專利名稱：一種重組人淋巴毒素α的構建與生產工藝的制作方法
技術領域：
本發明屬生物制藥領域，主要涉及一種重組人淋巴毒素α(recombinant human lymphotoxin α，rhLT-α)的構建與生產工藝。
背景技術：
淋巴毒素α(1ymphotoxinα，LT-α)是腫瘤壞死因子(TNF)家族的一個成員，其全長由171個氨基酸殘基組成，N端62位有一個糖基化位點，糖基化后分子量為25kD。LT-α是一個重要的免疫調節因子，可以促進T淋巴細胞、B淋巴細胞、單核細胞等多種免疫細胞的增殖和分化，同時對外周淋巴器官的發育有重要作用，敲除該基因的小鼠其外周淋巴結和派伊爾氏淋巴集結的發育出現嚴重缺陷[Paul等，Ann.Rev.Immunol.，6407-438(1988)；Radke等，Leukemia，12493-498(1998)]。LT-α另一項重要的生物學功能是抑制腫瘤細胞生長，促進惡變細胞凋亡。在這一點上它與腫瘤壞死因子α(TNF-α)有很多相似之處，例如二者都可誘導宮頸癌、肺癌、胃癌、前列腺癌等多種惡變細胞凋亡[Funahashi等，J.Immunother.，1028-38(1991)；Beran等，Blood，69721-726(1987)]，同時LT-α又有其自身的作用特點，主要表現為對一些腫瘤細胞，在產生同等抑制作用的情況下，LT-α的毒副作用顯著低于TNF-α[Qin等，Blood，852779-2785(1995)]；LT-α在體內的半衰期比TNF-α長[Kawatsu等，J.Pharmacobio-Dyn，13549-557(1990)]；LT-α不僅與放化療藥物之間具有明顯的協同作用，而且在殺傷腫瘤細胞的同時，保護正常細胞免遭放化療藥物的損傷[Wong等，J.Cellular Biochem.，6056-60(1996)]；LT-α不僅能直接殺傷腫瘤細胞，還可刺激細胞因子的分泌，促進腫瘤周圍淋巴組織的生長，從而調動多種免疫細胞攻擊腫瘤細胞，抑制惡性腫瘤的生長[Qin等，Cancer Research，554747-4751(1995)；Schrama等，Immunity，14111-121(2001)]。
鑒于LT-α具有上述功能，因此很有希望開發成一種抗癌新藥。但研究發現，全長LT-α在大腸桿菌中的表達產物不均一，而且表達量也很低，這種情況給新藥開發帶來一定困難。近年有研究顯示，LT-α的N端序列對其功能并不重要，在缺失部分氨基酸殘基的情況下其生物學活性不受影響。因此多年來人們一直試圖純化LT-α及其多種缺失突變體，并對以可溶性形式和包涵體形式表達的蛋白進行了純化。但純化工藝僅停留在小量制備階段，而且不夠成熟[Schoenfeld等，J.Biol.Chem.，2663863-3869(1991)；Jin等，J.Chem.Tech.Biotechnol.，5967-72(1994)；Loh等，J.Chromatogr.A，760165-171(1997)；Lebedev LR等，Appl.Biochem.Microbiol.，34110-115(1998)；]。
有研究顯示，LT-αN端最多可缺失27個氨基酸殘基，而且這種缺失體與完整分子相比其活性不僅沒有降低反而有所升高[Nakamura等，Int.J.Cancer，48744-748(1991)]，因此這種結構的LT-α分子可能在臨床應用方面更有前景。有兩篇專利涉及到這種LT-α分子的純化[CN 1175638A、CN1311255A]。
發明內容
我們在大腸桿菌中高效表達了這種N端缺失27個氨基酸殘基的LT-α，并將之命名為重組人淋巴毒素α(rhLT-α)，同時建立了rhLT-α高效穩定的生產工藝。本發明的目的在于提供一種rhLT-α的構建及生產工藝，以便進一步將其開發為抗腫瘤藥物。本發明的主要內容包括利用反轉錄PCR(RT-PCR)獲得編碼rhLT-α的基因序列，并將之導入帶有T7強啟動子的高效表達載體pET-23b，然后轉化大腸桿菌BL21(DE3)，獲得高表達工程菌株；使用改良M9培養基在發酵罐中發酵工程菌；破碎工程菌后提取的包涵體經簡單洗滌后用尿素或鹽酸胍溶解，然后用Tris-HCl緩沖液或硼酸溶液復性；復性液相繼用DEAE-Sepharose FF離子交換柱層析、Phenyl-Sepharose FF疏水柱層析和DEAE-Sepharose FF離子交換柱層析純化，最后獲得純度高于99％、比活性高于8×107U/mg的重組蛋白。
下面是本發明詳細的技術路線1.rhLT-α基因片段的獲得和工程菌的構建Jurkat細胞經佛波醇乙酯(PMA)和植物凝集素(PHA)刺激后，提取其總RNA，以總RNA為模版，用Promega公司的M-MLV反轉錄試劑盒進行反轉錄。以反轉錄產物為模板進行PCR，回收440bp大小的PCR產物，經限制性內切酶Nde I和EcoR I處理后，與經同樣酶切處理的表達載體pET-23b連接，然后轉化大腸桿菌BL2l(DE3)，構建成可高效表達rhLT-α的工程菌株。rhLT-α的核苷酸序列和氨基酸序列見附錄。
2.工程菌的發酵工程菌在裝量為50升的發酵罐中培養，使用改良M9培養基，30-37℃發酵培養，當OD600達到15左右時，加入IPTG至終濃度為0.05-1.0mM，繼續培養3-4小時。各項發酵參數的控制和培養基的添加按常規進行。rhLT-α的表達量可占工程菌蛋白總量的40％左右，表達產物以包涵體的形式存在。
3.rhLT-α的粗純離心收集發酵后的菌體，用高壓勻漿泵或超聲波破碎儀破碎菌體，高速離心后收集沉淀。沉淀經包涵體洗滌液A(25mM/L Tris-HClpH8.5，5mM EDTA，0.1％-1％Triton X-100)和洗滌液B(25mM/LTris-HCl pH8.5，5mM EDTA，2M尿素)洗滌后，SDS-PAGE電泳純度可達70％以上。用高濃度的尿素(6M以上)或鹽酸胍(4M以上)溶解包涵體，離心后收集上清，然后用5-100mM的Tris-HCl緩沖液或5-100mM的硼酸溶液稀釋復性，獲得rhLT-α的復性液。
4.rhLT-α的精純上述復性液先上DEAE-Sepharose FF離子交換柱，平衡緩沖液使用25mM Tris-HCl、pH8.5，洗脫緩沖液使用25mM Tris-HCl、0.2NNaCl、pH8.5。然后將洗脫組分用10％(NH4)2SO4、25mM Tris-HCl、pH8.5 10倍稀釋后上Phenyl-Sepharose FF疏水柱，平衡緩沖液使用10％(NH4)2SO4、25mM Tris-HCl、pH8.5，洗脫緩沖液使用2％(NH4)2SO4、25mM Tris-HCl、pH8.5。此步驟的洗脫組分用25mMTris-HCl、pH8.5 10倍稀釋后上DEAE-Sepharose FF離子交換柱，平衡緩沖液使用25mM Tris-HCl、pH8.5，洗脫緩沖液使用25mMTris-HCl、0.2N NaCl、pH8.5，該步驟的洗脫組分即為最終純化產物。
經上述過程獲得的重組蛋白，經分子篩HPLC、反向HPLC和SDS-PAGE電泳檢測，純度高于99％；以R&D公司生產的hLT-α為測活標準品，用小鼠成纖維肉瘤細胞株L-929測活，比活性高于8×107U/mg；以飛行時間質譜檢測，分子量為15976.72道爾頓；以等電聚焦法檢測，等電點為pH7.3；以鱟試劑檢測，內毒素含量小于1EU/mg；另外，用R&D公司生產的抗hLT-α的抗體可完全中和重組蛋白的生物活性，純化產物N端和C端的氨基酸序列也與理論值完全一致。
本發明優選的技術路線為包涵體增溶液使用高濃度尿素，復性液使用25mM Tris-HCl、pH8.5。
本領域技術人員根據本發明的啟示，結合本領域的常識所做的各種變更，均落在本申請權利要求的范圍內。
本發明的有益效果主要有以下幾點1.構建了高表達工程菌株，目的蛋白表達量可占菌體總蛋白的40％左右，且表達產物以致密的包涵體形式存在，經簡單洗滌后其電泳純度即高達70％左右，為rhLT-α的大規模制備奠定了良好基礎。
2.本發明使用的復性液成分簡單，僅為普通的Tris-HCl緩沖液或硼酸溶液，沒有復雜昂貴的添加成分，可大幅度降低生產成本。
3.整個精純過程使用一致的pH值，避免了各洗脫組分pH值的反復調節，減少了操作過程對目的蛋白生物活性的影響。
4.精純各步驟的過渡環節沒有使用透析、硫酸銨沉淀等耗時費力的技術，而是簡單將液體稀釋后即進入下一純化步驟，這使整個純化流程明顯縮短，效率顯著提高。
總之，本發明獲得了rhLT-α的高表達工程菌株，建立了穩定、高效、易放大的純化工藝，純化總得率高于40％，蛋白純度高于99％，以R&D公司生產的hLT-α為測活標準品，重組蛋白的生物活性高于8×107U/mg。因此本發明的工程菌株和純化工藝適合于rhLT-α的規模化生產。
四
具體實施例方式
1.rhLT-α基因片段的獲得和工程菌的構建1)引物設計
根據要擴增片段的序列情況，設計一對引物，為方便PCR產物與表達載體的連接，在引物上分別加入Nde I和EcoR I限制性內切酶位點。引物序列如下上游引物P15’》CGAGCCATATGAAA CCG GCT GCT CAC CTC ATT G《3’Nde I下游引物P25’》CGGAATTCTAC AGA GCG AAG GCT CCA AAG A《3’EcoR I2)細胞培養、總RNA提取和反轉錄PCRJurkat細胞用RPMI1640、10％小牛血清培養，加入佛波醇乙酯(PMA)和植物凝集素(PHA)分別至終濃度為30ng/ml和2μg/ml，繼續培養4小時。收集細胞，用Gibco公司的Trizol試劑提取總RNA，以總RNA為模版，用Promega公司的M-MLV反轉錄試劑盒進行反轉錄。上述具體操作參照相關產品使用說明書進行。以反轉錄產物為模板，P1、P2為引物進行PCR，PCR循環條件為95℃，2分鐘→(95℃，40秒→62℃，1分鐘→72℃，1分鐘)×30個循環→72℃，10分鐘。PCR產物立即進行下述操作或置低溫冰箱凍存。
3)重組表達載體和工程菌構建上述PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳分離，回收440bp的DNA片段，然后用Nde I/EcoR I酶切，與經同樣酶切處理的原核表達載體pET-23b連接，構建成重組表達質粒，將該質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)，即獲得工程菌株。
4)工程菌發酵[1]菌種庫建立用基因重組構建的高效表達rhLT-α的基因工程菌株，經質粒酶切圖譜、cDNA序列、菌種理化及培養特性、表達產物分析，具有原始菌種特性，將其凍干保存，建立原始菌種庫；再從原始庫中傳出，經擴大培養后凍干保存，經檢定符合制造菌種庫的檢定指標，建立制造菌種庫；再從制造菌種庫中傳出，經擴大培養挑選高產菌株，用15％甘油低溫保存作為生產菌種庫。
種子復蘇與種子批培養每次生產從生產菌種庫中取出一管菌種，劃線于100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，37℃培養18小時，取10個單克隆化菌落分別于10個含5ml LB培養基(含100μg/ml的氨芐青霉素的大試管中)，然后于37℃下搖動培養12小時，再將4ml菌液接入含400ml LB的1000ml三角瓶中培養8小時即可作為種液用于發酵培養。
發酵培養配制改良的M9培養基50升，其中含150g tryptone，250g yeastextract，25g NaCl，50g(NH4)2SO4，756g Na2HPO4，180g KH2PO4，120gMgSO4，0.67g CaCl2。將發酵培養基以50升量置NBS公司MP-80發酵罐中，進行實罐滅菌，再將4000ml上述培養種子液接種于該培養基中，30-37℃發酵培養。通過補加2N的氨水控制pH值在7.0左右，通過調整空氣通量和轉速控制溶解氧濃度在30％左右，保持罐壓為5PSA。當菌體生長進入相對停滯期后，開始補加50％的葡萄糖。當菌體OD600達到15左右(大約培養6小時)，加入IPTG至0.2mM，繼續培養4小時，終止發酵。
5)rhLT-α的粗純[1]菌體收集發酵結束后，立即用CEPA公司生產的CEPA-100L-2Z高速連續流離心機對培養液進行連續離心分離，控制溫度4℃，轉速為16000轉/分，流速為60升/小時，離心結束后收取菌體，稱量濕重。可得濕菌體2.0-2.5kg，rhLT-α的表達量為菌體總蛋白的40％左右。
菌體裂解將50克菌體懸浮于500～1000ml含5mM EDTA的25mM Tris-HCl緩沖液(pH8.5)中，超聲波破碎進行菌體裂解，將所得的細胞裂解液以12000轉/分的轉速離心30分鐘，收集沉淀即rhLT-α包涵體。
包涵體的洗滌洗滌液A25mM/L Tris-HCl pH8.5，5mM EDTA，1％Triton X-100洗滌液B25mM/L Tris-HCl pH8.5，5mM EDTA，2M尿素稱量上述包涵體的濕重為7克，按每克包涵體加入10-30ml的洗滌液，重懸包涵體，室溫震蕩20-30分鐘，離心收集沉淀。包涵體經上述兩種洗滌液連續洗滌后，電泳純度達到70％以上，濕重為4克。
包涵體的復性一每克包涵體加入20-40ml的包涵體增溶液(8M尿素，25mM/LTris-HCl pH8.5)，室溫攪拌2小時左右，溶解包涵體。12000rpm離心30分鐘，取上清。然后將上清用25mM Tris-HCl pH8.5，40-100倍稀釋復性，室溫放置2-3小時或4℃過夜。
包涵體的復性二將上述包涵體增溶液換為6M鹽酸胍(pH8.5)，復性液換為20mM硼酸溶液(pH8.5)。
5)rhLT-α的精純[1]DEAE Sepharose Fast Flow離子交換柱層析層析柱XK50×35(Amersham Pharmacia)填料DEAE-Sepharose Fast Flow(Amersham Pharmacia)流動相A液為25mM/L Tris-HCl緩沖液(pH8.5)B液為含0.2M氯化鈉的A液用0.5M NaOH，流速30ml/min，在位滅菌60分鐘，用A液平衡層析柱至pH值為8.5，流速50ml/min，然后以同樣的流速上rhLT-α的復性液，上樣完畢，再用A液沖洗3-5個柱體積，然后用B液洗脫，流速30ml/min，收集洗脫峰。收集總蛋白量為1000-1200mg，純度為95％[2]Phenyl-Sepharose Fast Flow疏水柱層析層析柱XK50×35(Amersham Phamacia)
填料Phenyl-Sepharose Fast Flow(Amersham Pharmacia)流動相A液為10％的硫酸銨，25mM/L Tris-HCl緩沖液(pH8.5)B液為2％的硫酸銨，25mM/L Tris-HCl緩沖液(pH8.5)用0.5M NaOH，流速30ml/min，在位滅菌60分鐘，用1M NaCl沖洗兩到三個柱體積，用A液平衡層析柱至pH值為8.5，流速40ml/min，將DEAE-Sepharose FF的洗脫組分用A液稀釋10倍，然后以20ml/min的流速上樣，上樣完畢，再用A液沖洗3-5個柱體積，然后用B液洗脫，流速20ml/min，收集洗脫峰。收集總蛋白量為900-1100mg，蛋白純度為99％。
DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換柱層析層析柱XK50×35(Amersham Pharmacia)填料DEAE-Sepharose Fast Flow(Amersham Pharmacia)流動相A液為25mM/L Tris-HCl緩沖液(pH8.5)B液為含0.2M氯化鈉的A液用0.5M NaOH，流速30ml/min，在位滅菌60分鐘，用A液平衡層析柱至pH值為8.5，流速40ml/min，將Phenyl-Sepharose FF的洗脫組分用A液稀釋10倍，然后以20ml/min的流速上樣，上樣完畢，再用A液沖洗3-5個柱體積，然后用B液洗脫，流速20ml/min，收集洗脫峰。收集總蛋白量為860-1050mg，蛋白純度為99％。
在上述純化過程中，包涵體的復性效率為80％，DEAE-SepharoseFF、Phenyl-Sepharose FF、DEAE-Sepharose FF的純化效率分別為70％、90％和95％，整個純化過程的總收率高于40％，1克發酵后的工程菌可獲得20mg的rhLT-α純品。
附錄一種重組人淋巴毒素α(rhLT-α)的的核苷酸序列和氨基酸序列<110>北京三元基因工程有限公司 北京畢艾歐科技發展有限責任公司<120>一種重組人淋巴毒素α的構建與生產工藝<160>2<210>1<211>438<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>在人淋巴毒素αcDNA的5’端缺失了81個堿基，同時添加了1個蛋氨酸的密碼子ATG。
<400>1atgaaaccgg ctgctcacct cattggagac cccagcaagc agaactcact gctctggaga 60gcaaacacgg accgtgcctt cctccaggat ggtttctcct tgagcaacaa ttctctcctg 120gtccccacca gtggcatcta cttcgtctac tcccaggtgg tcttctctgg gaaagcctac 180tctcccaagg ccacctcctc cccactctac ctggcccatg aggtccagct cttctcctcc 240cagtacccct tccatgtgcc tctcctcagc tcccagaaga tggtgtatcc agggctgcag 300gaaccctggc tgcactcgat gtaccacggg gctgcgttcc agctcaccca gggagaccag 360ctatccaccc acacagatgg catcccccac ctagtcctca gccctagtac tgtcttcttt 420ggagccttcg ctctgtag 438
<210>2<211>145<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>在人淋巴毒素α的N端缺失了27個氨基酸殘基，同時添加了1個蛋氨酸殘基。
<400>2Met Lys Pro Ala Ala His Leu Ile Gly Asp Pro Ser Lys Gln Asn15 10 15Ser Leu Leu Trp Arg Ala Asn Thr Asp Arg Ala Phe Leu Gln Asp20 25 30Gly Phe Ser Leu Ser Asn Asn Ser Leu Leu Val Pro Thr Ser Gly35 40 45Ile Tyr Phe Val Tyr Ser Gln Val Val Phe Ser Gly Lys Ala Tyr50 55 60Ser Pro Lys Ala Thr Ser Ser Pro Leu Tyr Leu Ala His Glu Val
65 70 75Gln Leu Phe Ser Ser Gln Tyr Pro Phe His Val Pro Leu Leu Ser80 85 90Ser Gln Lys Met Val Tyr Pro Gly Leu Gln Glu Pro Trp Leu His95 100 105Ser Met Tyr His Gly Ala Ala Phe Gln Leu Thr Gln Gly Asp Gln110 115 120Leu Ser Thr His Thr Asp Gly Ile Pro His Leu Val Leu Ser Pro125 130 135Ser Thr Val Phe Phe Gly Ala Phe Ala Leu140 14權利要求
1.一種重組人淋巴毒素α(rhLT-α)的構建與生產工藝，主要包括用RT-PCR的方法獲得rhLT-α的cDNA，并將其克隆入原核表達載體，轉化大腸桿菌獲得工程菌株，工程菌通過一系列的發酵、粗純和精制過程獲得rhLT-α純品，其特征在于(1)rhLT-α與天然分子相比，N端缺失了27個氨基酸殘基，包括附加上的第一個甲硫氨酸殘基，整個分子共有145個氨基酸殘基組成；(2)所用的原核表達載體帶有T7啟動子；(3)發酵培養基使用改良M9培養基或其它適合工程菌生長的培養基；(4)包涵體洗滌后用高濃度的尿素或鹽酸胍增溶；(5)復性液使用Tris-HCl緩沖液或硼酸溶液；(6)相繼用陰離子交換柱層析、Phenyl-Sepharose FF疏水柱層析和陰離子交換柱層析進行純化。
2.如權利要求1所述，其中包涵體洗滌液中含有0.1％-2％的Triton X-100。
3.如權利要求1所述，其中包涵體增溶使用6M以上的尿素或4M以上的鹽酸胍。
4.如權利要求1所述，其中復性液中含有5-100mM的Tris-HCl緩沖液或5-100mM的硼酸溶液。
5.如權利要求1所述，陰離子交換柱層析的洗脫組分在用Phenyl-Sepharose FF疏水柱層析純化之前，先用(NH4)2SO4溶液稀釋。
6.如權利要求1所述，Phenyl-Sepharose FF疏水柱層析的洗脫組分在用陰離子交換柱層析純化之前，先用Tris-HCl緩沖液稀釋。
全文摘要
本發明的rhLT－α與天然分子相比，其N端缺失了27個氨基酸殘基，本表明利用反轉錄PCR獲得了目的基因序列，然后構建了高效重組表達載體，轉化大腸桿菌獲得高表達工程菌株，并建立了工程菌發酵、包涵體洗滌和復性、以及利用多種層析介質獲得rhLT－α純品的方法。純化總收率高于40％，樣品純度高于99％，比活性與國際同類產品相當。因此本發明得到的工程菌和建立的純化工藝適合于rhLT－α的大規模生產。
文檔編號C07K14/435GK1511953SQ02159949
公開日2004年7月14日 申請日期2002年12月30日 優先權日2002年12月30日
發明者劉永全, 牛曉霞, 劉金毅, 孫儉波, 程永慶 申請人:北京三元基因工程有限公司, 北京畢艾歐科技發展有限責任公司