含有肽脂質的載體和使用該載體將化合物引入細胞的方法

專利名稱：：含有肽脂質的載體和使用該載體將化合物引入細胞的方法
技術領域：
：本發明涉及一種由含有肽脂質的脂質體組成的載體，該載體適于將化合物(如核酸)有效地引入細胞，本發明也涉及使用該載體將化合物引入細胞的方法。
背景技術：
：近來，各種疾病(如腦部疾病、AIDS和遺傳性疾病)已得到深入研究并且這些疾病中許多疾病的成因和相關基因已一皮揭示。與此4半隨的更大的希望在基礎研究領域已經寄予針對所闡明的靶基因的功能的基因傳遞上，以及在先進醫學領域中已經寄予用于疾病的基因治療。磷酸釣試劑、DEAE-葡聚糖試劑、脂質體試劑(例如，脂質轉染胺2000、脂質轉染物，等等)等被認為是市場上可以買到的用于將基因遞送入培養細胞的試劑。然而，在很多情況下，它們有細胞毒性，表現出低的向正常細胞的引入效率以及具有由于血清的存在而降低可1入效率的問題。而且，這些試劑不適用于面向實-驗動物和人的基因遞送。雖然使用裝置的方法(例如，微注射法、電穿孔法、粒子轟擊(基因槍)方法等)顯示比較高的引入效率，但是存在這些方法需要昂貴的裝置和大量技術人員、處理量低等問題。因為使用病毒載體的基因遞送方法在正常細胞中具有優越的引入效率和基因表達能力，所以它們在基因治療中最具吸引力。然而，由于病毒在體內的致病性(例如，誘發肺瘤)和病毒免疫原性(通過中和抗體而失活)，因此需要更安全的基因遞送技術。本發明的發明人已研究并發現陽離子脂質能夠將質粒DNA或siRNA高效地引入培養細胞或原生細胞，以及報道陽離子脂質適于將質粒(WO2005/054486)和適于將siRNA(日本專利申請No.2004-356071)從它們自己的陽離子脂質集合(JP-B-1984767)引入。此外，本發明的發明人發現使用糖脂可以將基因高效地引入培養細胞(日本專利申請號2005-080759)。發明的公開本發明的目的在于提供一種能夠將化合物經濟、容易、安全和有效地引入細胞的低毒性的新型化合物-載體，以及提供一種不使用專用設備，使用所述載體將化合物引入細胞的方法。為了達到上述目的，本發明的發明人獨立設計并合成了一種肽脂質的集合(系了肽部分的合成脂質)，并且發現該肽脂質適于在集合中引入質粒DNA和siRNA。這些適于引入核酸的肽脂質表現出優越的引入效率(即使在10%血清的存在下)和比已知的使用共軛磷脂的引入試劑低的細胞毒性。本發明的發明人基于這些發現進行了進一步的調查研究，/人而完成了本發明。因此，本發明提供(1)由下式(I)所代表的化合物其中W是氨基酸或具有1-10個氨基酸殘基的肽，W是任何氨基酸的側鏈，條件是R"具有羧基，所述羧基可以是含有具有l-30個碳原子的烴基的酯，和RS是具有l-30個碳原子的烴基；(2)上述(l)的化合物，其中W是氨基酸或具有1-5個氨基酸殘基的肽；(3)上述(1)或(2)的化合物，其中Ri含有至少一種選自Arg、Lys、Cys、Met、His、Tyr、Glu和Asp的氨基酸中的一個或多個殘基；(4)上述(3)的化合物，其中R1的N-末端氨基酸選自Arg、Lys、Cys、Met、His、Tyr、Glu和Asp;(5)上述(4)的化合物，其中R1的N-末端氨基酸是Arg或Lys;(6)上述(l)-(5)中任意一項的任意化合物，其中R2是-CH2COOR4或-C2H4COOR4(其中W是具有l-30個碳原子的烴基)；(7)上述(6)的化合物，其中R"是具有10-20個碳原子的無支鏈的烷基或無支鏈的不飽和烴基；(8)上述(l)-(7)中任意一項的任意化合物，其中W是具有10-20個碳原子的無支鏈的烷基或無支鏈的不飽和烴基；(9)用于將感興趣的化合物引入細胞的載體，其含有至少一種上述(1)-(8)的化合物；(10)上述(9)的載體，其中所述感興趣的化合物是核酸；(11)上述(10)的載體，其中所述核酸是質粒DNA、cDNA或反義DNA、或siRNA、miRNA、shRNA、mRNA、反義RNA或RNA復制子；(12)上述(9)的載體，其中所述感興趣的化合物是肽或蛋白質；(13)上述(9)-(12)中任意一項的載體和感興趣化合物的復合物；(14)用于將感興趣的化合物引入細胞的方法，所述方法包括使上述(13)的復合物與細胞接觸；和(15)用于將感興趣的化合物引入人或非人接受者體內的細胞中的方法，所述方法包括向接受者給予上述(13)的復合物。通過使用本發明的用于將化合物引入細胞的載體，即使在血清存在下，也可以非常高效地將化合物引入細胞。而且，由于本發明的肽脂質具有在細胞和生命組織中可降解(生物可降解性)的分子結構，這導致它的低細胞毒性，因此本發明的肽脂質在安全性上也優于病毒載體和市場上可以買到的引入試劑。附圖簡述圖1顯示肽脂質的頭部長度對質粒DNA進入CHO細胞(圖1A)和HC細胞(圖1B)的引入效率的影響。圖2顯示本發明的肽脂質和脂質轉染胺2000在siRNA進入CHO-EGFP細胞的引入效率和對CHO-EGFP細l包的細胞毒性上的劑量-從屬性，其中柱狀圖顯示相對的EGFP表達(％)而線形圖顯示細胞存活力(％)。圖3顯示肽脂質的頭部長度對siRNA進入CHO-EGFP細胞的引入效率的影響。圖4顯示具有堿性氨基酸頭部的肽脂質對質粒DNA進入細胞的引入效率的影響。圖5顯示具有各種連接物的肽脂質對siRNA進入CHO-EGFP細胞的引入效率和對CHO-EGFP細胞的細胞毒性的影響，其中白色柱形顯示相對的EGFP表達(％)而黑色柱形顯示細胞存活力(％)。圖6顯示肽脂質的尾部長度對質粒DNA進入CHO細胞(圖6A)和HC細胞(圖6B)的引入效率的影響。圖7顯示具有不飽和烴基的肽脂質對質粒DNA進入細胞的引入效率的影響。圖8顯示具有樹狀聚體型氨基酸序列的肽脂質對質粒DNA進入細胞的引入效率的影響。本發明的用于將化合物引入細胞的載體(以下也稱為本發明的載體)的特征在于其含有肽脂質，所述肽脂質具有由任意氨基酸或肽組成的頭部通過含有任意氨基酸的連接物部分與由任意烴鏈組成的尾部相連接的結構。具體地說，本發明的載體的特征在于其含有由下式(I)所代表的化合物其中W是氨基酸或具有1-10個氨基酸殘基的肽，R"是任何氨基酸的側鏈，條件是R"具有羧基，所述羧基可以是含有具有1-30個碳原子的烴基的酯，并且RS是具有l-30個碳原子的烴基。也就是說，W相當于頭部，-NHCH(R^CO-相當于連接物并且OR3相當于尾部。優選地，W是氨基酸或具有1-5個氨基酸殘基的肽。構成W的氨基酸可以是20種天然存在的氨基酸(Gly、Ara、Leu、Ile、Val、Arg、Lys、Glu、Gln、Asp、Asn、Cys、Met、His、Pro、Phe、Tyr、Thr、Ser、Trp)，或修飾或非天然的氨基酸(例如，2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、J3-丙氨酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2,3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、羥基賴氨酸、正纈氨酸、正亮氨酸、鳥氨酸等)。當氨基酸在除了C-末端以外的位置具有象基(或羧酸酯)時，羧基可以被酰胺化或酯化。作為用于這一情況的酯的實例，可以提到d—6烷基，例如曱基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基等；C3-8環烷基，例如環戊基、環己基等；(36-12芳基，例如苯基、a-萘基等；苯基-Cw烷基，例如芐基、苯乙基等；GM4芳烷基，例如a-萘基-d-2-烷基(如-萘曱基)；新戊酰氧基甲基；等等。此外，N-末端氨基酸或R1的任何構成氨基酸的氨基可以用保護基(例如，Cw酰基，如Cw烷酰基，如曱酰基和乙酰基)保護；以及分實施本發明的最佳方式子中氨基酸側鏈上的取代基(例如，-OH、-SH、氨基、咪唑基、吲咮基、胍基等)可以用合適的保護基(例如，d—6酰基，如d—6烷酰基，如甲酰基和乙酰基，等等)保護。W可以是無支鏈或支鏈的(樹狀聚體型)肽。例如，當R/含有在側鏈上具有氨基的氨基酸(如Arg和Lys)時，支鏈可以通過氨基與其它氨基酸或肽的羧基結合而形成。由于樹狀聚體型肽可以在N-末端具有兩個或多個Arg/Lys,所以樹狀聚體型肽可帶有更多正電荷并更有利，例如在肽直接與帶負電荷的核酸或蛋白質結合時。同樣，當W含有在側鏈上具有羧基的氨基酸(如Glu和Asp)時，支鏈可以通過羧基與其它氨基酸或肽的氨基結合而形成。而且，當Ri含有Cys時，支鏈可以通過在Cys和其它Cys或含有Cys的肽之間的二硫鍵形成。在一個優選的實施方案中，R^可以包含帶正電荷的氨基酸(例如，Arg和Lys),因此考慮其可以直接與帶負電荷的核酸或蛋白質結合。在另一個優選的實施方案中，R1可以包含在側鏈中具有硫醇基的氨基酸(例如，Cys),因此考慮其可以通過二硫鍵與硫醇化的核酸或蛋白質結合。二硫鍵在細胞內被還原，感興趣的化合物、核酸或蛋白質可以被容易地釋放出來。此外，載體本身在組織或細胞中的行為和載體與感興趣的化合物(如核酸)結合時的結構變化可以通過用熒光(例如，FITC、若丹明、Cy3等)修飾半胱氨酸等的硫醇基進行觀察。在另一個優選的實施方案中，R1可以包含對金屬具有高度親和性的氨基酸(例如，Met和His),因此考慮其可以與用金屬修飾(例如，螯合作用)的核酸等結合。在另一個優選的實施方案中，R1可以包含在側鏈中具有羥基的氨基酸(例如，Thy、Thr和Ser),因此考慮其可以通過氫4建等與感興趣4b合物、核酸或蛋白質側鏈中的官能團結合。在另一個優選的實施方案中，R1可以包含帶負電荷的氨基酸(例如，Glu和Asp)，因此考慮其可以與用核酸-結合蛋白等(如組蛋白)修飾的核酸結合，所述被修飾的核酸由于結合蛋白而具有凈正電荷。視情況還優選使用除了上述提到的那些氨基酸以外的氨基酸。例如，用于細胞識別的信號肽、神經遞質Y-氨基丁酸(GABA)等可以用于提高載體和靶細胞之間的相互作用。優選地，R^含有至少一種選自Arg、Lys、Cys、Met、His、Tyr、Glu和Asp的氨基酸中的一個或多個殘基。雖然這些氨基酸可以位于R1中的任意位置，只要它們對感興趣的化合物、核酸或蛋白質，或者靶細胞有影響，但是最好是它們中至少一個位于N-末端。因此，W的N-末端氨基酸優選為Arg、Lys、Cys、Met、His、Tyr、Glu或Asp,更優選為Arg或Lys。R2的實例包括以上描述R1的天然存在的氨基酸或者修飾或非天然的氨基酸的側鏈，優選在側鏈上具有羧基的氨基酸，例如Glu和Asp。更優選地，本發明的肽脂質是其中在連接物側鏈上的羧基被具有1-30個碳原子的飽和或不飽和的醇酯化的化合物。也就是說，優選R是-。112(300114或-02114(^00114，其中R4是具有1-30個原子的烴基。在此使用的術語"烴基"包括具有1-30個碳原子的烴基，例如"烷基"、"環烷基"、"鏈烯基"、"環烯基"、"炔基"、"芳基"、"芳烷基"、"環烷基烷基"等。這些烴基可以被一個或多個合適的取代基所取代。這些取代基的實例包括，但不限于CVC6烷基、d-Qj鏈烯基、d-C6炔基、Q芳基、CrCs雜芳基、CVC6環烷基、CrC6烷氧基、CN、OH、氧基、卣素、COOH、NH2、NH(d-C6烷基)、N(d-C6烷基)2、NH(C6芳基)、N(Q;芳基)2、CHO、CO(d-C6烷基)、CO(C6芳基)、COO(CrC6烷基)、COO(C6芳基)等。"烷基"的實例包括，但不限于"無支鏈或支鏈的Cwo烷基"，如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、二十烷基、二十一烷基、二十二烷基、二十三烷基、二十四烷基、二十五烷基、二十六烷基、二十七烷基、二十八烷基、二十九烷基、三十烷基等。"環烷基"的實例包括，但不限于"C3—8環烷基"，如環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環庚基、環辛基等。"鏈烯基"的實例包括，但不限于"無支鏈或支鏈的C2-3Q鏈烯基"，如乙烯基、烯丙基、異丙烯基、l-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、戊烯基、己烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基、癸烯基、十一碳烯基、十二碳烯基、十三碳烯基、十四碳烯基、十五碳烯基、十六碳烯基、十七碳烯基、十八碳烯基、十九碳烯基、二十碳烯基、二十一碳烯基、二十二碳烯基、二十三碳烯基、二十四碳烯基、二十五碳烯基、二十六碳烯基、二十七碳烯基、二十八碳烯基、二十九碳烯基、三十碳烯基等。"環烯基"的實例包括，但不限于"C3—8環烯基"，如環丙烯基、環丁烯基、環戊烯基、環己烯基、環庚烯基、環辛烯基等。"炔基"的實例包括，但不限于"無支鏈或支鏈的C2—30炔基"，如乙炔基、丙炔基、l-丁炔基、2-丁炔基、l-戊炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、己炔基、庚炔基、辛炔基、壬炔基、癸炔基、十一》友炔基、十二》灰炔基、十三碳炔基、十四碳炔基、十五碳炔基、十六碳炔基、十七碳炔基、十八碳炔基、十九碳炔基、二十碳炔基、二十一碳炔基、二十二碳炔基、二十三碳炔基、二十四碳炔基、二十五碳炔基、二十六碳炔基、二十七碳炔基、二十八碳炔基、二十九碳炔基、三十碳炔基等。"芳基"的實例包括,但不限于"Cw4芳基"，如苯基、l-萘基、2-萘基、菲基、蒽基等。"芳烷基"的實例包括，但不限于"C7—3Q芳烷基(即C6_24芳基-d-6烷基)"，如千基、苯乙基、3-苯基丙基、4-苯基丁基、(l-萘基)曱基、2-(1-萘基)乙基、2-(2-萘基)乙基等。"環烷基烷基"的實例包括，但不限于"。3-8環烷基-Cb6烷基"，如環丙基甲基、環丁基曱基、環戊基曱基、環己基曱基、環庚基甲基、環辛基甲基、2-環丙基乙基、2-環丁基乙基、2-環戊基乙基、2-環己基乙基、2-環庚基乙基、2-環辛基乙基等。W和RM尤選是具有10-20個碳原子的無支鏈的飽和烴基(即，正丁基、正戊基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基、正十一烷基、正十二烷基、正十三烷基、正十四烷基、正十五烷基、正十六烷基、正十七烷基、正十八烷基、正十九烷基、正二十烷基、正二十一烷基、正二十二烷基、正二十三烷基、正二十四烷基、正二十五烷基、正二十六烷基、正二十七烷基、正二十八烷基、正二十九烷基和正三十烷基)或無支鏈的不飽和烴基(例如，單不飽和烴基如反-2-丁烯-l-基、順-9-十四碳烯_1_基、順_9-十六碳烯-1-基、順-9-十八碳烯-l-基、順-ll-十八碳烯-l-基、順-9-二十碳烯-l-基、順-13-二十二碳烯-l-基和順-15-二十四碳烯-l-基，二不飽和的烴基如順-9-順-12-十八碳二烯-l-基，三不飽和烴基如順畫9畫順誦12-順-15畫十八碳三烯-1-基和順畫9畫順誦11畫順-13-十八碳三烯-1-基，四不飽和烴基如順-4-順-8-順-12-順-15-十八碳四烯-1-基和順-5-順-8-順-ll-順-14-二十碳四烯-l-基，五不飽和烴基如順-7-順-10-順-13-順-16-順-19-二十二碳五烯-l-基，六不飽和烴基如順-4-順-7-順-10-順-13-順-16-順-19-二十二碳六烯-l-基等)。更優選地，R和R4是具有12-16個碳原子的無支鏈的烷基(即，正十二烷基、正十三烷基、正十四烷基、正十五烷基和正十六烷基)或具有10-20個碳原子的無支鏈的不飽和烴基(例如,順-9-十四碳烯-l-基、順-9-十六碳烯-l-基、順-9-十八碳烯-l-基、順_9-十八碳烯-1-基、順-ll-十八碳烯-l-基、順-9-二十碳烯-l-基、順-13-二十二碳烯-l一基、順-9-順-12調十八碳二烯-l陽基、順-9陽順-12-順-15國十八碳三烯-l-基、順-9-順-ll-順-13-十八碳三烯-l-基、順隱4-順-8-順-12-順-15-十八碳四烯-l-基、順_5-順-8-順-11-順-14-二十碳四烯-1-基、順-7-順-10-順-13-順-16-順-19-二十二碳五烯-l-基、順-4-順-7-順-10-順-13-順-16-順-19-二十二碳六烯-1-基等)。113和114可以是相同的基團。作為由下式(I)所代表的化合物的具體實例，舉例說明下列化合物等，但不限制于此<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>由式(I)所代表的化合物可通過已知的肽合成方法和酯化反應方法結合來生產。例如，使連接物的氨基酸(NH2-CH(R勺-COOH)的a-羧基與所需的醇(R3-OH)縮合以制備氨基酸酯，然后可將肽鏈在氨基酸酯的氨基方向上延長以合成Ri肽，或氨基酸酯可與預先合成的W肽縮合。肽合成的方法可以是例如任何固相合成和液相合成方法。R1肽可以通過使構成R1的部分肽或氨基酸和剩余部分縮合而生成，以及當產物具有保護基時，除去保護基。在此，保護基的縮合和去除可以通過本身已知的方法來完成，例如以下(i)和(ii)中描述的方法。(i)M.Bodanszky和M.A.Ondetti:PeptideSynthesis,IntersciencePublishers,NewYork(1966)(ii)Schroeder和Luebke:ThePeptide,AcademicPress,NewYork(1965)具體地，例如所述化合物可以才艮據Kanegae和Akao7>開的方法("DesignandSynthesisoftheArtificialPeptide-LipidsHavingAdamantaneGroup",T7zei^ewc/z/^wo&a/wt/wW"'"/rec/mo/ogyCe"&rw/99S,第113-116頁)來合成。本發明的載體含有一種上述提到的肽脂質分子。所述載體也可包含兩種或多種組合在一起的上述提到的肽脂質分子。此外，所述載體還可以包含除了上述提到的肽脂質分子以外的分子，例如兩親分子(例如，由生物膜衍生而來的磷脂如磷脂酰肌醇、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿等)、陽離子脂質分子、表面活性劑(例如，CHAPS、膽酸鈉、辛基糖苷、N-D-葡萄糖-N-曱基烷酰胺等)、聚乙二醇、糖脂、肽脂質、蛋白質等，只要不失去本發明的優點，如將感興趣化合物引入細胞的高引入效率和低的細胞毒性。將本發明的載體提供為其中上述提到的肽脂質分子被組織化的組件，或其中上述提到的肽脂質分子被完全分散在分散介質中的形式(即溶液或懸浮液)。"組織化"是指構成載體的分子(包括肽脂質)相互通過非共價鍵(如疏水鍵)結合。組織化組件的實例包括由載體-構成分子的疏水性部分、脂質體、多層嚢、帶狀組件、扁圓形組件、片狀組件、桿狀組件及其混合物之間的疏水鍵合所形成的雙層膜。完全分散所述載體-構成分子的分散介質的實例包括有機溶劑，如乙醇、曱醇和DMSO。本發明的載體可以被制備成分子的組件，通過將上述肽脂質分子分散在合適的分散介質中，例如含水溶劑，并且如果需要，進行誘發組織化的操作來進行。所述"誘發組織化的操作"的實例包括，但不限于各種本身已知的方法，如超聲處理、加熱、渦流、注入醚、弗氏壓碎法、膽酸法、Ca^融合、凍融法和反相蒸發[這些方法的詳細描述在例如"Liposomes，，的第2章PreparationofLiposomes(由Sunamoto禾口Iwamoto編寫)，Nojima,Sunamoto,andInoue,eds.(Nankodo,1988年出版)以及其它地方]。在特定條件下，也可以讓包括肽脂質的載體-構成分子自發地集合在含水溶劑中以形成組件(自組織)，而不進行上面描述的人工誘發組織的操作。雖然通過自組織得到的組件通常是上面描述的各種形式的混合物，但是也可以通過在特定條件下進行上述誘發組織化的操作來形成單一形式的組件。述的肽脂質分子溶解在含有有機溶劑(如乙醇、甲醇或DMSO)的溶液中進行制備。上面描述的肽脂質分子的品種可以根據所引入的化合物(在此也稱為"感興趣的化合物")來視情況進行選擇；當引入質粒DNA時可選擇的化合物的實例包括，但不限于上面描述的RE-C12、RGE-C12、RE-C14、RE-C16、KE-C14、KE-油酰基等，而當引入siRNA時可選擇的化合物的實例包括，但不限于RE-C12、RGE-C12、RGGE-C12、RE-C14、RGD-C12等。上述用于制備本發明載體的肽脂質分子的混合比例不受限制，基于所有載體-構成分子的摩爾比，所述混合比例是例如大約0.01-10,優選大約0.1-1。在實施方案的優選方式中，用于制備本發明載體的上述肽脂質分子是固體、凝膠、液體等，但是不應理解為限制本發明。用于分散肽脂質分子的分散介質的實例包括，但不限于含水溶劑如水(去離子水等)、鹽水、磷酸緩沖鹽水(PBS),或本領域技術人員對于普通細胞培養所使用的介質(例如，RPMI1640、DMEM、HAMF-12、Eagle's介質等)、有機溶劑如乙醇、曱醇或DMSO,含水溶劑和有才幾溶劑的混合溶劑，等等。雖然含水溶劑優選不含諸如血清的蛋白質組分，但是也可能通過預先進行聚賴氨酸處理等處理除去蛋白質組分來防止載體-構成分子包括肽脂質分子組織化的抑制，或隨后的在被引入細胞的化合物和肽脂質分子組件之間的復合物形成。當被引入細胞的化合物是核酸(如RNA或DNA)或肽基化合物(如寡肽或蛋白質)時，核酸分解酶(如核糖核酸酶或脫氧核糖核酸酶)或蛋白質(肽)分解酶(如肽酶或蛋白酶)的混合會降低感興趣化合物的穩定性；因此，優選對含水溶劑進行熱處理以在肽脂質分子分散前滅活這些酶。熱處理的實例包括，但不限于在大約50至大約IO(TC處理大約5分鐘至大約3小時。因此，含水溶劑優選允許進行熱處理的溶劑。通常用于將核酸引入細胞的各種培養肉湯往往不允許除去酶(如核糖核酸酶)；但是，即使分散在含有化合物(如NaCl或氯化鉀)的水溶液時，本發明的肽脂質分子在后來的細胞內引入操作中也表現出高的引入效率。因此，在將例如核酸或肽基化合物的化合物I入細胞時，所述含水溶劑優選是含有上述化合物等的水溶液。雖然含水溶劑的pH值不受限制，但是優選在pH值4至10的范圍內，更優選在pH值6至8的范圍內。在實施方案的優選方式中，含有肽脂質的脂質體是通過如下面詳細描述的(1)超聲處理或(2)熱處理制備的。(1)超聲處理方法首先，將上面描述的肽脂質分子溶于有機溶劑(例如，氯仿等)，將得到的溶液放在例如茄形瓶的容器中；使用旋轉蒸發器等在減壓條件下蒸發掉溶劑，從而在容器壁的表面上形成脂質薄膜。將含水溶劑(例如，磷酸鹽緩沖液(pH值7.0)等)加入到所述膜，隨后搖動以使膜膨脹，然后使用例如渦旋攪拌器等進行分離，得到多層脂質體的懸浮液。為了除去分解的脂質等，可使用葡聚糖凝膠2B、4B或G-50柱等進行凝膠過濾。通過在水浴或水浴中使用超聲發生器(探針型、浴盆式等)在高輸出(例如，大約100至大約200W)下超聲處理得到的多層脂質體懸浮液大約1至大約2分鐘(例如，1分鐘超聲處理周期和30秒鐘間隔重復大約二至四次等)，可以制備幾乎均勻的單層脂質體。在本發明的肽脂質分子中，含有肽脂質的脂質體可以容易地僅僅通過以下方法來制備將適當量的肽脂質粉末轉移到試管，加入MiliQ水等(以達到大約20mM的最終濃度)，然后進行與上面描述相同的超聲處理。(2)熱處理方法含有肽脂質的脂質體可以容易地通過以下方法來制備將適當量的上述肽脂質分子的粉末轉移到試管，加入MiliQ水等(以達到大約20mM的最終濃度)，然后將混合物在大約90。C加熱大約15分鐘。可以考慮所用肽脂質分子的種類等來視情況對含有肽脂質的脂質體中肽脂質分子濃度進行調整，肽脂質分子的濃度通常在1-200mM范圍內，優選1-100mM，并且更優選l-50mM。如果濃度太低，則形成不足量的含有肽脂質的脂質體；如果濃度太高，則肽脂質分子會沉淀。本發明的載體可含有適當的添加劑，只要添加劑的加入不影響本發明的任何優點，如化合物引入細胞的高效率和低的細胞毒性。當本發明的載體用于將化合物引入活體細胞的目的時，添加劑必須是藥學上可接受的添加劑。例如，可以使用在常規已知的脂質體制劑中配制所用的各種藥用添加劑。本發明的載體(可以按如上描述得到)用作在低毒性下將化合物有效地引入細胞的藥物。使用本發明的載體可將任何化合物引入細胞，例如可以提到核酸、肽、脂質、肽脂質、糖、生物活性物質、藥物(阿霉素(抗胂瘤藥物)、柔紅霉素(抗胂瘤藥物)、長春新堿(抗腫瘤藥物)、長春堿(抗肺瘤藥物)、依達比星(抗肺瘤藥物)、二丁卡因(局部麻醉劑)、普萘洛爾(P-阻斷劑)、奎尼丁(抗心律失常治療劑)、多巴胺(高血壓強心劑)、丙咪。秦(抗抑郁藥)、苯海拉明(抗組胺劑)、奎寧(抗癡藥)、氯喹(抗瘧藥)、雙氯芬酸(抗炎藥)等)、用于化妝品等的保濕劑(甘露糖醇等)、其它合成或天然的化合物等。能夠使用本發明的載體而被引入細胞中的特別優選的化合物是核酸。可以使用任何核酸，無論是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合的核酸、DNA/RNA雜合體，還是其它。雖然核酸可以是單鏈至三鏈的，但是優選單鏈或雙鏈的。核酸可以是另外類型的核普酸，即噤呤或嘧啶堿的N-糖苷，或具有非核苷酸骨架的其它低聚物(例如，市場上可以買到的肽核酸(PNA)等)或含有特殊鍵的其它低聚物(但是，所述低聚物含有具有讓石咸基配對或石咸基連接以在DNA和RNA中發現的方式排列的核苷酸)等等。此外，核酸還可以是在其中加入了已知的4務飾的核酸，例如具有本領域已知標記的核酸、具有帽的核酸、曱基化的核酸、具有一個或多個被類似物取代的天然存在核苷酸的核酸、用分子內核苷酸修飾的核酸，例如，具有非電荷一睫的核酸(例如，曱基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)、具有電荷鍵或含硫鍵的核酸(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)，例如具有蛋白質側鏈基團的核酸(核酸酶、核酸酶抑制劑、毒素、抗體、信號肽、聚-L-賴氨酸等)、糖(例如，單糖等)等等，具有插入化合物的核酸(例如，吖啶、補骨脂素等)、含有螯合物的核酸(例如，金屬、放射性金屬、硼、氧化金屬等)、含有烷基化劑的核酸，或具有修飾鍵的核酸(例如，端基異構型核酸等)。例如，根據使用目的可視情況選擇任何種類的DNA,其實例包括質粒DNA、cDNA、反義DNA、染色體DNA、PAC、BAC等，優選質粒DNA、cDNA和反義DNA,更優選質粒DNA。環狀DNA(如質粒DNA)在用限制性內切核酸酶等適當消化后還可以用作線狀DNA。此外，根據使用目的可一見情況選擇任何種類的RNA，其實例包括siRNA、miRNA、shRNA、反義RNA、信使RNA、單鏈RNA基因組、雙鏈RNA基因組、RNA復制子、轉運RNA、核糖體RNA等，優選siRNA、miRNA、shRNA、mRNA、反義RNA和RNA復制子。核酸的大小不受限制；雖然可以引入非常寬范圍的核酸，從巨型核酸分子(例如，大小在大約107kbp)如染色體(人工染色體等)到低分子量的核酸(例如，大小在大約5bp),但是考慮到將核酸引入細胞的效率，優選大小不超過15kbp。例如，舉例說明高分子的核酸如質粒DNA的大小在2-15kbp,優選2-10kbp。舉例說明低分子量的核酸如siRNA的大小在5-1000bp,優選5-500bp，并且更優選5-200bp。核酸可以是天然存在的或合成的核酸；條件是大小不超過大約100bp,核酸可以使用通常使用的自動核酸合成儀通過磷酸三乙基方法、磷酸二酯方法等方法進行合成。雖然用于本發明的核酸不受限制，但是優選用本領域技術人員通常所用的方法進行純化。本發明的載體用于將預防和/或治療的(以下簡寫為預防/治療的)括通常所說的基因治療的化合物，在體內給予，意在預防和/或治療疾病。因此，在本發明實施方案的優選方式中，使用本發明的載體引入細胞的化合物具有對特定疾病的預防/治療活性。此類化合物的實例包括核酸、肽、脂質、糖類、生物活性物質、藥物以及其它天然或合成的化合物。如上所述，基因療法可以粗略地分為意在補充缺失的遺傳信息的基因療法和意在控制病因基因(靶基因)表達的基因療法。例如，當能夠控制輩巴基因表達的化合物是低分子的核酸時，低分子核酸的例子為siRNA、miRNA、反義寡核苷酸、核糖酶、誘殺低聚核苷酸(例如，包含可通過轉錄因子或轉錄抑制因子識別和結合的堿基序列的低聚核苷酸)等等。當能夠控制靶基因表達的化合物是肽或蛋白質時，肽/蛋白質的例子為與耙基因結合以控制所述基因轉錄的肽/蛋白質、與mRNA或靶基因的初始轉錄產物結合以控制其翻譯成蛋白質的肽/蛋白質、或能夠增強控制靶基因表達的受體的信號的肽基配體、或能夠阻斷信號的類似肽/蛋白質的拮抗劑，等等。或者，對疾病具有預防/治療活性的化合物可以是能夠控制病因蛋白活性的化合物。此類化合物的實例包括，但不限于作為靶受體蛋白配體的肽/蛋白質、非肽基化合物(例如，脂肪酸、甾體激素等)、具有激動或拮抗活性的各種天然或合成的化合物、模擬激酶磷酸化位置的部分氨基酸序列的肽等。本發明還提供本發明載體和被引入細胞的化合物的復合物，所述化合物優選為如上描述的化合物。當上面描述的載體用于將化合物引入細胞時，所述載體和感興趣的化合物相互接觸以形成載體和感興趣化合物的復合物(以下也簡稱為"復合物")。復合物可以通過任何相互作用來形成，只要復合物能穩定地存在，以及只要感興趣化合物(核酸、肽等)通過例如核酸酶、肽酶等的分解被抑制。例如，當感興趣的化合物是帶負電荷的化合物如核酸或肽時，可使用含有帶正電荷的肽脂質的載體，通過基于靜電相互作用的非共價鍵形成復合物。當感興趣的化合物是帶正電荷或不帶電荷的化合物時，可使用含有帶負電荷的肽脂質的載體，通過基于靜電相互作用的非共價鍵形成復合物。或者，具有載體的復合物還可以通過插入中間的其它相互作用或者通過預先將感興趣的化合物與帶負電荷的化合物結合來形成。其它相互作用的實例包括，但不限于上述關于R1的構成氨基酸的實施方案優選方式的相互作用。關于復合物的形成，當載體是脂質體時，例如化合物可以以結合脂質體的形式或并入脂質體的形式，優選以并入脂質體的形式形成所述復合物。上述載體和感興趣的化合物復合物是通過混合含有載體的含水溶劑和感興趣的化合物，然后培養所述混合物而得到的。含水溶劑的種類與上面描述的相同。培養期間的溫度優選被設置在與上述制備含有肽脂質的脂質體的方法相同的溫度范圍。可以考慮所用肽脂質分子的種類等視情況對上述載體在混合物中的濃度進4亍調整，載體的濃度通常在1-200mM，優選l-100mM，更優選1-50mM，更加優選5-50mM,以及最優選10-30mM范圍內。如果濃度太低，則形成不足量的穩定的復合物；如果濃度太高，則載體會沉淀。可以考慮所用化合物的種類和大小(分子量)等視情況對感興趣的化合物在混合物中的濃度進行調整；當化合物是核酸時，它的濃度通常在大約0.01至大約100ng/iuL的范圍內。當化合物是DNA時，它的濃度通常在3-100ng/|uL的范圍內。例如，當DNA是普通的質粒DNA(大小為大約3kbp)時，混合物中DNA的濃度優選在10-卯ng/|uL的范圍內，更優選20-80ng/|uL,更加優選30-70ng/juL,以及最優選40-60ng/|uL。如果濃度太低，則被引入細胞的DNA不能表現出預期的功能；如果濃度太高，則核酸的引入效率反而會下降。即使所述化合物是DNA，也可以考慮到RNA的大小等來視情況對它的濃度進行調整；當RNA的大小為大約幾千個堿基對時，在上述混合物中的RNA的濃度通常在3-100ng/|uL,優選10-90ng/|uL,更優選20-80ng/|uL,更加通常30-70ng/|uL，以及最優選40-60ng/|uL的范圍內。特別地，當核酸為大約20至大約200bp大小像siRNA時，核酸的濃度通常在1-500nM,優選20-400nM,更優選20-300nM,更加優選20-200nM,以及最優選20-100nM的范圍內。如果濃度太低，則被引入細胞的RNA不能表現出預期的功能；如果濃度太高，則核酸的引入效率反而會下降。可以考慮到所用試劑的種類以及其它條件來視情況對在含有載體和感興趣化合物的含水溶劑混合之后的培養時間進行調整，培養時間通常在0.5-500分鐘的范圍內，優選0.5-200分鐘，更優選0.5-120分鐘，更加優選0.5-60分鐘，以及最優選1-45分鐘。如果培養時間太短，則在感興趣的化合物和載體之間形成的復合物不足；如果培養時間太長，則形成的復合物有時變得不穩定；在這兩種情況中，感興趣化合物的引入效率都會下降。通過上面描述的步驟，可以得到含有用于將感興趣的化合物引入細胞的載體和化合物的混合物(以下也描述為"含有復合物的溶液")。此外，通過將上述步驟得到的復合物和細胞相互接觸，將包含在復合物中的感興趣的化合物可以引入細胞。雖然上面描述的"細胞"種類不受限制，無論它們衍生于原核生物或真核生物，但是優選衍生于真核生物。真核生物的種類也不受限制，例子有脊推動物如哺乳動物，包括人類(人、猴、小鼠、大鼠、倉鼠、牛等)、禽類(小雞、鴕鳥等)、兩棲動物(蛙等)和魚類(斑馬魚(zebrafish)、克鯉魚等)，無脊推動物如昆蟲(蠶、蛾、果蠅等)，植物，微生物如酵母，等等。更優選，本發明的細胞是動物或植物細胞，更優選哺乳動物細月包。所述細胞可以是培養的細胞系的細胞，包括癌細胞，從個體或組織分離的細J包，或組織或組織部分的細月包。所述細月包還可以是粘附細月包或非粘附細胞。用于將復合物和細胞相互接觸的步驟會在下面被更詳細地描述。將細胞在與復合物接觸之前先在合適的介質中懸浮幾天，并在適宜的條件下培養。在與復合物接觸時，細胞可以處于或不處于對數生長期。雖然在接觸時使用的培養肉湯可以是含血清的介質或無血清的介質，但優選的是介質中的血清濃度不超過30%,優選不超過20%。這是因為蛋白質如血清在介質中過量存在會阻礙復合物和細胞的接觸。接觸時的細胞密度不受限制，并且可以考慮到細胞的種類等來視情況對其進行調整，通常在0.1xl05至5xl05細月包/毫升的范圍內，優選0.1xl()S至4xl()S細胞/毫升，更優選0.1xl()S至3xl()S細l包/毫升，更加優選0.2x105至3xl05細月包/毫升,以及最優選0.2x105至2xl05細胞/毫升。將上述含有復合物的溶液加入到由此制備的含有細胞的介質中。所加入的含有復合物的溶液的量不受限制，并且可以考慮到細胞計數等來視情況對其進行調整，通常在每毫升介質添加1-1000]LiL的范圍內，優選1-500|uL,更優選1-300iuL。更加優選1-200^lL，以及最優選1-100^L。在將含有復合物的溶液加入介質中之后，培養細胞。在考慮到細i包的種類的情況下視情況調整培養期間的溫度、濕度、C02濃度等。就哺乳動物細胞而言，正常條件為大約37。C的溫度、大約95%的濕度和大約5%的C02濃度。也可以考慮到所用細胞的種類以及其它條件來視情況對培養時間進^f亍調整，其通常在1-72小時的范圍內，優選l-60小時，更優選1-48小時，更加優選l-40小時，以及最優選l-32小時。如果上述培養時間太短，則感興趣化合物向細胞內的引入量不足；如果培養時間太長，則細胞會變得更加無力。通過上述培養方法將所述化合物引入細胞；優選地，用新鮮介質替換原有介質進行連續培養，或將新鮮介質加入到介質中進行培養。當所述細胞具有哺乳動物起源時，新鮮介質優選含有血清或營養要素。可以考慮到被引入化合物的預期功能等來視情況對用于進一步培養的時間進行調整；當所述化合物是質粒DNA如表達載體時，時間通常在8-72小時范圍內，優選8-60小時，更優選8-40小時，更加優選8-36小時，以及最優選12-32小時。當所述化合物是能夠控制靶基因表達的4氐分子的核酸如siRNA時，時間通常在0-72小時范圍內，優選0-60小時，更優選0-48小時，更加優選0-36小時，以及最優選0-32小時。如上所述，通過使用本發明載體和化合物的復合物，不僅可將化合物在體外引入細胞，而且可在體內引入細胞。因此，通過向接受者給予所述復合物，復合物到達并接觸靶細胞，從而導致在體內將包含在復合物中的化合物引入細胞。可以被給予復合物的接受者不受限制，例子有脊推動物如哺乳動物，包括人類(人、猴、小鼠、大鼠、倉鼠、牛等)、禽類(小雞、鴕鳥等)、兩棲動物(蛙等)和魚類(斑馬魚、克鯉魚等)，無脊推動物如昆蟲(蠶、蛾、果蠅等)，植物等。優選地，復合物的接受者是人或其它哺乳動物。給予所述復合物的方法不受限制，只要復合物到達并接觸靶細胞以便將包含在復合物中的感興趣的化合物引入細胞；考慮到感興趣化合物的種類、靶細胞的種類和位置等可視情況選擇本身已知的給予方法(口服給予、腸胃外給予(靜脈內給予、肌內給予、局部給予、經皮給予、皮下給予、腹膜內給予、噴霧等)等等)。所述復合物的劑量不受限制，只要化合物向細胞內的引入可以實現，以及考慮到接受者的種類、給予方法、感興趣化合物的種類、靶細胞的種類和位置等可以視情況選擇復合物的劑量。就口服給予而言，基于所述復合物，對于人(稱重60kg)的每次給予的通常劑量是例如大約0.001mg至10000mg。就腸胃外給予(例如，靜脈內給予等)而言，基于所述復合物，對于人(稱重60kg)的每次給予的通常劑量是例如大約0.0001mg至3000mg。就其它動物而言，可以給予每60kg體重折算的劑量。因為通過利用本發明的載體使以4艮高的效率將化合物引入細胞成為可能，所以本發明提供含有用于在體外或體內向細胞引入化合物的載體的試劑。所述試劑可以被提供為研究試劑、藥用試劑等。通過使用上述方法中的試劑，可容易地將所需的化合物引入細胞。當本發明的載體被用作用于向細胞引入化合物的試劑時，可作為制劑通過常規方法進行制備。當所述試劑提供為研究試劑時，本發明的載體可以被提供為例如無菌溶液或在水或其它生理上可接受的液體(例如，上述水溶性溶劑、有機溶劑如乙醇、甲醇和DMSO、水溶性溶劑和有機溶劑的混合物，等等)中的懸浮液。所述試劑可以一見情況含有本身已知的生理上可接受的添加劑，如填充劑、賦形劑、抗菌劑、穩定劑和粘合劑。當所述試劑被提供為藥用試劑時，本發明的載體可以以口腔制劑的方式(例如，片劑、膠嚢等)或非腸道制劑(例如，可注射的制劑、噴霧等)，或以通用的制劑設計所需的單位劑量形式通過與已知的藥學上可接受的添加劑(如載體、調味劑、填充劑、賦形劑、抗菌劑、穩定劑和粘合劑)混合來制造。可在片劑、膠嚢等中混合的添加劑的實例包括粘合劑如明膠、玉米淀粉、西黃蓍膠和阿拉伯膠，填充劑如結晶纖維素，膨脹劑如玉米淀粉、明膠、海藻酸等，潤滑劑如硬脂酸鎂，甜味劑如蔗糖、乳糖或糖精，調味劑如薄荷、akamono油或櫻桃等可以使用。當制劑單位形式是膠嚢時，上述類型的材料可以進一步地含有液體載體如油或脂肪。用于可注射制劑的含水溶液的例子有鹽水、含有葡萄糖和其它助劑(例如，D-山梨糖醇、D-甘露糖醇、氯化鈉等)的等滲溶液等，并且可用于與合適的增溶劑組合，合適的增溶劑例如為醇(例如，乙醇)、多元醇(例如，丙二醇、聚乙二醇)、非離子表面活性劑(例如，多乙氧基醚TM、HCO-50)等。油性液體的例子有芝麻油、豆油等，并且可用于與增溶劑(如苯甲酸千基酯或節醇)組合。上述試劑還可以與例如緩沖劑(例如，磷酸鹽緩沖液、乙酸鈉緩沖溶液)、撫慰劑(例如，苯扎氯銨、鹽酸普魯卡因等)、穩定劑(例如，人血清白蛋白、聚乙二醇等)、防腐劑(例如，千醇、苯酚等)、抗氧化劑(例如，抗壞血酸等)等等進行配制。包含在這些試劑中的本發明載體的用量不受限制，只要在所述載體用于上述方法時，可以實現向細胞引入化合物；用量可以根據劑型的種類、被引入化合物的種類等視情況進行選擇。或者，包含在本發明試劑中的載體可以是具有期望被引入細胞的化合物的復合物。本發明的載體還可以提供為用于向細胞引入化合物的試劑盒。所述試劑盒可以進一步地包含可用于利用本發明的載體向細胞引入化合物的方法的任何試劑等(例如，上述含水溶劑、帶有制劑方案的說明書、反應容器等)。通過使用所述試劑盒，根據上面描述的方法，可容易地將所需的化合物引入細胞。實施例下面通過實施例來詳細地解釋本發明，^旦不應理解為以任何方式限制本發明。實施例1:肽脂質的合成和制備(1)肽脂質的合成(RE-C12合成法)將氨基酸(L-谷氨酸；E)、脂肪醇(十二烷醇；C12-OH)和對曱苯磺酸混合在曱苯溶劑中，在回流條件下在裝有Dean-Stark分水器的反應容器中加熱混合物。通過脫水縮合形成酯鍵。通過冷卻(4°C)沉淀E-C12的對曱苯磺酸酯的晶體，通過過濾收集并用冷的曱苯洗滌，得到白色晶體。然后，將用Boc(Boc-Arg(Boc)2-OH)保護的氨基酸與E-C12在二曱基甲酰胺溶劑中在HOBt、WSC和TEA共存的條件下縮合。通過硅膠柱色語純化合成的物質(Boc-Arg(Boc)2-Glu-C12),并用三氟乙酸除去Boc保護以得到Arg-Glu-C12(RE-C12)。NMR用于鑒定。通過類似的方法合成其它肽脂質。(2)肽脂質水溶液的制備溶解各種肽脂質以得到各種1.3mM的肽脂質水溶液(1.0ml)并用超聲處理分散。實施例2:使用具有各種頭部長度的肽脂質向培養細胞引入質粒DNA將培養細胞(CHO細胞、HC細胞)(lx105細胞/孔)在24孔板中預培養24小時(CHO細胞；10%含有FBS的DMEM介質，HC細胞；10%含有FBS的DMEM/F-12介質)，然后在引入時將介質與0.5ml新鮮的10%含有FBS的介質進行交換。將質粒DNA(pCMV-IE-hsGFP;購買于NIPPONGENECO.,LTD.,1iug/孑L)與25|ul150mMNaCl溶液混合。使各種1.3mM肽脂質(RE-C12、RGE-C12、RGGE國C12、RGGGE畫C12、RE-C14、RGE-C14、RGGE-C14、RGGGE-C14,各5pi)與上述質粒DNA溶液混合并將混合物培養5分鐘以得到肽脂質-DNA復合物。將復合物加入上述細胞并將混合物在5%C02保溫箱中在37。C培養24小時。第二天，用熒光顯微鏡觀察細胞并通過流動血細胞計數器測定熒光細胞。結果顯示在圖1中。發現使用肽脂質作為載體導致GFP在細胞中非常頻繁的表達并且質粒DNA被高效率地引入細胞。實施例3:使用各種濃度的肽脂質向培養細胞引入siRNA所產生的細胞毒性將培養細胞(CHO-EGFP細胞；以組成方式表達熒光蛋白EGFP的CHO細胞，它們通過常規方法制備)(lxlO5細胞/孔)在24孔板中預培養24小時(10%含有FBS的DMEM介質)，然后在引入時將介質與0.5ml新鮮的10%含有FBS的介質進4t交4灸。抗隱EGFP-siRNA(購買于NIPPONGENECO.,LTD.,50pmol/孔)分別與25pi150mMNaCl溶液(對于肽脂質)和DMEM介質(125jal)(對于脂質轉染胺2000)混合。將各種1.3mM肽脂質(RE-C12、RGE-C12，各2-6|Lil)和脂質轉染胺2000(購買于Invitrogen;LipoA2000)(1-5jul)與上述siRNA溶液混合并將混合物培養5分鐘以得到RE-C12—RNA復合物、RGE-C12—RNA復合物和脂質轉染胺2000—RNA復合物。將復合物加入到上述提到的細胞中并將混合物在5。/。C02保溫箱中在37。C培養24小時。第二天，用顯微鏡觀察細胞并通過臺盼藍染色來確定細胞死亡。結果顯示在圖2中。當肽脂質用作載體時，根本沒有觀察到細胞毒性，沒有發現在細胞存活力方面與未引入的細胞有顯著性差異，因此認為肽脂質具有低的細胞毒性。而且，當肽脂質被用作載體時，EGFP表達被siRNA明顯地抑制，它的能力等于或高于脂質轉染胺2000,并且發現siRNA被非常有效地引入了細胞。實施例4:使用具有各種頭部長度的肽脂質向培養細胞引入siRNA將培養細胞(CHO-EGFP細胞；表達組成熒光蛋白EGFP的CH〇細胞，它們通過常頭見方法制備)(lxlO5纟田月包/孑L)在24孔一反中預培養24小時(10%含有FBS的DMEM介質)，然后在引入時將介質與0.5ml新鮮的10%含有FBS的介質進行交換。抗-EGFP-siRNA(購買于NIPPONGENECO.,LTD.,50pmol/孔)與25|ul150mMNaCl溶液混合。將各種1.3mM肽脂質(RE-C12、RGE國C12、RGGE-C12、RGGGE-C12、RE-C14、RGE-C14、RGGE國CM、RGGGE-C14,各5|al)與上述siRNA溶液混合并將混合物培養5分鐘以得到肽脂質-RNA復合物。將復合物加入到上述提到的細胞中并將混合物在5%C02保溫箱中在37。C培養24小時。第二天，用熒光顯^f敖鏡觀察細胞并通過流動血細胞計數器測定熒光細胞。結果顯示在圖3中。當肽脂質被用作載體時，EGFP表達被siRNA明顯地抑制，并且發現siRNA被非常有效地引入細胞中。實施例5:使用具有堿性氨基酸頭部的肽脂質向培養細胞引入質粒DNA將培養細胞(CHO細胞)(lxlO5細胞/孔)在24孔板中預培養24小時(10%含有FBS的DMEM介質)，然后在引入時將介質與0.5ml新鮮的10%含有FBS的介質進行交才灸。將質粒DNA(pCMV-正-hsGFP,購買于NIPPONGENECO.,LTD.,1)ag/孑L)與25|ul150mMNaCl溶液混合。將各種1.3mM肽脂質(RE-C14、KE-C14,各5pi)與上述質粒DNA溶液混合并將混合物培養5分鐘以得到肽脂質-DNA復合物。將復合物加入上述細胞并將混合物在5%C02保溫箱中在37。C培養24小時。第二天，用熒光顯微鏡觀察細胞并通過流動血細胞計數器測定熒光細胞。結果顯示在圖4中。當使用將Arg或Lys設計為頭部的肽脂質時，GFP非常頻繁地在細胞中對兩種脂質進行表達，并且發現質粒DNA被非常有效地引入細胞中。實施例6:4吏用具有各種連接物的肽脂質向培養細胞引入siRNA將培養細胞(CHO-EGFP細胞；表達組成熒光蛋白EGFP的CHO細胞，它們通過常規方法制備)(lxlO5細胞/孔)在24孔板中預培養24小時(10%含有FBS的DMEM介質)，然后在引入時將介質與0.5ml新鮮的10%含有FBS的介質進行交換。將抗-EGFP陽siRNA(購買于NIPPONGENECO.,LTD.,50pmol/孔)與25pi150mMNaCl溶液混合。將各種1.3mM肽脂質(RGE-C12、RGD-C12，各5iul)和脂質轉染胺2000(購買于Invitrogen;LipoA2000)(5pi)與上述siRNA溶液混合并將混合物培養5分鐘以得到RGE-C12—RNA復合物、RGD-C12—RNA復合物和脂質轉染胺2000—RNA復合物。將復合物加入到上述提到的細胞中并將混合物在5%。02保溫箱中在37。C培養24小時。第二天，用熒光顯微鏡觀察細胞并通過流動血細胞計數器測定熒光細胞。結果顯示在圖5中。當^f吏用設計為Glu或Asp作為連接物的肽脂質時，EGFP表達被siRNA朋顯地抑制，siRNA非常有效地在細胞中表達，它們的能力高于脂質轉染胺2000的能力，并且發現它們在細胞毒性方面有優勢。實施例7:使用具有各種尾部長度的肽脂質向培養細胞引入質粒DNA將培養細胞(CHO細胞，HC細胞)(lx105細胞/孔)在24孔板中預培養24小時(CHO細胞；10%含有FBS的DMEM介質，HC細胞；10%含有FBS的DMEM/F-12介質)，然后在引入時將介質與0.5ml新鮮的10%含有FBS的介質進行交換。將質粒DNA(pCMV-IE-hsGFP,購買于NIPPONGENECO.,LTD.,1iug/孔)分別與25pi150mMNaCl溶液(對于肽脂質)和DMEM介質(125)ul)(對于脂質轉染胺2000)混合。將各種1.3mM肽脂質(RE-CIO、RE-C12、RE-C14、RE-C16,各5pi)和脂質轉染胺2000(購買于Invitrogen;LipoA2000)(2.5|ul,才艮據方案)與上述DNA溶液混合并將混合物培養5分鐘以得到RE-C10—DNA復合物、RE-C12—DNA復合物、RE-C14—DNA復合物、RE-C16—DNA復合物和脂質轉染胺2000—DNA復合物。將復合物加入到上述提到的細胞中并將混合物在5%C02保溫箱中在37。C培養24小時。第二天，用熒光顯微鏡觀察細胞并通過流動血細胞計數器測定熒光細胞。結果顯示在圖6中。當使用設計為具有C10至C16尾部長度的肽脂質時，GFP在細胞中表達，并且發現質粒DNA被非常有效地引入細胞中。實施例8:使用尾部具有不飽和烴基的肽脂質向培養細胞引入質粒DNA將培養細胞(CHO細胞)(lx105細胞/孔)在24孔板中預培養24小時(10%含有FBS的DMEM介質)，然后在引入時將介質與0.5ml新鮮的10%含有FBS的介質進行交換。將質粒DNA(pCMV-IE醒hsGFP,購買于NIPPONGENECO.,LTD.,1ing/孑L)與25|ul150mMNaCl溶液混合。將各種1.3mM肽脂質(KE-C14、KE-油酰基，各5pi)與上述質粒DNA溶液混合并將混合物培養5分鐘以得到肽脂質-DNA復合物。將復合物加入到上述提到的細胞中并將混合物在5%C02保溫箱中在37。C培養24小時。第二天，用熒光顯微鏡觀察細胞并通過流動血細胞計數器測定熒光細胞。結果顯示在圖7中。當使用設計為具有不飽和烴基作為尾部的肽脂質時，GFP同樣在細胞中表達，并且發現質粒DNA被非常有效地引入細胞中。實施例9:使用具有樹狀聚體型氨基酸序列的肽脂質向培養細胞引入質粒DNA將培養細胞(CHO細胞)(lx105細胞/孔)在24孔板中預培養24小時(10%含有FBS的DMEM介質)，然后在引入時將介質與0.5ml新鮮的10%含有FBS的介質進行交換。將質粒DNA(pCMV-IE-hsGFP,購買于NIPPONGENECO.,LTD.，1lug/孑L)與25|ul150mMNaCl溶液混合。將各種1.3mM肽脂質(RE-C12、R2KE-C12、(RG)2KE-C12,各5)與上述質粒DNA溶液混合并將混合物培養5分鐘以得到肽脂質-DNA復合物。將復合物加入到上述提到的細胞中并將混合物在5%C02保溫箱中在37。C培養24小時。第二天，用熒光顯微鏡觀察細胞并通過流動血細胞計數器測定熒光細胞。結果顯示在圖8中。當使用設計為具有樹狀聚體型氨基酸序列作為頭部的肽脂質時，GFP同樣在細胞中表達，并且發現質粒DNA被非常有效地引入細胞中。實施例10:使用肽脂質將siRNA引入小鼠將Cy3-標記的siRNA(400pmol,購買于Dharmacon)與200|ul150mMNaCl溶液混合，1.3mM肽脂質(RE-C12)(16jal)與上述siRNA溶液混合并將混合物培養5分鐘以得到肽脂質-RNA復合物。將其從尾部靜脈注入Balb/c小鼠(15周大)。在小鼠中，在試驗濃度下沒有觀察到急性毒性。四小時后，將小鼠尸體剖檢并除去各個組織(心臟、肺、肝、腎、脾)，將其切成小塊并用熒光顯微鏡觀察。結果顯示在表l中。當肽脂質被用作載體時，siRNA可以被引入體內的各個組織。引入肝和脾的效率特別高。表l:使用肽脂質將siRNA引入小鼠的效果<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>工業實用性因為本發明的載體顯示低的細胞毒性并且在細胞內的化合物引入方面效率4艮高，所以它可用作高效的向細胞內引入研究和藥用用途的化合物的試劑。權利要求1、由下式(I)所代表的化合物其中R1是氨基酸或具有1-10個氨基酸殘基的肽，R2是任何氨基酸的側鏈，條件是R2具有羧基，所述羧基可以是含有具有1-30個碳原子的烴基的酯，并且R3是具有1-30個碳原子的烴基。2、權利要求1的化合物，其中R/是氨基酸或具有1-5個氨基酸殘基的肽。3、4又利要求1或2的化合物，其中R^含有至少一種選自Arg、Lys、Cys、Met、His、Tyr、Glu和Asp的氨基酸中的一個或多個殘基。4、權利要求3的化合物，其中W的N-末端氨基酸選自Arg、Lys、Cys、Met、His、Tyr、Glu和Asp。5、權利要求4的化合物，其中R1的N-末端氨基酸是Arg或Lys。6、權利要求1-5中任意一項的任意化合物，其中R2是-CH2COOR4或-C2H4COOR4(其中R"是具有l-30個碳原子的烴基)。7、權利要求6的化合物，其中W是具有10-20個碳原子的無支鏈的烷基或無支鏈的不飽和烴基。8、權利要求1-7中任意一項的任意化合物，其中W是具有10-20個碳原子的無支鏈的烷基或無支鏈的不飽和烴基。9、用于將感興趣的化合物引入細胞的載體，所述載體含有至少一種權利要求1-8的化合物。10、權利要求9的載體，其中所述感興趣的化合物是核酸。11、權利要求10的載體，其中所述核酸是質粒DNA、cDNA或反義DNA、或siRNA、miRNA、shRNA、mRNA、反義RNA或RNA復制子。12、權利要求9的載體，其中所述感興趣的化合物是肽或蛋白質。13、權利要求9-12中任意一項的載體和感興趣化合物的復合物。14、用于將感興趣的化合物引入細胞的方法，所述方法包括使權利要求13的復合物與細胞接觸。15、用于將感興趣的化合物？1入人或非人接受者體內的細胞中的方法，所述方法包括向接受者給予權利要求13的復合物。全文摘要本發明提供一種能夠將化合物高效地引入細胞的低毒性的載體，所述載體包含由(I)式所代表的肽脂質，以及使用該載體將化合物引入細胞的方法其中R¹是氨基酸或具有1-10個氨基酸殘基的肽，R²是任何氨基酸的側鏈，條件是R²具有羧基，所述羧基可以是含有具有1-30個碳原子的烴基的酯，R³是具有1-30個碳原子的烴基。文檔編號C07K5/10GK101421293SQ20068005425公開日2009年4月29日申請日期2006年3月1日優先權日2006年3月1日發明者井土剛志,佐佐本一美,山下聰子,楠本賢一,永田貴裕,池田千壽,濱地格,石山宗孝,石川智之,赤尾哲之,黑田理惠子申請人:福岡縣政府;株式會社同仁化學研究所