固醇血癥，已逐漸成為主要的致死原因。已有報道稱，血漿膽固醇濃度增高導致脂肪、巨噬細胞和泡沫細胞沉積在血管壁上，此等沉積則導致斑塊形成，并由此引發動脈粥樣硬化(Ross,R.,Nature,362,801-809(1993))。降低血漿膽固醇濃度的方法之一是飲食料法，以降低膽固醇和脂質的攝入。另一種方法是降低在肝臟中進行的膽固醇的生物合成速率。已有報道稱，高膽固醇血癥可通過抑制HMG-CoA還原酶并由此降低膽固醇的生物合成速率來有效地治療，所述HMG-CoA還原酶介導3,5-二羥基-3-甲基戊酸的合成，該化合物是甾醇或類異戊二烯之生物合成中的中間體(Cardiovascular Pharmacology,William W.Parmley and Kanu Chatterjee Ed.,Wolfe Publishing,pages8.6-8.7,1994)。
因此，已進行了許多努力來研制可以抑制HMG-CoA還原酶的藥物；其結果是已有幾種從Penicillium sp.和Aspergillus sp.得到的化合物進入市場銷售。具體而言，Merck Co.,USA研制的Lovastatin和Simvastatin以及Sankyo Co.,Japan研制的Pravastatin已在市場上銷售(C.D.R.Dunn,Stroke:Trends,Treatment and Markets,SCRIPT Report,PJB Publications Ltd.,1995)。但是，這些藥物非常昂貴，而且已知長期給藥會誘發肝臟中肌酸激酶增加的副作用。因此，仍有必要繼續研制價格低廉而且無毒性的HMG-CoA還原酶抑制劑。
柚皮苷和柚皮苷的糖苷配基--柚苷配基是在檸檬、葡萄柚、柑桔和橙(甜橙，Citrus sinensis)中發現的黃酮類似物，而且它們具有以下結構(Horowitz,Gentili,Tetrahedron,19,773(1963))
柚皮苷已被用作苦味劑、發汗劑(sweater)或口香糖基質。但是，尚沒有報道稱柚皮苷或柚苷配基具有HMG-CoA還原酶抑制劑的活性。
發明簡述因此，本發明的目的是提供一種用于抑制哺乳動物中HMG-CoA還原酶活性的藥物組合物。
本發明的另一個目的是提供一種用于抑制哺乳動物中HMG-CoA還原酶活性的食品或飲料組合物。
根據本發明的一個方面，其提供一種用于抑制哺乳動物中3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶之活性的藥物組合物，該組合物包括有效量之作為活性成分的柚皮苷或柚苷配基以及藥物學上可接受的載體。發明詳述本發明提供一種用于抑制HMG-CoA還原酶活性的藥物組合物，該組合物包括作為活性成分的柚皮苷或柚苷配基以及藥物學上可接受的賦形劑、載體或稀釋劑。
柚皮苷和柚苷配基可從柑桔屬植物的皮中提取，或者根據Rosenmund(Rosenmund,Ber.,61,2608(1958))和Zemplen,Bognar(Ber.,75,648(1942))描述的方法進行合成。而柚苷配基則可通過水解柚皮苷來制備。
柚皮苷或柚苷配基在0.05mg/kg/天或更高的劑量時對HMG-CoA還原酶具有抑制作用，該抑制作用隨劑量而增高。
而且，盡管有強的效力，但柚皮苷和柚苷配基在鼠實驗中幾乎沒有表現出毒性或促有絲分裂性。更具體而言，當以1000mg/kg的劑量給鼠口服給藥時，柚皮苷沒有產生毒性，對于50kg重的人來說，上述劑量相當于口服給藥50-100g柚皮苷/kg體重。另外，柚皮苷和柚苷配基對肝功能沒有副作用。
可使用上述組合物根據任何常規方法來制備藥物制劑。在制備制劑時，柚皮苷或柚苷配基優選與載體混合或用載體稀釋，或者包封在膠囊、小藥囊或其他容器之形式的載體中。如果載體為稀釋劑，其可為固體、半固體或液體物質，作為活性成分的載體、賦形劑或介質。因此，制劑可為片劑、丸劑、粉末、小藥囊劑、甘香酒劑、混懸劑、乳劑、溶液、糖漿、氣霧劑、軟和硬明膠膠囊、無菌注射液、無菌包裝的粉末等劑型。
合適的載體、賦形劑和稀釋劑的例子是乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯樹膠、藻酸鹽、明膠、磷酸鈣、硅酸鈣、纖維素、甲基纖維素、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸鎂和礦物油。藥物制劑可另外包括填料、抗附聚劑、潤滑劑、潤濕劑、調味劑、乳化劑、防腐劑等。本發明的組合物可用任何本領域已知的方法配制成在給藥于哺乳動物后快速、持續或延遲釋放活性成分的制劑。
本發明的藥物制劑可通過各種途徑給藥，包括口服、透皮、皮下、靜脈和肌肉給藥。對于人，柚皮苷或柚苷配基的典型日劑量是約0.05-300mg/kg體重，優選為0.5-30mg/kg，而且該劑量可以單劑量或多份劑量給藥。但是應理解到，實際給藥的活性成分的量應根據各種相關因素來確定，所述因素包括待治療的疾病、所選擇的給藥途徑、每個患者的年齡、性別和體重、以及患者癥狀的嚴重程度；因此，上述劑量絕不是用于限制本發明的范圍。
另外，柚皮苷和柚苷配基可摻入在食品或飲料中，用于抑制HMG-CoA還原酶活性。因此，本發明還提供用于抑制HMG-CoA還原酶活性的食品或飲料組合物，該組合物包括有效量的柚皮苷或柚苷配基。
如上所述，柚皮苷或柚苷配基可用作有效抑制HMG-CoA還原酶活性的非毒性藥物。
以下實施例用于進一步闡明本發明，而不是限制其范圍。
另外，以下固體混合物中之固體、液體中之液體、以及液體中之固體的百分比分別是以wt/wt、vol/vol和wt/vol計算，而且所有的反應都是在室溫下進行，除非另有說明。實施例1向動物給藥柚皮苷和柚苷配基隨機將體重為90-110g的30只4周齡Sprague-Dawley小鼠(Taihanlaboratory animal center,Korea)平均分成3個組。三個組的小鼠分別用三種不同的高膽固醇食物喂養，即包含1％膽固醇的AIN-76實驗室動物飼料(ICN Biochemicals,Cleveland,OH,USA)(對照組)、1％膽固醇加0.1％柚皮苷(柚皮苷組)、以及1％膽固醇加0.1％柚苷配基(柚苷配基組)。三個組所用飼料的成分見下表Ⅰ。
表Ⅰ
*1從TEKLAD Premier Co.(Madison,WI,USA)購得*2購自Sigma Chemical Company(St.Louis,MO,USA)無限制地用具體飼料和水喂養小鼠共6周，每日記錄攝取量，然后每7天稱重，并分析記錄數據。所有小鼠都顯示正常的生長速度，而且三個組之間在食物攝取量和體重增加方面沒有顯著差異。實施例2血漿中總膽固醇、HDL-膽固醇和中性脂質含量的測定以下測定向小鼠給藥柚皮苷和柚苷配基對血漿膽固醇和中性脂質含量的影響。
從上三個組的小鼠中采取血樣，并用包含葡萄糖硫酸酯的HDL-膽固醇試劑(Sigma Chemical Co.,Cat.No.352-2)從中分離血漿HDL成分。用Sigma Diagnostic Kit Cat.No.352-100(Sigma Chemical Co.,USA)測定總膽固醇和HDL-膽固醇濃度(Allain et al.,Clin.Chem.,20,470-475(1974))。用Sigma Diagnostic Kit Cat.No.339-50(SigmaChemical Co.,USA)測定中性脂質濃度(Bucolo,G.And David,H.,Clin.Chem.,19,476-482(1973))。結果見表Ⅱ，其中，與對照組小鼠相比，柚皮苷飼養組中小鼠的總血漿膽固醇濃度下降32％，而柚苷配基飼養組中小鼠的總血漿膽固醇濃度下降18％。
表Ⅱ
*總-C總-膽固醇*HDL-C:HDL-膽固醇*TG甘油三酯實施例3柚皮苷和柚苷配基在HMG-CoA抑制中的活性(步驟1)制備微粒體為確定用柚皮苷和柚苷配基飼養小鼠對HMG-CoA還原酶活性的作用，從肝組織中制備微粒體作為酶源，所述還原酶是調節肝臟中膽固醇之生物合成的酶。
首先，將上述三組小鼠斷頭處死，取出肝臟，并立即放置在冰冷卻的勻漿介質(50mM KH2PO4(pH7.0)，0.2M蔗糖，2mM二硫蘇糖醇(DTT))中。在勻漿介質(2ml介質/g肝臟)中用Waring混合器(三沖程的Potter-Elvehjem型玻璃勻漿器，帶有一個馬達驅動的Teflon研杵)使肝臟勻漿15秒。在15000×g下離心勻漿10分鐘，由此得到的上清液在100000×g下離心75分鐘，得到微粒體沉淀，然后將該沉淀重新懸浮在包含50mM EDTA的勻漿介質中，然后在100000×g下離心60分鐘。用包含微粒體的上清液作為酶源。(步驟2)HMG-CoA還原酶實驗如下根據Shapiro等人的方法(Biochemical et Biophysica Acta,370,369-377(1974))使用[14C]HMG-CoA測定HMG-CoA還原酶的活性。
在37℃下活化含微粒體之上清液(步驟1中得到的)中的酶30分鐘。在反應試管中加入20μl的HMG-CoA還原酶實驗緩沖液(0.25MKH2PO4(pH7.0),8.75mM EDTA,25mM DTT,0.45M KCl和0.25mg/mlBSA)、5μl的50mM NADPH、5μl的[14C]HMG-CoA(0.05μCi/試管，最終濃度120μM)和10μl之經活化的微粒體酶(0.03-0.04mg)，然后混合物在37℃下培育該混合物30分鐘。在該混合物中加入10μl的6M鹽酸，由此使反應停止，然后在37℃下培育該混合物15分鐘，使產物(甲羥戊酸)完全內酯化。在10000×g下離心1分鐘，由此除去沉淀物，然后將上清液用在硅膠60G TLC板(Altech,Inc.,Newark,USA)上，并用苯∶丙酮(1∶1,v/v)展開。用一次性載玻片刮下Rf值在0.65-0.75之間的區域，并用1450Microbeta液體閃爍計數器(Wallacoy,Finland)進行放射活性實驗。以pmol合成的甲羥戊酸/分鐘/mg蛋白計算酶活性。結果見表Ⅲ。表Ⅲ
從表Ⅲ的結果可以看出，對照組小鼠具有相對較高的HMG-CoA還原酶活性，而柚皮苷飼養組和柚苷配基飼養組小鼠中觀察到的HMG-CoA活性則分別低于對照組25％和31％。實施例4口服給藥柚皮苷的毒性在22±1℃的溫度、55±5％的濕度和光照周期12L/12D的條件下，飼養7-8周齡、無特定病原的ICR雌鼠(8只)和雄鼠(8只)，雌鼠重量在25-29g，雄鼠重量在34-38g。將飼料(Cheiljedang Co.，鼠飼料)和水消毒，然后喂給小鼠。
將柚皮苷溶解在0.5％Tween80中，至濃度為100mg/ml，然后將該溶液口服給藥至小鼠，用量為0.2ml/20g小鼠體重。給藥所述溶液后，按以下程序觀察小鼠10天并記錄副作用或死亡現象給藥后1、4、8和12小時，以后則每隔12小時觀察。每天記錄小鼠體重變化，以檢查柚皮苷的作用。另外，在第10天時，將小鼠處死，并肉眼檢查內部器官。
在第10天時所有小鼠都存活，而且1000mg/kg劑量的柚皮苷沒有毒性。尸檢結果是，小鼠沒有形成任何病理非正常性，而且在10天的檢查期間沒有觀察到體重減輕。因此，可得出以下結論柚皮苷在口服給藥動物時沒有毒性。
以下制劑實施例僅用于說明本發明，而絕不是限制本發明的范圍。制劑實施例使用以下成分制備硬明膠膠囊量(mg/膠囊)活性成分(柚皮苷)20干燥淀粉 160硬脂酸鎂20總計 200mg雖然已參考上述具體實施方案對本發明進行了描述，但應認識到，本領域技術人員在本發明的范圍內還可進行各種改進和變化，而本發明的范圍為以下權利要求書所限定。
權利要求
1.一種用于抑制哺乳動物中3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶活性的藥物組合物，其包括有效量之作為活性成分的柚皮苷或柚苷配基以及藥物學上可接受的載體。
2.如權利要求1所述的藥物組合物，其中，所述哺乳動物是人。
3.如權利要求2所述的藥物組合物，其中，柚皮苷的有效量為0.05-300mg/kg體重/天。
4.如權利要求2所述的藥物組合物，其中，柚苷配基的有效量為0.05-300mg/kg體重/天。
5.一種用于抑制哺乳動物中3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶活性的食品組合物，其包括有效量的柚皮苷或柚苷配基。
6.一種用于抑制哺乳動物中3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶活性的飲料組合物，其包括有效量的柚皮苷或柚苷配基。
全文摘要
本發明涉及一種用于抑制哺乳動物中3－羥基－3－甲基戊二酰輔酶A(HMG－CoA)還原酶活性的藥物組合物,其包括有效量之作為活性成分的柚皮苷或柚苷配基以及藥物學上可接受的載體。本發明還涉及用于抑制哺乳動物中3－羥基－3－甲基戊二酰輔酶A(HMG－CoA)還原酶活性的食品或飲料組合物,其包括有效量的柚皮苷或柚苷配基。
文檔編號A61K31/352GK1233174SQ97198802
公開日1999年10月27日 申請日期1997年10月13日 優先權日1996年10月14日
發明者卜成海, 孫光熙, 鄭泰淑, 權柄穆, 金永國, 崔度一, 金成郁, 裴基煥, 樸鏞福, 崔明淑, 黃仁奎, 文錫植, 權容國, 安貞娥, 李恩淑 申請人:韓國科學技術研究院