重構的hdl配制劑的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及重構的高密度脂蛋白配制劑，尤其涉及具有適宜的穩定性和藥物用途 的生物學特性的配制劑。
【背景技術】
[0002] 高密度脂蛋白（HDLs)構成一系列存在于普通血清的脂蛋白顆粒。成熟HDL顆粒以 含有蛋白質和脂質的球狀結構形式存在。這些顆粒的外層中是更具極性的脂質、磷脂和游 離膽固醇，全部具有向外指向含水環境的帶電基團。更疏水的脂質比如酯化的膽固醇和甘 油三酯位于顆粒的核心。新形成的或初生的HDL顆粒缺少脂質從而呈盤狀。蛋白質組分包 埋在外層中。主要蛋白質組分是具有較少量的ApoA-II，ApoA-IV，ApoCIII，ApoD，Apo E和ApoJ的載脂蛋白A-I(ApoA-I)。各種其它蛋白質位于HDL顆粒上，比如卵磷脂-膽 固醇乙酰基轉移酶，PAF乙酰基水解酶和對氧磷酶。HDLs的特征是高密度（>1. 063g/ml)和 小尺寸（Stoke直徑=5至17nm)。
[0003] 已經努力開發人工HDLs，其能夠輸注入患者血流中以模擬天然HDLs的生物學效 果。這些人工顆粒一般稱為〃重構的HDL〃 (rHDL)，或有時稱為HDL模擬物或合成的HDL顆 粒。人工顆粒含有天然顆粒組分，尤其是ApoA-I和脂質。例如，WO2012/000048描述包 含ApoA-I，磷脂酰膽堿（PC)和少量膽酸鈉的rHDL。WO2012/109162描述包含ApoA-I， 鞘磷脂（SM)和磷脂酰甘油（例如1，2-二棕櫚酰基-sn-甘油-3-[磷酸-rac-(l-甘油）] (DPPG))的rHDL。
[0004] 方便的是在使用前凍干（冷凍-干燥）rHDL配制劑。凍干是制備固體蛋白質藥物 所通常使用的方法。然而，該過程產生各種冷凍和干燥壓力，比如溶劑化蛋白質的濃度，形 成冰晶體，pH變化等。全部這些壓力能夠以不同程度使蛋白質變性。從而，在蛋白質配制劑 中常常需要穩定劑來保護在冷凍和干燥過程期間的蛋白質穩定性。為了保持rHDL配制劑 在凍干期間的穩定性，已使用穩定劑如糖類和糖醇。例如，US5, 089, 602公開血漿衍生的脂 蛋白，其用10%蔗糖或10%蔗糖和5%甘露醇的混合物穩定化。WO2012/000048公開糖和 糖醇穩定劑，以約65至85g/LrHDL配制劑（相當于約6.5至8.5%w/w)的濃度使用。WO 2012/109162公開作為穩定劑的鹿糖和甘露醇，分別以4%w/w和2%w/w用于混合物中。 Kim等人，BiotechnologyandBioprocessEngineering16, 785-792 (2011)調查了rHDL 的制備和放置穩定性。其中，ApoA-I:大豆PC比率1:150的rHDL并不能被1或5%蔗糖 充分地穩定化，而10%鹿糖被描述為最佳。
[0005] 這些文獻的rHDL配制劑期望用于輸注療法，但是輸注產品中的高糖濃度可以導 致或惡化腎問題。在rHDL的靶標患者群體這是特別的問題，原因在于這些患者常常有腎損 傷。
[0006] 因此本發明的目的是，提供與這些先前的配制劑相比備擇或改善的rHDL配制劑。 尤其是，發明人尋求具有降低的腎毒性的穩定的rHDL配制劑。
[0007] 該問題通過根據權利要求1的配制劑得以解決。進一步優選實施方式定義在從屬 權利要求中。
[0008] 令人驚訝地，已發現權利要求1的rHDL配制劑顯示良好的長期穩定性。通過含有 比先前配制劑更少的凍干穩定劑，本申請配制劑也具有更低的腎毒性風險。低凍干穩定劑 濃度還可以允許rHDL在rHDL功能的功能測試表現更佳。發明人還已發現氨基酸、特別是 脯氨酸是有用的rHDL配制劑凍干穩定劑。 發明概要
[0009] 本發明提供rHDL配制劑，其包含載脂蛋白、脂質和凍干穩定劑，其中載脂蛋白與 脂質的比率是約1:20至約1:120 (mol:mol)。
[0010] 優選，凍干穩定劑以約1. 0%至約6. 0% (w/wrHDL配制劑），例如1. 0,1. 1，1. 2或 1. 3至5. 5, 5. 6, 5. 7, 5. 8, 5. 9或6. 0的濃度存在。這種低量的凍干穩定劑可以降低腎毒性 風險。其也特別適于在急性冠脈綜合征治療（ACS)期間接受造影劑的患者，原因在于這些 試劑可以與凍干穩定劑競爭在腎清除。在優選的實施方式中，凍干穩定劑以約1.0%至小 于6. 0%例如約1. 0%至5. 9%的濃度存在。優選凍干穩定劑以約3. 0至小于6. 0%，例如 約3. 0至5. 9%的濃度存在。更優選，凍干穩定劑以約4. 0至5. 5%，特別4. 3至5. 3%，更 特別4. 3至5. 0%，和最優選4. 6至4. 8% (w/w)的濃度存在。所述配制劑顯示良好的穩定 性和低腎毒性。
[0011] 另選或此外，優選的載脂蛋白與凍干穩定劑的比率是約1:1至約l:3(w:w)。尤其 是，載脂蛋白與凍干穩定劑的比率是約1:1至約1:2. 4(w:w)，例如小于l:2(w:w)。發明人 已發現這些配制劑保持穩定、凍干樣品尺度分布顯示很少的變化或不顯示變化，甚至在貯 藏（儲存）數月之后亦如此。然而，在某些實施方式中，載脂蛋白與凍干穩定劑的比率可以 小于該，例如約1:1至約1:7,和尤其是約1:1至約l:5(w:w)。
[0012] 本發明也提供包含載脂蛋白、脂質和凍干穩定劑的rHDL配制劑，其中凍干穩定劑 包含氨基酸。優選氨基酸是脯氨酸。發明人已發現氨基酸是rHDL配制劑的良好凍干穩定 劑，特別是在具有低量其它穩定劑的混合物中如此。
[0013] 本發明也提供前述的rHDL配制劑，用于預防或治療人類的疾病、障礙或病癥。適 宜地，疾病、障礙或病癥響應rHDL配制劑的預防性或治療性給予。
[0014] 發明詳述
[0015] 在本發明的上下文中，術語〃重構的HDL(rHDL)配制劑〃意指任何人工制備的脂 蛋白配制劑或組合物，其功能上相似、類似、相應于或模擬高密度脂蛋白（HDL)，一般存在于 血漿中。rHDL配制劑在其范圍內包括〃HDL模擬物〃和〃合成的HDL顆粒〃。
[0016] 在本發明的上下文中，術語〃凍干穩定劑〃意指在凍干期間穩定化蛋白質的物 質。這種凍干穩定劑是本領域熟知的且綜述于例如Wang(2000)InternationalJournalof Pharmaceuticals203:1-60。用于本發明中的優選凍干穩定劑包含糖，糖醇，氨基酸或其混 合物。例如，發明人已發現二糖比如蔗糖是用作凍干穩定劑的特別適宜的糖類。可以使用 的其它二糖包括果糖，海藻糖，麥芽糖和乳糖。除了二糖之外，還可以使用三糖如棉子糖和 麥芽三糖。更大的低聚糖例如麥芽五糖、麥芽六糖和麥芽七糖也可以是適宜的。另選地，可 以使用單糖如葡萄糖，甘露糖和半乳糖。這些一、二、三和更大的寡糖可以單獨或彼此組合 使用。如上文所述，還可以使用糖醇作為凍干穩定劑。這些糖醇還可以單獨或組合使用。本 發明中所用的特別糖醇是甘露醇。可以使用的其它糖醇包括肌醇，木糖醇，半乳糖醇和山梨 醇。其它多元醇如甘油也可以是適宜的。可以用作凍干穩定劑的氨基酸包括脯氨酸，甘氨 酸，絲氨酸，丙氨酸和賴氨酸。還可以使用修飾的氨基酸例如4-羥脯氨酸，L-絲氨酸，谷氨 酸鈉，肌氨酸和Y-氨基丁酸。發明人已發現脯氨酸是用作凍干穩定劑的特別適宜的氨基 酸。
[0017] 在特別的實施方式中，凍干穩定劑包含糖和糖醇的混合物。例如，可以使用蔗糖和 甘露醇的混合物。糖和糖醇可以以任意適宜比率，例如約I:I(w:w)至約3:1 (w:w)，和尤其 是約2:1 (w:w)混合。特別預期的是比率小于2:1，例如小于3:2。一般地，比率大于1:5,例 如大于l:2(w:w)。在某些實施方式中，配制劑包含小于4%鹿糖和2%甘露醇（w/wrHDL配 制劑），例如3%蔗糖和2%甘露醇。在某些實施方式中，配制劑包含4%蔗糖和小于2%甘 露醇。在某些實施方式中，配制劑包含小于4%蔗糖和小于2%甘露醇例如約1. 0%至3. 9% 鹿糖和約1. 0%至I. 9% (w/w)甘露醇。
[0018] 在特別的實施方式中，凍干穩定劑包含糖和氨基酸的混合物。例如，可以使用蔗 糖和脯氨酸的混合物。糖和氨基酸可以以任意適宜比率，例如約1:1至約3:1 (w:w)，和尤 其是約2:l(w:w)混合。特別預期的是比率小于2:1，例如小于3:2(w:w)。一般地，比率大 于1:5,例如大于1:2 (w:w)。優選，氨基酸以約I. 0至約2. 5%例如I. 0，1. 2或1. 3至2. 0， 2. 1，2. 2, 2. 3, 2. 4或2.5 % (w/wrHDL配制劑）的濃度存在。在某些實施方式中，配制劑包 含1. 0%蔗糖和2. 2%脯氨酸，或3. 0%蔗糖和1. 5%脯氨酸，或4%蔗糖和1. 2%脯氨酸。可 以將氨基酸加入糖中以保持等滲溶液。同滲質量摩爾濃度大于350m〇sm〇l/kg的溶液一般 是高滲的，而小于250mosmol/kg的