Cd86拮抗物多靶點結合蛋白的制作方法

專利名稱：Cd86拮抗物多靶點結合蛋白的制作方法
技術領域：
本發明總體涉及多特異性結合分子及其治療應用領域，更具體而言，涉及由CD86 拮抗物結合域和對異源靶點如IL-10激動劑、HLA-G激動劑、HGF激動劑、IL-35激動劑、PD-I 激動劑、BTLA激動劑、LIGHT拮抗物、GITRL拮抗物或CD40拮抗物具有特異性的另一個結合域組成的融合蛋白，及其組合物和治療應用。相關領域描述人免疫系統通常保護身體免受外來物質和病原體的損害。免疫系統保護身體的一種方式是通過產生稱為T淋巴細胞或T細胞的特化細胞。T細胞和抗原呈遞細胞(APC)之間的細胞間相互作用產生T細胞共刺激信號，從而引起T細胞對抗原產生應答。完整的T 細胞激活需要T細胞受體(TCR)與抗原呈遞細胞上存在的抗原-MHC復合物結合以及T細胞表面上的受體CD^與抗原呈遞細胞特別是樹突細胞上存在的CD86和/或CD80配體結
口 O⑶80 (也稱為B7-1)最初描述為人B細胞相關激活抗原，隨后發現其為相關T細胞分子CD^和細胞毒性T淋巴細胞相關抗原-4(CTLA4)的受體。在后來的研究中，鑒定出稱為⑶86(也稱為B7-0或B7-2)的CTLA4的另一個反受體。⑶86在其胞外區域與⑶80 具有約25%的序列相同性。盡管通常認為CD80和CD86在其啟動和保持CD4(+)T細胞增殖的能力方面具有功能等效性(Vasilevko等(2002)DNA Cell Biol. 21 :137-49)，阻斷這兩種分子該活性的可溶性CTLA4 Ig融合蛋白的臨床數據已顯示出臨床益處(Genovese等 (2005)NEJM 353 :114-1123)，一些證據表明對⑶86的特異性抑制作用可能有益。例如， ⑶86或⑶80的介入對B細胞具有不同作用。具體而言，⑶80已顯示提供正常B細胞和B 細胞淋巴瘤的增殖和IgG分泌的負信號，而⑶86則增強B細胞的活性(Suvas等Q002) J. Biol. Chem. 277 :7766-7775)。還有一些證據表明，CD80介入T細胞有免疫抑制作用(Lang等(2002) J. Immunol. 168 :3786-3792 ；Taylor 等 O004)J. Immunol. 172 :34-39 ；Paust 等 (2004) PNAS 101 10398-10403)，且其可通過PD-Ll (CD274)信號傳導介導對活化的APC或 T 細胞的進一步免疫抑制作用(Butte 等(2007) Immunity 27 :111-122 ；Keir (2008)Ann. Rev. Immunol. 26 :677-704)。因此，缺乏⑶80抑制作用下的⑶86抑制作用可在自身免疫和炎性疾病以及B細胞淋巴瘤的治療中具有益處。CTLA4是免疫球蛋白超家族的1型跨膜糖蛋白，其主要表達于活化T細胞中，也有一些表達發現于⑶4+⑶25+調節T細胞(Treg)亞群中。⑶86和⑶80被認為是CTLA4僅有的內源配體。已顯示CTLA4與⑶86和⑶80結合的親和力和親合力高于⑶觀(Linsley等 (1991) J.Exp· Med. 174 :561-69 ;Linsley 等(1994) Immunity 1 :793-801)，并作為 T 細胞激活的負調節物發揮關鍵作用。具體而言，CTLA4與CD80/CD86的結合引起T細胞應答的下調以及T細胞穩態和外周耐受性的保持。認為這種情況是由CD^依賴性共刺激的拮抗作用和通過CTLA4胞質尾區的定向負信號傳導造成的。CTLA4結構和功能的綜述參見Teft等 (2006)Annu. Rev. Immunol. 24 :65-97。如上所述，有效免疫應答同時需要TCR的介入以及⑶觀與⑶80和/或⑶86的結合。缺乏⑶觀結合下的TCR結合導致T細胞發生凋亡或變為無反應性。此外，已顯示⑶觀信號傳導增加T細胞細胞因子的產生。具體而言，已顯示CD^刺激作用使活化T細胞中的 IL-2、TNFa、淋巴毒素、IFN γ和GM-CSF的產量增加5_50倍。此外，已顯示即使在免疫抑制環孢菌素的存在下，CD^也會誘導淋巴因子和/或細胞因子基因表達(Thompson等(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 :1333-1337)。還已顯示 CD28 通過誘導上調抗凋亡 BCL-XL 促進 T 細胞存活(Alegre 等 Q001) Nature Rev. Immunol. 1 :220-228)。通過將CTLA4的可變樣胞外結構域與免疫球蛋白恒定結構域融合提供CTLA4_Ig 融合蛋白來構建CTLA4的可溶性形式。已顯示可溶性CTLA-4-Ig通過與⑶86和⑶80 二者結合防止CM8依賴性共刺激，并顯示其抑制T細胞共刺激，對人具有有益的免疫抑制作用(Bruce 和 Boyce (2007) Ann. Pharmacother. 41 1153-1162)。目前采用 CTLA4_Ig 融合蛋白阿巴西普(abatac印t)在抗TNF α治療應答不足的情況下治療類風濕性關節炎。然而， 并非所有患者對CTLA4-Ig均有應答，持續應答需要頻繁的給藥，可能部分因為阻斷CM8與 CD86/CD80的相互作用是Treg的弱誘導物，不足以在疾病環境中阻斷活化效應T細胞應答。附圖簡要說明

圖1顯示各種蛋白質與⑶80的結合，所述蛋白質包括阿巴西普、CTLA4-Ig(N2) (SEQ ID NO 11)和包含與ILlO融合的CTLA4胞外域的多特異性交叉受體(xc印tor)融合蛋白(SEQ ID NO 9)。圖2顯示CTLA4-Ig(N2) (SEQ ID NO :11)和包含與ILlO融合的CTLA4胞外域的多特異性交叉受體融合蛋白(SEQ ID NO 9)可與可溶性ILlORa(SlLlORa)結合。圖3和4顯示包含與ILlO融合的CTLA4胞外域的多特異性交叉受體融合蛋白(SEQ ID NO 9)可誘導PBMC中的STAT3磷酸化。圖5顯示包含來自3D1和人源化FUNl單克隆抗體的抗⑶86結合域的交叉受體與 WIL2-S細胞上的CD86結合。圖6顯示包含⑶86結合域和ILlO的交叉受體可同時結合細胞表面⑶86和 sIL 服a。
圖7顯示各種不同形式的人源化抗⑶86FUN1SMIP均可結合⑶86。圖8顯示具有將ILlO與交叉受體羧基末端(B^)連接的各種接頭的CTLA4: ILlO 交叉受體分子可結合 ILlORl-Ig0 Δ -SEQ ID NO :9 ; -SEQ ID NO 171 ；· -SEQ ID NO 302 ;▲ -SEQ ID NO :173。圖9顯示具有將ILlO與交叉受體羧基末端(BD2)連接的各種較短接頭的 CTLA4: ILlO 交叉受體分子可結合 IL10R1-Ig。Δ -SEQ ID NO :171 ; -SEQ ID NO :175; -SEQ ID NO 177 ；▲ -SEQ ID NO :179。 圖10顯示若干交叉受體蛋白結合⑶80。圖11顯示若干交叉受體蛋白結合⑶86。圖12顯示若干交叉受體蛋白結合sILlORa。圖13顯示若干交叉受體蛋白可同時結合⑶80和sILlORa。圖14顯示若干交叉受體蛋白與小鼠⑶80具有交叉反應性。圖15顯示若干交叉受體蛋白與小鼠⑶86具有交叉反應性。圖16和圖17顯示若干交叉受體蛋白在MLR試驗中阻斷人T細胞應答。圖18-圖20顯示若干交叉受體蛋白在MLR試驗中阻斷小鼠T細胞應答。圖21和22顯示包含變體ILlO (含187突變的ILlO或單IL10)或變體CTLA4的若干交叉受體蛋白在MLR試驗中阻斷人T細胞應答。圖23顯示包含變體ILlO (含187突變的ILlO或單IL10)的若干交叉受體蛋白在 MC/9細胞增殖試驗中的免疫刺激性小于小鼠IL10。圖M顯示包含變體ILlO (含187突變的ILlO或單IL10)的若干交叉受體蛋白在 MC/9細胞增殖試驗中的免疫刺激性小于人ILlO。發明詳述本發明使得靶向抗原呈遞細胞(APC)能夠改變活性。例如，T細胞活性可通過提供包含優先結合CD86的第一結合域和第二結合域(異源結合域)的多特異性交叉受體融合蛋白來調節。在某些實施方式中，多特異性交叉受體融合蛋白包含第一和第二結合域、第一和第二接頭以及間插結構域，其中間插結構域的一端通過接頭與作為CD86結合域的第一結合域融合，另一端通過接頭與作為IL-10激動劑、HLA-G激動劑、HGF激動劑、IL-35激動劑、PD-I激動劑、BTLA激動劑、LIGHT拮抗物、GITRL拮抗物或⑶40拮抗物的第二結合域融合。在某些實施方式中，所述⑶86結合域是CTLA4胞外域、⑶觀胞外域或具有⑶86特異性的免疫球蛋白可變區結合域(如scFv)(例如來自單克隆抗體3D1或FUN1)。在一些實施方式中，采用小于完整胞外域的部分。例如，可采用CTLA4域內與⑶86結合并防止⑶86 與CD^結合的結構域。在其它實施方式中，所述ILlO激動劑是ILlO或其功能區。在其它實施方式中，所述HLA-G激動劑是HLA-G5、HLA-G1、HLA-G突變蛋白或其功能區；HLA-G5、 HLA-Gl或HLA-G突變蛋白的胞外域；或具有ILT2、ILT4或KIR2DL4特異性的免疫球蛋白可變區結合域(如scFv)。在其它實施方式中，所述異源結合域是HGF激動劑，如HGF或其亞結構域。在另一個實施方式中，所述異源結合域是IL35激動劑，如具有IL35R、IL35或其功能區特異性的免疫球蛋自可變區結合域(如scFv)。在其它實施方式中，所述LIGHT拮抗物是具有LIGHT、HVEM胞外域或其功能區特異性的免疫球蛋白可變區結合域(如scFv)。在其它實施方式中，所述PD-I激動劑是具有PD-1、PD-1配體(例如，PD-Ll或PD-L2)或其功能區特異性的免疫球蛋白可變區結合域(如scFv)。在其它實施方式中，所述BTLA激動劑是具有BTLA、HVEM胞外域或其功能區特異性的免疫球蛋白可變區結合域(如scFv)。在某些實施方式中，所述GITRL拮抗物是具有GITRL、GITR胞外域、可溶性GITR或其功能區特異性的免疫球蛋白樣可變區結合域(如scFv)。在某些實施方式中，CD40拮抗物是具有CD40 特異性的免疫球蛋白樣可變區結合域(如scFv)。這樣的多特異性融合蛋白在本文稱為交叉受體OCceptor)分子，其示例性結構包括 N-BD-ID-ED-C、N-ED-ID-BD-C、N-BD1-ID-BD2-C 和 N-ED-ID-ED-C，其中 N-和-C 分別指氨基和羧基末端；BD是免疫球蛋白樣或免疫球蛋白可變區結合域；ID是間插結構域；ED是細胞外或胞外域，如受體配體結合域、配體、C型凝集素結構域、導向蛋白或導向蛋白樣結構域或類似結構。在一些構建體中，ID可包含置于第一和第二結合域之間的免疫球蛋白恒定區或亞區。在其它構建體中，BD和ED各自通過相同或不同的接頭(例如包含1-50個氨基酸的接頭)，如免疫球蛋白絞鏈區(由例如上部區域和核心區域構成)或其功能性變體，或凝集素域間區或其功能性變體，或分化簇(CD)分子柄區域(stalk region)或其功能性變體與ID連接。在更詳細地闡述本發明之前，提供本文所用某些術語的定義可能有助于理解本發明。其它定義在本說明書全文中列出。在本說明書中，任何濃度范圍、百分數范圍、比例范圍或整數范圍應理解為包括所述范圍內的任何整數值，適當時也包括其分數值(如整數的十分之一和百分之一)，除非另有說明。另外，本文所述的有關任何物理特征，如聚合物亞基、大小或厚度的任何數值范圍應理解為包括所述范圍內的任何整數，除非另有說明。本文所用的“約”或“主要由…組成” 指所述范圍、數值或結構的士20%，除非另有說明。應理解，本文所用術語“一個”和“一種” 指“一個或多個”所列舉的組分。替代物的使用(例如“或”)應理解為所述替代物中的一個、兩個或其任何組合。本文所用術語“包括”和“包含”可作為同義詞使用。此外，應理解本申請公開衍生自本文所述結構和取代基的各種組合的單個化合物或化合物組就好像各化合物或化合物組單獨列出那樣相同的程度。因此，特定結構或特定取代基的選擇屬于本發明范圍內。本發明所述的“結合域”或“結合區”可以是例如，具有特異性識別和結合生物分子 (如CD86)或一個以上相同或不同分子的復合物或裝配體或聚集體(不論它是穩定的或是瞬時的，例如CD86/CD^復合物)的能力的任何蛋白質、多肽、寡肽或肽。這類生物分子包括蛋白質、多肽、寡肽、肽、氨基酸或其衍生物；脂質、脂肪酸或其衍生物；碳水化合物、糖類或其衍生物；核苷酸、核苷、肽核酸、核酸分子或其衍生物；糖蛋白、糖肽、糖脂、脂蛋白、蛋白脂類或其衍生物；生物樣品中可能存在的其它生物分子；或者它們的任何組合。結合區包括生物分子或其它感興趣靶點的任何天然產生、合成、半合成或重組產生的結合伙伴。已知鑒定特異性結合特定靶點的本發明的結合域的各種試驗，包括FACS、Western印跡、ELISA 或Biacore分析。如果本發明的結合域和其融合蛋白結合靶分子的親和力或Ka(即特定結合相互作用的平衡結合常數，單位是1/M)例如大于或等于約IO5M-1UO6M-1UO7M-1UO8M-1UO9M-^ IOiqM-1UO11M-1UO12M-1或IO13M-1,則它們能夠以所需程度結合，包括“特異性或選擇性結合”靶點，而不顯著結合測試樣品中的其它組分。“高親和力”結合域指&為至少κΛτ1、至少 10 -1、至少IO9M-1、至少IOkT1、至少ΙΟ、—1、至少IO12M-1A至少IO13M"1或更大的結合域。或者，親合力可定義為特定結合相互作用的平衡解離常數(Kd)，單位是M (例如10_5Μ-10_13Μ)。 本發明所述結合域多肽和融合蛋白的親和力可采用常規技術很容易地測定(參見例如， Scatchard 等(1949)Ann. N. Y. Acad. Sci. 51 :660 ；和美國專利號 5，283，173,5, 468，614 或等效物)。可如本文所述或通過本領域已知的各種方法產生本發明的結合域(參見例如，美國專利6，四1，161,6, 291, 158)。來源包括來自各種物種，包括人、駝科動物(來自駱駝、 單峰路馬它或美洲馬它；Hamers-Casterman 等(1993) Nature，363 :446 和 Nguyen 等(1998) J. Mol. Biol.，275 :413)、鯊魚(Roux 等(1998) Proc. Nat' 1. Acad. Sci. (USA) 95 :11804)、 魚(Nguyen等Q002) Immunogenetics，54 :39)、嚙齒動物、禽類、綿羊的抗體基因序列(形式可以是sFv、scFv或Fab，如噬菌體文庫中的情況)，編碼隨機肽文庫的序列或編碼其它替代性非抗體支架的環區域中工程改造的多種氨基酸的序列，如血纖蛋白原結構域(參見例如，Weisel等(1985) Science 230 :1388)、庫尼茨(Kunitz)結構域(參見例如，美國專利6，423，498)、脂質運載蛋白結構域(參見例如，WO 2006/095164)、V樣結構域(參見例如，美國專利申請公開號2007/006M31)、C-型凝集素結構域Qelensky和GreadH2005) FEBS J. 272 :6179)、mAb2 或 Fcab (參見例如 PCT 專利申請公開號 WO 2007/098934、WO 2006/072620)或類似序列。此外，也可采用例如將合成的單鏈⑶86作為方便系統(例如， 小鼠、HuMAb小鼠 、TC小鼠 、KM-小鼠 、美洲駝、雞、大鼠、倉鼠、家兔等)中的免疫原的雜交瘤開發傳統策略來開發本發明的結合域。除非另有說明，抗體技術領域技術人員理解的術語各自具有所述領域獲得的含義。例如，術語和“VH”分別指衍生自抗體輕鏈和重鏈的可變結合區。可變結合區由離散的良好限定的亞區域構成，這些區域稱為“互補決定區”(CDR)和“框架區”(FR)。術語 “CJ和“C/指“免疫球蛋白恒定區”，即分別指衍生自抗體輕鏈或重鏈的恒定區，后者還理解為根據衍生該區域的抗體的同種型(IgA、IgD、IgE、IgG、IgM)進一步分為CH1、CH2、CH3和 CH4恒定區結構域。恒定區結構域的一部分構成Fc區(“可結晶片段”區)，其包含負責免疫球蛋白效應物功能如ADCC(抗體依賴性細胞介導的細胞毒性)、CDC(補體依賴性細胞毒性)和補體結合、與Fc受體結合、相對于缺乏Fc區的多肽體內半衰期延長、蛋白A結合、可能甚至是胎盤轉移的結構域(參見Capon等(1989) Nature，337 :525)。此外，含有Fc區的多肽能夠發生多肽的二聚化或多聚化。“絞鏈區”在本文也稱為“接頭”，它是插于抗體單鏈的可變結合區和恒定區之間并連接二者的氨基酸序列，本領域已知它以絞鏈形式為抗體或抗體樣分子提供柔性。免疫球蛋白的結構域結構適合工程改造，可在免疫球蛋白分子不同類和亞類之間交換抗原結合域和產生效應物功能的結構域。有關免疫球蛋白結構和功能的綜述參見例如 Harlow等編，《抗體實驗室手冊(Antibodies =A Laboratory Manual)》，第14章(冷泉港實驗室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory)，冷泉港(Cold Spring Harbor)，1988)。 有關重組抗體技術的各方面的大量介紹和詳細信息可參見教科書《重組抗體》(約翰韋利森出版社(John Wiley & Sons)，紐約，1999)。有關抗體工程的詳細實驗方案的全面集合可參見 R. Kontermann 和 S. Dubel 編，《抗體工程實驗室手冊(The Antibody Engineering LabManual)》(施普林格出版社(Springer Verlag)，海德堡/紐約，2000)。其它相關方案還可參見馬薩諸塞州波士頓的約翰韋利森出版社出版的《當代免疫學方案(Current Protocols in Immunology)》(2009 年 8 月)。本文所用的“衍生物”指化學或生物學改性形式的化合物，其結構類似于母體化合物且(實際或理論上)可從該母體化合物獲得。通常，“衍生物”不同于“類似物”，母體化合物可以是產生“衍生物”的原料，但母體化合物不一定用作產生“類似物”的原料。類似物可具有與母體化合物不同的化學或物理性質。例如，與母體化合物相比，衍生物可能親水性更高或反應性改變(例如具有改變其靶點親和力的氨基酸改變的CDR)。術語“生物學樣品”包括來自對象或生物來源的血樣、活檢樣品、組織外植體、器官培養物、生物流體(例如，血清、尿液、CSF)或任何其它組織或細胞或其它制備物。對象或生物來源可以是例如，人或非人動物、原代細胞培養物或適合培養的細胞系，包括可含有染色體整合的或附加體形式的重組核酸序列的遺傳工程改造細胞系、體細胞雜交細胞系、永生化或可永生化細胞系、分化或可分化細胞系、轉化的細胞系或類似細胞系。在本發明的其它實施方式中，對象或生物來源可疑似患有疾病、失調或病癥，或處于患上疾病、失調或病癥的風險中，所述疾病、失調或病癥包括惡性疾病、失調或病癥或B細胞疾病。在某些實施方式中，對象或生物來源可疑似患有過度增殖、炎癥或自身免疫疾病或者處于發生這些疾病的風險中，在本發明某些其它實施方式中，對象或生物來源可以是已知不具患這樣的疾病、 失調或病癥的風險，或不存在這樣的疾病、失調或病癥。CD86 結合域如本文所述，⑶86包含作為免疫球蛋白超家族成員的I型膜蛋白。⑶86由抗原呈遞細胞表達，其為兩種T細胞蛋白⑶觀和CTLA4的配體。⑶觀與⑶觀的結合是T細胞激活作用的共刺激信號，而CM8與CTLA4的結合則下調T細胞激活作用并降低免疫應答。可變剪接產生編碼不同同種型的兩種轉錄物變體(Genbank登錄號NP_787058. 3和 NP_008820. 2)。本發明的⑶86結合域可阻斷⑶86結合⑶觀，由此下調T細胞激活作用。所考慮的⑶86結合域包括CTLA4胞外結構域或其亞結構域、⑶觀胞外結構域或其亞結構域、⑶86 特異性抗體衍生結構域(如衍生自FUNl單克隆抗體(參見例如，J Pathol. 1993年3月； 169(3) =309-15)；或衍生自3D1抗CD86單克隆抗體)。在一些實施方式中，⑶86結合域是人CTLA4 (Genebank登錄號NP_0052(^)的胞外結構域(“胞外域”)，如SEQ ID NO :1的成熟多肽序列(信號肽氨基酸1-37)。不含信號肽的CTLA4胞外域的氨基酸序列見SEQ ID NO :410所提供。申請人注意到某些研究顯示CTLA4 胞外域的成熟多肽從SEQ ID NO :1第38位的甲硫氨酸開始，其它研究顯示所述成熟多肽從第37位的丙氨酸開始。在其它實施方式中，CD86結合域是經突變以使對CD86的親和力高于野生型或非突變型CTLA4的CTLA4胞外域，如例如美國專利申請公開號US 2003/0035816 所公開的。在某些實施方式中，突變CTLA4胞外域在SEQ ID NO :410的第四位氨基酸包含丙氨酸或酪氨酸，和/或在第104位包含谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、異亮氨酸、亮氨酸或蘇氨酸。h2m L104E CTLA 4胞外域變體的氨基酸序列見SEQ ID NO :411所提供。在某些實施方式中，⑶86結合域是CTLA-4可變樣結構域，如SEQ ID NO :3提供的序列；或 CTLA-4 可變樣結構域的 CDR，如 SEQ ID NO :4 (CDRl)、SEQ ID N0:5(CDR2)或 SEQ IDN0:6(⑶R3)。這樣的⑶R見例如美國專利7，405，288描述。在替代性實施方式中，CD86結合域是CD28胞外結構域(“胞外域”)(Genbank登錄號ΝΡ_006130· 1)，如SEQ ID NO 2提供的序列。SEQ ID NO :2的氨基酸1-18是信號肽。不含信號肽的CD^胞外域的氨基酸序列見SEQ ID NO 412所提供。在其它實施方式中，CD86結合域包含具有CD86特異性的單鏈免疫球蛋白樣結構域，如scFv。在某些實施方式中，所述CD86結合域包含來自單克隆抗體FUNl或3D1的輕鏈和重鏈可變結合域。來自FUNl和3D1抗⑶86單克隆抗體的重鏈、輕鏈、scFv接頭和⑶R 的序列分別見SEQ NO =305-313和318-3 所示，可用于本發明的交叉受體分子。在一方面，本發明的CD86結合域或其融合蛋白具有CD86特異性，其親和力的離解常數(Kd)為約IO3M到小于約10_8M。在某些優選實施方式中，所述CD86結合域或其融合蛋白與⑶86結合的親和力為約0. 3 μ M。在一個示例性實施例中，可利用Fab片段噬菌體文庫(參見例如，Hoet等Q005) Nature Biotechnol. 23 344)，通過篩選與合成或重組的CD86 (使用GenBank登錄號 NP_787058. 3或NP_008820. 2所示的氨基酸序列或其片段)的結合，鑒定本發明的⑶86結合域。在某些實施方式中，用于產生⑶86結合域的⑶86分子還可包含本文所述的間插結構域或二聚化結構域，如免疫球蛋白Fc結構域或其片段。在一些實施方式中，本發明的⑶86結合域包含本文所述的V1^nt結構域(例如，FUNU3D 1或其人源化衍生物)。其它示例性Vh和Vl結構域包括美國專利6，827，934 所述的結構域。在某些實施方式中，所述％和\結構域是人的結構域。在其它實施方式中，提供的本發明CD86結合域具有與SEQ NO :305和306、SEQ NO :318和319或美國專利 6，827，934(通過引用納入本文)公開序列的一種或多種輕鏈可變區或一種或多種重鏈可變區(Vh)或二者的氨基酸序列至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、 至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99. 5%或至少100%相同的序列，其中各CDR可具有0、1、2或3個氨基酸改變(即多數改變位于框架區中)。在兩種或多種多肽或核酸分子序列中，術語“相同，，或“相同性百分數”指在比較窗口或指定區域上，采用本領域已知方法如序列比較算法，通過手工比對或目測檢查來比較和比對最大對應性時，兩個或多個序列或子序列在指定區域相同或其中有一定百分數的氨基酸殘基或核苷酸相同(例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同)。例如，適合測定序列相同性百分數和序列相似性百分數的優選算法是BLAST和BLAST 2. 0算法，分別見Altschul等(1977) Nucleic Acids Res. 25 :3389 和 Altschul 等(1990) J. Mol. Biol. 215 :403 所述。在本文所述的可能需要\和Vh結構域的任何這些或其它實施方式中，\和Vh結構域可以任何取向排列，可由本文所述的最多約30個氨基酸的接頭或能夠提供與兩個亞結合域相互作用相容的間隔物功能的任何氨基酸序列分隔開。在某些實施方式中，連接Vh 和 Vl 結構域的接頭包含 SEQ ID NO :43-166、244、307、320、355-379 和 383-398 中一個或多個所示的氨基酸序列，如接頭46 (SEQ ID NO :88)、接頭130 (SEQ ID NO 163)、接頭131 (SEQ ID NO :164)、接頭115 (SEQ ID NO :148)或SEQ ID NO :244中提供的接頭。多特異性結合域將具有至少兩個特異性亞結合域，其類似于駝類抗體組成；或具有至少四個特異性亞結合域，其類似于成對Vh和\鏈的更常規的哺乳動物抗體組成。
本領域以多種方式定義了 CDR，包括Kabat、Chothia、AbM和接觸定義。Kabat定義基于序列可變性，是預測CDR區的最常用定義(Johnson等(2000) Nucleic Acids Res. 28 214)。Chothia 定義基于結構環區域的位置(Chothia 等(1986) J. Mol. Biol. 196 901 ； Chothia等(1989)Nature 342 :877)。AbM定義在Kabat和Chothia定義之間作出妥協，它是牛津分子集團Oxford Molecular Group)開發的用于抗體結構建模的完整程序包(Martin 等(1989) Proc. Nat' 1. Acad. Sci. (USA) 86 :9268 ；Rees 等，ABMTM，“用于抗體可變區建模的 i十算機禾呈序(a computer program for modeling variable regions of antibodies) ”， Oxford, UK ；牛津分子公司(Oxford Molecular, Ltd.))。近來引入了稱為接觸定義的另外一種定義(參見MacCallum等(1996) J. Mol. Biol. 5 :732)，該定義基于對可用復合物晶體結構的分析。按照慣例，重鏈中的⑶R結構域稱為HI、H2和H3，它們是從氨基末端向羧基末端順序編號的。⑶R-Hl長度約為10-12個殘基，根據Chothia和AbM定義從Cys之后4個殘基處開始，或根據Kabat定義從其后5個殘基處開始。Hl后可接Trp、Trp-Val、Trp-Ile 或Trp-Ala。根據AbM定義，Hl的長度約為10-12個殘基，而Chothia定義則排除了最后四個殘基。根據Kabat和AbM定義，⑶R-H2從Hl末端后15個殘基處開始，通常其前接序列Leu-Glu-Trp-Ile-Gly (但已知多個變異)且通常后接序列Lys/Arg-Leu/Ile/Val/Phe/ Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Ala。根據Kabat定義，H2的長度為約16-19個殘基，而AbM定義預測所述長度為9-12個殘基。CDR-H3通常從H2末端后33個殘基處開始，通常前接氨基酸序列Cys-Ala-Arg且后接氨基酸Gly，其長度范圍是3到約25個殘基。按照慣例，輕鏈中的CDR區稱為Ll、L2和L3，它們是從氨基末端向羧基末端順序編號的。⑶R-Ll (長度約為10-17個殘基)通常從約殘基M處開始，并通常前接Cys。⑶R-Ll之后的殘基總是 ^Ρ，以其開始以下序列中的一種Trp-Tyr-Gln、Trp-Leu-Gln, Trp-Phe-Gln 或Trp-Tyr-Leu。⑶R_L2 (長度約為7個殘基)從Ll末端后約16個殘基處開始，通常前接殘基Ile-Tyr、Val-Tyr, Ile-Lys或Ile-Phe。CDR-L3通常從L2末端后33個殘基處開始， 通常前接Cys，且通常后接序列Phe-Gly-XXX-Gly，其長度約為7_11個殘基。因此，本發明的結合域可包含來自抗⑶86抗體的可變區的單個⑶R，或其可包含多個相同或不同的CDR。在某些實施方式中，本發明的結合域包含具有CD86特異性的Vh* Vl結構域，其包含框架區以及CDR1、CDR2和CDR3區，其中(a)所述Vh結構域包含重鏈CDR3 的氨基酸序列；或(b)所述\結構域包含輕鏈CDR3的氨基酸序列；或(c)所述結合域包含(a) 氨基酸序列和(b)的\氨基酸序列；或所述結合域包含(a) 氨基酸序列和(b)的八氨基酸序列，且其中Vdn八發現于同一參比序列中。在其它實施方式中，本發明的結合域包含具有⑶86特異性的V1^P \結構域，其包含框架區以及⑶R1、⑶R2和⑶R3 區，其中(a)所述Vh結構域包含重鏈CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；或(b)所述\結構域包含輕鏈⑶R1、⑶R2和⑶R3的氨基酸序列；或(c)所述結合域包含(a)的Vh氨基酸序列和(b)的\氨基酸序列；或所述結合域包含(a) 氨基酸序列和(b)的\氨基酸序列，其中所述Vh和\氨基酸序列來自同一參比序列。在本文所述的包含特異性CDR的任何實施方式中，結合域可包含(i) Vh結構域，其具有與Vh結構域的氨基酸序列至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97%、98%或99%相同的氨基酸序列；或(ii)八結構域，其具有與八結構域的氨基酸序列至少 80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99%相同的氨基酸序列；或(iii)同時包含⑴的Vh結構域和(ii)的八結構域；或同時包含⑴結構域和(ii)的\結構域，其中V1^Pt來自同一參比序列，且各CDR具有最多3個氨基酸改變(即多個改變位于框架區中)。本發明交叉受體融合蛋白中的CD86結合域可以是免疫球蛋白樣結構域，如免疫球蛋白支架。本發明考慮的免疫球蛋白支架包括scFv、結構域抗體或僅含重鏈的抗體。在 scFv中，本發明考慮到重鏈和輕鏈可變區由本文所述或本領域已知的任何接頭肽連接，以與結合分子中連接的結構域或區域相容。示范性接頭是基于GlyJer接頭基序的接頭，例如 (GlyJer)n，其中η = 1-5。如果本發明融合蛋白的結合域基于非人免疫球蛋白或包含非人 CDR,則所述結合域可根據本領域已知方法“人源化”。或者，本發明融合蛋白的CD86結合域可以是除免疫球蛋白支架以外的支架。本發明考慮的其它支架能以功能性構象呈遞CD86特異性CDR。所考慮的其它支架包括但不限于Α結構域分子、纖連蛋白III結構域、抗脂質運載蛋白(anticalin)，錨蛋白重復工程改造的結合分子、腺連蛋白(adnectin)，庫尼茨(Kimitz)結構域或蛋白AZ結構域親和體 (affibody)。ILlO如上所述，在某些實施方式中，本發明提供含有作為ILlO激動劑(即可提高ILlO 信號傳導)的結合區或結合域的多肽。在一些實施方式中，ILlO激動劑結合域是ILlO或 ILlOFc，或其功能性亞結構域。在其它實施方式中，所述ILlO激動劑結合域是特異性結合 ILlORl或IL10R2的單鏈結合蛋白，如scFv。在一些實施方式中，所述ILlO激動劑結合域是包含SEQ ID NO 7第87位點突變，如從“ I ”變為“A”或“S” (本文分別稱為I87A或I87S) 的ILlO0已知187變體ILlO分子與野生型ILlO相比免疫刺激性較小(Ding等，J. Exp. Med. 191 :213，2000)。此外，ILlO通常形成同型二聚體，其中某一單體分子的氨基末端結構域結合于另一個單體羧基末端結構域。在一個實施方式中，所述ILlO激動劑結合域是具有較短接頭(gggsgg SEQ ID NO 379)的ILlO分子，所述接頭將所述分子的兩個亞結構域 (氨基和羧基末端結構域)分隔開，以使這些亞結構域可形成分子內二聚體，也對其進行檢測。這些在本文稱為單ILlO分子。ILlO (Genbank 登錄號 ΝΡ_000563· 1 ；SEQ ID NO 7)是共享 α -螺旋結構的細胞因子超家族的成員。SEQ ID NO :7的氨基酸1-18是前體ILlO蛋白的信號肽。成熟IL 10 蛋白的氨基酸序列見SEQ ID NO :418所提供。雖然不存在經驗證據，但據提示所有家族成員均具有 6 個 α -螺旋(Fickenscher, H.等，(2002) Trends Immunol. 23 :89)。ILlO 含有 4個半胱氨酸，其中只有一個在家族成員中具有保守性。由于ILlO顯示了有助于二聚化的 V-形折疊，因此看來二硫鍵對該結構并不重要。家族成員與ILlO的氨基酸相同性在20% (IL-19)到沘％ (IL-20)之間變化(Dumouter 等，Q002)Eur. Cytokine Netw. 13 :5)。ILlO最初被描述為小鼠中抑制Thl細胞生產IFN-α和GM-CSF細胞因子的Th2 細胞因子(Moore 等，2001，Annu. Rev. Immunol. 19 :683 ；Fiorentino 等(1989) J.Exp· Med. 170 :2081)。人ILlO的長度為178個氨基酸，含有18個氨基酸的信號序列和160個氨基酸的成熟區段。其分子量為約ISkDa(單體)。人ILlO不含潛在的N連接糖基化位點， 且不發生糖基化(Dumouter 等，Q002)Eur. Cytokine Netw. 13 :5 ；Vieira 等(1991)Proc.Natl. Acad. Sci. USA 88:117幻。其含有4個半胱氨酸殘基，形成兩個鏈內二硫鍵。一個單體的螺旋A- > D與第二單體的螺旋E和F發生非共價相互作用，形成非共價的V形同型二聚體。已對ILlO分子上的功能性區域作圖。在N末端，前螺旋A殘基#1-9參與肥大細胞增殖，而在C-末端，螺旋F殘基#152-160介導白細胞分泌和趨化性。已知表達ILlO的細胞包括⑶8+T細胞、小膠質細胞、⑶14+ (但非⑶16+)單核細胞、Th2⑶4+細胞(小鼠)、角質形成細胞、肝星狀細胞、Thl和Th2⑶4+T細胞(人)、黑色素瘤細胞、活化的巨噬細胞、NK細胞、樹突細胞、B細胞(CD5+和CD19+)和嗜酸性粒細胞。現在認為，最初觀察到ILlO對T細胞IFN-γ產生的抑制作用是輔助細胞介導的間接作用。然而，對T細胞的其它作用包括IL10誘導的CD8+T細胞趨化性、CD4+T細胞向IL-8的趨化性的抑制作用、激活后的IL-2產生的抑制作用、通過Bcl-2上調對T細胞凋亡的抑制作用和伴隨⑶觀共刺激的低抗原暴露后的T細胞增殖的中斷作用(Akdis等，Q001) Immunology 103 131)。ILlO對B細胞具有多個相關但獨特的功能。ILlO能與TNF-β和⑶40L—起誘導幼稚(IgD+)B細胞產生IgA。據信，TGF-β/⑶40L促進類型轉換，而ILlO啟動分化和生長。不存在TGF- β時，ILlO與⑶40L協作誘導IgGl和IgG3 (人)，因此可能是IgG亞型的直接轉換因子。有趣的是，ILlO對IL-4誘導的IgE分泌具有分歧作用。如果ILlO在IL-4 誘導類型轉換時存在，則其能逆轉所述作用；如果其在IgE定型后存在，其會增加IgE的分泌。最后，ILlO存在下的⑶27/⑶70相互作用會促進由記憶B細胞形成漿細胞(Agematsu 等(1998)Blood 91 :173)。肥大細胞和NK細胞也受ILlO的影響。ILlO能誘導肥大細胞釋放組胺，同時阻斷其釋放GM-CSF和TNF-α。該作用可以是自分泌，因為已知大鼠的肥大細胞能釋放IL10。 作為其多效性的證據，ILlO對NK細胞具有相反的作用。ILlO實際上能促進NK細胞產生 TNF- α和GM-CSF，而非阻斷該功能。此外，它能增強IL-2誘導的NK細胞增殖并促進IL-18 致敏的NK細胞分泌IFN- γ。與IL-12和/或IL-18 —致，ILlO能增強NK細胞的細胞毒性 (Cai 等，1999，Eur. J. Immunol. 29 :2658)。ILlO對嗜中性粒細胞有顯著的抗炎作用。它能抑制趨化因子MIP-I α ,MIP-I β和 IL-8的分泌，并阻斷促炎介導物IL-I β和TNF-α的產生。此外，它能降低嗜中性粒細胞產生超氧化物的能力，因而會干擾PMN介導的抗體依賴性細胞毒性。它也阻斷IL-8和fMLP誘導的趨化性，可能通過CXCRl發揮該作用(Vicioso等，(1998) Eur. Cytokine Netw. 9 247)。ILlO通常對樹突細胞(DC)具有免疫抑制作用。它顯示以DC為代價促進⑶14+巨噬細胞分化。ILlO似乎能降低DC刺激T細胞，特別是Thl型細胞的能力。相對于MHC-II 表達，它可能被下調、不變或上調(Sharma等，(1999) J. Immunol. 163 :5020)。至于CD80和 ⑶86，ILlO能上調或下調其表達。B7-2/⑶86在T細胞激活中起到關鍵作用。就該分子而言，ILlO同時參與其上調和下調作用。然而，最顯著的調節作用也許出現在⑶40上(IL10 顯示降低其表達)。在區域水平，ILlO可通過響應于促炎細胞因子抑制朗格漢斯細胞遷移而阻斷免疫刺激。或者，ILlO阻斷炎癥誘導的DC成熟步驟，所述步驟通常包括CCR1、CCR2 和CCR5下調以及CCR7上調。該阻斷作用連同CCR1、CCR2和CCR5的保持導致DC無法遷移到區域性淋巴結。結果是產生不會刺激T細胞但會結合(和清除)促炎趨化因子而不對其產生應答的不移動的 DC(D-Amico 等，Q000)Nat. Immunol. 1 :387)。
已報道ILlO對單核細胞具有多種作用。例如，ILlO顯示能明顯降低細胞表面 MHC-II的表達。其還在刺激后抑制IL-12的產生。雖然它能與M-CSF聯合促進單核細胞向巨噬細胞轉變，但巨噬細胞的表型不明顯(即CD16+/細胞毒性相對CD16-)。ILlO也能降低單核細胞的GM-CSF分泌量和IL-8產量，同時促進IL-Ira的釋放(Gesser等，(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA94 :14620)。透明質粘連蛋白是結締組織的組分，已知它由單核細胞響應于ILlO而分泌。這可能對細胞遷移，特別是腫瘤細胞轉移具有重要影響，已知透明質粘連蛋白能破壞細胞通過胞外空間的遷移((Cesser等，(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 :14620)。已顯示ILlO與鼠或獼猴Fc區的融合蛋白(稱為ILlOFc)能抑制巨噬細胞功能并延長胰島異源移植體的存活(Feng 等(1999)Transplantation68 :1775 ；Asiedu 等(2007) Cytokine 40 183)，并減輕鼠模型中的敗血性休克(Zheng等(1995) J. Immunol. 154 5590)。人ILlORl是90_110kDa的、I型單次跨膜糖蛋白，其表達于有限數量的細胞類型 (Liu等，1994，J. Immunol. 152 :1821)。在胰、骨骼肌、腦、心和腎中觀察到弱表達。胎盤、肺和肝顯示中等水平。單核細胞、B細胞、大粒淋巴細胞和T細胞高水平表達(Liu等，1994， J. Immunol. 152 :1821)。表達的蛋白是578個氨基酸的蛋白，其包含21個氨基酸的信號肽、 215個氨基酸的胞外區、25個氨基酸的跨膜區和317個氨基酸的胞質結構域。胞外區內存在兩個FNIII基序，胞質域內存在STAT3停靠位點和JAKl結合區(Kotenko等，20000ncogene 19 2557 ；Kotenko 等，1997，EMBO J. 16 :5894)。ILlORl 結合人 ILlO 的 Kd 為 200pM。在一些實施方式中，本發明的結合域包含如本文所述具有ILlORl或IL10R2特異性的\和Vh結構域。在某些實施方式中，所述\和Vh結構域是人的結構域。結構域可以任何取向排列，并可由本文所述的至多約30個氨基酸的接頭或能夠提供與兩個亞結合域相互作用相容的間隔物功能的任何其它氨基酸序列分隔開。在某些實施方式中，連接 Vl 和 Vh 結構域的接頭包含 SEQ ID NO :43-166、244、307、320、355_379 和 383-398 中所示的氨基酸序列，如SEQ ID NO 244中提供的接頭、接頭46 (SEQ ID NO 88)、接頭130 (SEQ ID NO 163)或接頭131 (SEQ ID NO :164)。多特異性結合域可具有至少2個特異性亞結合域，其類似于駝類抗體組成；或具有至少4個特異性亞結合域，其類似于成對\和Vh鏈的更常規哺乳動物抗體組成。在其它實施方式中，本發明具有ILlORl或IL10R2特異性的結合域可包含一個或多個互補決定區(“OTR")，或多個拷貝的一種或多種這類⑶R，這類⑶R 由抗-ILlORl或抗IL10R2的scFv或Fab片段可變區或其重鏈或輕鏈可變區獲得、衍生或設計出。因此，本發明的結合域可包含來自抗-ILlORl或抗-IL10R2的可變區的單個⑶R， 或可包含多個相同或不同的CDR。在某些實施方式中，本發明的結合域包含具有ILlORl或 IL10R2特異性的\和Vh結構域，其包含框架區和CDR1、CDR2和CDR3區。HLA-G如上所述，在某些實施方式中，本發明提供含有作為HLA-G激動劑(即可提高ILlO 信號傳導)的結合區或結合域的多肽。在一些實施方式中，所述HLA-G激動劑結合域是 HLA-Gl (SEQ ID NO 14)、HLA_G5 (SEQ ID NO :15)或HLA-G突變蛋白，其中成熟蛋白第 147位的半胱氨酸突變為替代氨基酸例如絲氨酸。HLA-Gl和HLA-G5的氨基酸1- 和1_23分別表示信號肽。在其它實施方式中，所述HLA-G激動劑結構域是HLA-Gl或HLA-G5的胞外域，含或不含通過柔性接頭與N末端連接的β-2微球蛋白。這樣接頭的例子包括SEQ ID NO 43-166、244、307、320、355-379和383-398提供并在以下描述的接頭。可溶性HLA-Gl的制備見美國專利申請公開號US2004/0044182所述。在其它實施方式中，所述HLA-G激動劑結合域是與ILT2、ILT4或KIR2DL4特異性結合的免疫球蛋白可變結合域或其衍生物(例如，抗體、Fab、scFv或類似衍生物)。具有 ILT2、ILT4或IQR2DL4特異性的抗體包括例如，美國專利申請公開號US 2003/0232051中描述的抗體。人白細胞抗原G(HLA-G)是非經典主要組織相容性復合體(MHC) I型分子，其為由重鏈和輕鏈(β_2微球蛋白)組成的異型二聚體，其中重鏈錨著在膜上。HLA-G作為保護胎兒組織免受母體免疫系統攻擊的免疫調節分子發揮作用。盡管HLA-G組成性表達僅限于胎兒組織、成人胸腺髓質、角膜、胰島、紅細胞和內皮細胞前體，但可在癌癥、移植、多發性硬化、炎性疾病和病毒感染中誘導其表達。HLA-G初級轉錄物產生編碼膜結合蛋白同種型 HLA-G 1、-G2、-G3和-G4以及可溶性蛋白質同種型HLA-G5、HLA_G6和HLA-G7的7種選擇性 mRNA，其中HLA-G5是細胞表面結合HLA-Gl蛋白的可溶性形式。盡管HLA-G似乎不具有顯著的免疫刺激功能，但已顯示其結合抑制性受體，即 ILT2、ILT4、KIR2DL4和⑶8，并由此與B細胞、T細胞、NK細胞和抗原呈遞細胞發生相互作用。HLA-G的二聚體形式對ILT2的親和力比對ILT4、IQR2DL4或⑶8的親和力高出若干數量級。已顯示HLA-Gl抑制子宮和外周血NK細胞的溶細胞功能、細胞毒性T淋巴細胞的抗原特異性溶細胞功能、CD4+T細胞的同增殖(alloproliferative)應答、T細胞和外周血NK細胞的增殖、樹突細胞的成熟和功能(參見例如，Wiendl等(2003)Blood, 126 :176-185)。已表明HLA-G可用于降低CNS中與多發性硬化相關的炎癥應答(Wiendl等Q005) Blood，128 2689-2704)，并作為促進移植中移植物耐受性的治療劑(Carosella^ (2008)Blood 111 4862-4870)。在一些實施方式中，本發明的結合域包含如本文所述具有ILT2、ILT4或KIR2DL4 特異性的&和Vh結構域。在某些實施方式中，所述\和Vh結構域是人的結構域。
結構域可以任何取向排列，并可由本文所述的至多約30個氨基酸的接頭或能夠提供與兩個亞結合域相互作用相容的間隔物功能的任何其它氨基酸序列分隔開。在某些實施方式中，連接 Vl 和 Vh 結構域的接頭包含 SEQ ID NO :43-166、244、307、320、355_379 和 383-398 中一個或多個所示的氨基酸序列，如接頭115 (SEQ ID NO 148), SEQ ID NO :244中提供的接頭、接頭 46 (SEQ ID NO :88)、接頭 130 (SEQ ID NO :163)或接頭 131 (SEQ ID NO :164)。多特異性結合域可具有至少2個特異性亞結合域，其類似于駝類抗體組成；或具有至少4個特異性亞結合域，其類似于成對\和Vh鏈的更常規哺乳動物抗體組成。在其它實施方式中，本發明的ILT2、ILT4或KIR2DL4特異性結合域可包含一個或多個互補決定區(“OTR")，或多個拷貝的一種或多種這類⑶R，這類⑶R是抗ILT2、抗 ILT4或抗KIR2DL4的scFv或Fab片段可變區或其重鏈或輕鏈可變區獲得、衍生或設計出。 因此，本發明的結合域可包含來自抗ILT2、抗ILT4或抗KIR2DL4的可變區的單個⑶R，或可包含多個相同或不同的CDR。HGF如上所述，在某些實施方式中，本發明提供含有作為HGF激動劑(即可提高HGF信號傳導)的結合區或結合域的多肽。在一些實施方式中，所述HGF激動劑結合域是HGF或其功能性亞結構域。肝細胞生長因子(HGF)通過在結合原癌基因c-Met受體后激活酪氨酸激酶信號級聯放大來調節細胞生長、細胞運動性和形態發生。HGF影響多種細胞類型并調節各種生物活性，包括細胞因子的產生、細胞遷移、增殖和存活。HGF以單個無活性多肽的形式分泌， 被絲氨酸蛋白酶切割為69kDa的α鏈和34kDa的β鏈。α和β鏈之間的二硫鍵結合產生活性異型二聚體分子。HGF基因的可變剪接產生5種不同的同種型(同種型1-5 ；分別為 Genebank 登錄號 ΝΡ_000592. 3、ΝΡ_001010931. 1、ΝΡ_001010932. 1、ΝΡ_001010933. 1 和 ΝΡ_001010934. 1 ； SEQ ID NO :18-22 ；這些序列中各自的氨基酸1-31是信號肽)。HGF被認為是預防和弱化疾病發展的關鍵因子(Ito等Q008) Int. Arch. Allergy Immunol. 146 Suppl 1:82-87)。例如，已顯示HGF在小鼠中有效抑制膠原誘導的關節炎 (Okunishi等Q007)Jnl. Immunol. 179 :5504-5513)，在變應性氣道炎癥的小鼠模型中發揮保護作用(Okunishi 等 Q005)Jnl. Immunol. 175 :4745-4753 ；Ito 等 Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. (2005)32 :268-280) 在一些實施方式中，本發明的結合域包含如本文所述具有HGF特異性的\和Vh結構域。在某些實施方式中，所述\和Vh結構域是人的結構域。\和Vh結構域可以任何取向排列，并可由本文所述的至多約30個氨基酸的接頭或能夠提供與兩個亞結合域相互作用相容的間隔物功能的任何其它氨基酸序列分隔開。在某些實施方式中，連接\和Vh結構域的接頭包含SEQ ID NO :43-166、244、307、320、355-379和383-398中一個或多個所示的氨基酸序列，如SEQ ID NO :244中提供的接頭、接頭46 (SEQ ID NO :88)、接頭130 (SEQ ID NO 163)或接頭131 (SEQ ID NO :164)。多特異性結合域可具有至少2個特異性亞結合域， 其類似于駝類抗體組成；或具有至少4個特異性亞結合域，其類似于成對\和Vh鏈的更常規哺乳動物抗體組成。在其它實施方式中，本發明的HGF特異性結合域可包含一個或多個互補決定區(“OTR")，或者多個拷貝的一種或多種這類⑶R，這類⑶R由抗HGF的scFv 或Fab片段可變區或其重鏈或輕鏈可變區獲得、衍生或設計出。因此，本發明的結合域可包含來自抗HGF可變區的單個CDR，或其可包含多個相同或不同的CDR。在某些實施方式中， 本發明的結合域包含具有HGF特異性的\和Vh結構域，其包含框架區以及⑶R1、⑶R2和 CDR3 區。IL35如上所述，在某些實施方式中，本發明提供含有作為IL35激動劑(即可提高IL35 信號傳導)的結合區或結合域的多肽。在某些實施方式中，所述IL35激動劑結合域是 IL35(例如，SEQ ID NO 25禾口 26)或其功能性亞結構域。在某些實施方式中，所述IL35激動劑結合域是包含SEQ ID NO :25和沈序列的單鏈多肽或其亞結構域。這樣的單鏈多肽可包含一個或多個接頭，包括本文所述的接頭。在其它實施方式中，所述IL35激動劑結合域是具有IL35激動劑活性的IL35R特異性的單鏈免疫球蛋白可變結構域，如scFv。IL-35是IL-12細胞因子亞家族的新近描述的細胞因子。異型二聚體分子由 IL-12p35和IL-27Ebi3亞基組成。近期已顯示其在關節炎小鼠模型中為Treg功能的強效誘導物，且能夠改變 TH17 應答(Niedbala 等 Q007)Eur. J. Immunol. 37 :3021 ；Collison 等 (2007)Nature 450 :566)。因此，預測IL-35激動作用和CD86抑制作用的結合可增加單獨的⑶觀抑制作用的治療益處。調節T細胞(TREGQ是CD4+T細胞的關鍵亞群，其對保持自身耐受和預防自身免疫、限制慢性炎性疾病如哮喘和炎性腸病、調節穩態淋巴細胞擴增具有重要作用。IL35是抗炎細胞因子，已顯示其通過刺激調節T細胞擴增和抑制Thl7細胞發育來抑制免疫應答 (Collison 等(2007)Nature450 :566-9)。IL35 是由 EB 病毒誘導基因 3(EBI3 ；SEQ ID NO 25 ；信號肽氨基酸1-20)和IL12的p35亞基(SEQ ID NO 26 ；信號肽氨基酸1_56)形成的異型二聚體(Devergne 等(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 :12041-12046 ；美國專利 5，830，451 ；美國專利申請公開號US 2007/0299026) 0已顯示其在鼠膠原誘導關節炎模型中具有與 Enbre 1 等效的治療作用(Niedbala 等(2007)Eur. J. Immunol. 37 :3021-3029)， 因此已提出將其作為對臨床類風濕性關節炎的治療劑。在一些實施方式中，本發明的結合域包含如本文所述具有IL35R特異性的\和Vh 結構域。在某些實施方式中，所述\和￥11結構域是人的結構域。\和￥11結構域可以任何取向排列，并可由本文所述的至多約30個氨基酸的接頭或能夠提供與兩個亞結合域相互作用相容的間隔物功能的任何其它氨基酸序列分隔開。在某些實施方式中，連接\和Vh結構域的接頭包含SEQ ID NO :43-166、244、307、320、355-379和383-398中一個或多個所示的氨基酸序列，如SEQ ID NO :244中提供的接頭、接頭46 (SEQ ID NO 88)、接頭130 (SEQ ID NO 163)或接頭131 (SEQ ID NO :164)。多特異性結合域可具有至少2個特異性亞結合域， 其類似于駝類抗體組成；或具有至少4個特異性亞結合域，其類似于成對\和Vh鏈的更常規哺乳動物抗體組成。在其它實施方式中，本發明的IL35R特異性結合域可包含一個或多個互補決定區(“OTR")，或者多個拷貝的一種或多種這類⑶R，這類⑶R由抗IL35R的 scFv或Fab片段可變區或其重鏈或輕鏈可變區獲得、衍生或設計出。因此，本發明的結合域可包含來自抗IL35R可變區的單個CDR，或其可包含多個相同或不同的CDR。在某些實施方式中，本發明的結合域包含具有IL-35R特異性的\和乂11結構域，其包含框架區以及⑶R1、 CDR2 和 CDR3 區。LIGHT如上所述，在某些實施方式中，本發明提供含有作為LIGHT拮抗物(即可抑制 LIGHT信號傳導)的結合區或結合域的多肽。在一些實施方式中，所述LIGHT拮抗物結合域是HVEM胞外域(也稱為sHVEM ；SEQ ID NO 29 ；信號肽氨基酸1-38)或其功能性亞結構域。在其它實施方式中，所述LIGHT拮抗物結合域是LIGHT特異性單鏈免疫球蛋白樣可變結構域，如scFv。在某些實施方式中，所述LIGHT拮抗物結構域是包含PCT專利申請公開號 WO 08/027338所述Vh和\結構域的單鏈免疫球蛋白樣可變結構域。LIGHT是表達于活化T淋巴細胞、單核細胞、粒細胞和未成熟樹突細胞的TNF 超家族成員。已報道了 LIGHT的兩種不同的同種型(Genekmk登錄號NP_003798. 2和 NP_742011. 1)。已顯示LIGHT通過皰疹病毒進入介導物(HVEM)和淋巴毒素β受體(LT β R) 信號傳導調節T細胞免疫應答。HVEM和LT β R均與LIGHT發生高親和力結合，其中在T細胞、B細胞、天然殺傷細胞和內皮細胞檢測到HVEM表達，LT β R在單核細胞和基質細胞但非T 細胞和B細胞中表達。已顯示LIGHT是⑶觀依賴性T細胞激活作用的共刺激分子，其優先誘導IFN-γ和GM-CSF的產生。在鼠模型中通過體內給予LT β R-Ig融合蛋白或抗LIGHT抗體阻斷LIGHT導致T細胞介導的免疫應答降低，改善移植物抗宿主疾病(Tamada等Q000)Nat. Med. 6 :283-9)。LIGHT的組成性表達導致組織破壞和自身免疫樣疾病綜合征(Granger 禾口 Rickert(2003)Cytokine Growth Factor Rev. 14:289—96)。在一些實施方式中，本發明的結合域包含如本文所述具有LIGHT特異性的\和Vh 結構域。在某些實施方式中，所述\和￥11結構域是人的結構域。\和￥11結構域可以任何取向排列，并可由本文所述的至多約30個氨基酸的接頭或能夠提供與兩個亞結合域相互作用相容的間隔物功能的任何其它氨基酸序列分隔開。在某些實施方式中，連接\和Vh結構域的接頭包含SEQ ID NO :43-166、244、307、320、355-379和383-398中一個或多個所示的氨基酸序列，如SEQ ID NO :244中提供的接頭、接頭46 (SEQ ID NO 88)、接頭130 (SEQ ID NO 163)或接頭131 (SEQ ID NO :164)。多特異性結合域可具有至少2個特異性亞結合域， 其類似于駝類抗體組成；或具有至少4個特異性亞結合域，其類似于成對\和Vh鏈的更常規哺乳動物抗體組成。在其它實施方式中，本發明的LIGHT特異性結合域可包含一個或多個互補決定區 (“CDR")，或者多個拷貝的一種或多種這類⑶R，這類⑶R由抗LIGHT的scFv或Fab片段可變區或其重鏈或輕鏈可變區獲得、衍生或設計出。因此，本發明的結合域可包含來自抗 LIGHT可變區的單個CDR，或其可包含多個相同或不同的CDR。在某些實施方式中，本發明的結合域包含LIGHT特異性\和Vh結構域，其包含框架區以及⑶R1、⑶R2和⑶R3區。PD-I如上所述，在某些實施方式中，本發明提供含有作為PD-I激動劑(即可提高PD-I 信號轉導)的結合區或結合域的多肽。在一些實施方式中，所述PD-I激動劑結合域是 PDl-Ll (例如，SEQ ID NO 32 ；信號肽氨基酸 1-18)、PD1_L2 (例如，SEQ ID NO 33 ；信號肽: 氨基酸1-19)或其功能性亞結構域。在其它實施方式中，所述PD-I激動劑結合域是PD-I 特異性單鏈免疫球蛋白樣可變結構域，如scFv。PD-I特異性抗體包括例如，美國專利申請公開號US 2006/0210567所述的抗體。PD-I (Genebank登錄號NP_005009. 1)是表達于活化T細胞、B細胞和髓樣細胞的⑶^/CTLA4家族成員。PD-I包含免疫受體基于酪氨酸的抑制基序。PD-I通過與程序性死亡1配體KPDl-Ll ；也稱為⑶274)和程序性死亡1配體2(PD1_L2)結合發揮作用。 人的PD-Ll和PD-L2同時表達于未成熟和成熟的樹突細胞、IFN-Y處理的單核細胞和濾泡性樹突細胞上。PD-I缺陷小鼠顯示各種自身免疫病理學，表明PD-I是免疫應答的負調節物(Nishimura 禾口 Honjo (2001) Trends Immunol. 2 :265 ；Nishimura 等(1999) Immunity 11 141)。已顯示PD-I與PDl-Ll和PD1-L2的結合引起T細胞激活作用下調(Freeman等 (2000) J. Exp. Med. 192 :1027 ；Latchman 等(2001) Nat. Immunol. 2 :261 ；Carter 等(2002) Eur. J. Immunol. 32 :634)。在一些實施方式中，本發明的結合域包含如本文所述具有PD-I特異性的八和Vh 結構域。在某些實施方式中，所述\和￥11結構域是人的結構域。\和￥11結構域可以任何取向排列，并可由本文所述的至多約30個氨基酸的接頭或能夠提供與兩個亞結合域相互作用相容的間隔物功能的任何其它氨基酸序列分隔開。在某些實施方式中，連接\和Vh結構域的接頭包含SEQ ID NO :43-166、244、307、320、355-379和383-398中所示的氨基酸序列，如 SEQ ID NO :244 中提供的接頭、接頭 46 (SEQ ID NO :88)、接頭 130 (SEQ ID NO :163) 或接頭131 (SEQ ID NO :164)。多特異性結合域可具有至少2個特異性亞結合域，其類似于駝類抗體組成；或具有至少4個特異性亞結合域，其類似于成對\和Vh鏈的更常規哺乳動物抗體組成。在其它實施方式中，本發明的PD-I特異性結合域可包含一個或多個互補決定區 (“CDR")，或者多個拷貝的一種或多種這類⑶R，這類⑶R由抗PD-I的scFv或Fab片段可變區或其重鏈或輕鏈可變區獲得、衍生或設計出。因此，本發明的結合域可包含來自抗 PD-I可變區的單個⑶R，或其可包含多個相同或不同的⑶R。BTLA如上所述，在某些實施方式中，本發明提供含有作為BTLA激動劑(即可提高BTLA 信號傳導)的結合區或結合域的多肽。在一些實施方式中，所述BTLA激動劑結合域是HVEM 胞外域(也稱為sHVEM ；SEQ ID NO 29 ；信號肽氨基酸1-38)或其功能性亞結構域(例如 SEQ ID而四的氨基酸討-78)。在其它實施方式中，所述BTLA激動劑結合域是BTLA特異性單鏈免疫球蛋白樣可變結構域，如scFv。BTLA特異性激動劑抗體見例如Krieg等Q005) J. Immunol. 175 :6420-6472 所述。BTLA (Genebank 登錄號 ΝΡ_001078826. 1 和 NP_861445. 3 ；分別為同種型 2 和 1)是作為免疫球蛋白家族成員的細胞表面蛋白，表達于B細胞、T細胞和抗炎呈遞細胞。BTLA的配體是皰疹病毒進入介導物(HVEM)，其為腫瘤壞死因子受體家族的成員并作為LIGHT的配體(Sedy 等(2005) Nat. Immunol. 6 :90-98)。已在 HVEM 的 CRDl 中鑒定出 BTLA 結合位點(SEQ ID NO 29的氨基酸54-78 ；PCT專利申請公開號WO 2006/063067).該位點不同于LIGHT 所用的位點但與HVEM的gD結合位點重疊。盡管HVEM與LIGHT結合誘導強免疫應答，但 HVEM與BTLA結合產生對T細胞應答的負調節作用(Murphy等Q006)Nat. Rev. Immunol. 6 671-681)。已顯示BTLA與HVEM結合激活BTLA的酪氨酸磷酸化，由此誘導與蛋白質酪氨酸磷酸酶 SHP-I 和 SHP-2 結合(Gavrieli 等(2003)Biochem. Biophys. Res. Commun. 312 1236)，但一些數據對SHP募集是否負責BTLA的負調節活性存在疑問(Chemnitz等Q006) J.Immunol. 176 :6603-6614)。已顯示可溶性HVEM抑制抗⑶3誘導的⑶4+T細胞增殖，該作用被抗BTLA抗體逆轉(Gonzalez 等 Q005)Proc. Natl. Acad. ki. USA102 :1116-1121)。類似地，顯示激動性抗BTLA單克隆抗體抑制抗⑶3介導的⑶4+T細胞增殖和細胞因子產生(Krieg等Q005) J. Immunol. 175 :6420-6472)。缺乏完整BTLA基因的小鼠顯示對實驗性自身免疫腦脊髓炎的敏感性升高(Watanabe等O00;3)Nat. Immunol. 4 :670-679)和氣道炎癥延長(D印pong等 (2006) J. Immunol. 176 :3909-3913)。在一些實施方式中，本發明的結合域包含如本文所述具有BTLA特異性的\和Vh 結構域。在某些實施方式中，所述\和￥11結構域是人的結構域。\和￥11結構域可以任何取向排列，并可由本文所述的至多約30個氨基酸的接頭或能夠提供與兩個亞結合域相互作用相容的間隔物功能的任何其它氨基酸序列分隔開。在某些實施方式中，連接\和Vh結構域的接頭包含SEQ ID NO :43-166、244、307、320、355-379和383-398中所示的氨基酸序列，如 SEQ ID NO :244 中提供的接頭、接頭 46 (SEQ ID NO :88)、接頭 130 (SEQ ID NO :163) 或接頭131 (SEQ ID NO :164)。多特異性結合域可具有至少2個特異性亞結合域，其類似于駝類抗體組成；或具有至少4個特異性亞結合域，其類似于成對\和Vh鏈的更常規哺乳動物抗體組成。
在其它實施方式中，本發明的BTLA特異性結合域可包含一個或多個互補決定區 (“CDR")，或者多個拷貝的一種或多種這類⑶R，這類⑶R由抗BTLA的scFv或Fab片段可變區或其重鏈或輕鏈可變區獲得、衍生或設計出。因此，本發明的結合域可包含來自抗 BTLA可變區的單個⑶R，或其可包含多個相同或不同的⑶R。GITRL如上所述，在某些實施方式中，本發明提供含有作為GITRL拮抗物(即可抑制 GITRL信號傳導)的結合區或結合域的多肽。在一些實施方式中，所述GITRL拮抗物結合域是GITR胞外域(也稱為sGITR ；SEQ ID NO 39和40 ；這些序列各自的信號肽氨基酸 1-25)或其功能性亞結構域。在其它實施方式中，所述GITRL拮抗物結合域是GITRL特異性單鏈免疫球蛋白樣可變結構域，如scFv。GITRL的拮抗物抗體見例如美國專利申請公開號 2005/0014224 所述。糖皮質激素誘導的腫瘤壞死因子受體(GITR;也稱為AITR)是I型跨膜蛋白和 TNF 受體超家族的成員(Nocentini 等，(2007) Eur. J. Immunol. 37 :1165-69)。GITR 在 T 細胞增殖和TCR介導的凋亡中發揮重要作用。GITR表達在T細胞上上調，高水平的GITR在 CD4+CD25+調節T細胞上組成性表達(Kwon等Q003) Exp. Mol. Med. 35 :8_16)，表達也發生在巨噬細胞、B 細胞和 NK 細胞上(Liu 等(2008) J. Biol. Chem. 283 :8202-8210)。GITR 的關聯配體GITRL在抗原呈遞細胞如樹突細胞和B細胞上組成性表達。已顯示GITR與GITRL的結合使⑶4+⑶25_效應物T細胞對⑶4+CD25+調節T細胞的抑制作用具有耐受性。已顯示通過GITRL或激動劑抗體激活GITR增加TCR誘導的T細胞增殖和細胞因子產生，并拯救T 細胞免于發生抗 CD3 誘導的凋亡(Nocentini et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA94 6216-6221)。此外，GITR與GITRL結合可抑制T調節細胞和/或使效應物T細胞對T調節細胞介導的抑制作用的耐受性增大(Kanamaru等Q004) J. Immunol. 172 :7306-7314)。研究表明，在實驗性自身免疫腦脊髓炎的誘導期給予抗GITR顯著增強臨床疾病的嚴重程度并增加CNS炎癥和自身反應T細胞應答(Kohm et al. (2004) J. Immunol. 172 4686-4690)。此外，激活GITR信號傳導加劇鼠哮喘和膠原誘導的關節炎(Patel等Q005) Eur. J. , Immunol. 35 :3581-90)。在一些實施方式中，本發明的結合域包含如本文所述具有GITRL特異性的\和Vh 結構域。在某些實施方式中，所述\和￥11結構域是人的結構域。\和￥11結構域可以任何取向排列，并可由本文所述的至多約30個氨基酸的接頭或能夠提供與兩個亞結合域相互作用相容的間隔物功能的任何其它氨基酸序列分隔開。在某些實施方式中，連接\和Vh結構域的接頭包含SEQ ID NO :43-166、244、307、320、355-379和383-398中所示的氨基酸序列，如 SEQ ID NO :244 中提供的接頭、接頭 46 (SEQ ID NO :88)、接頭 130 (SEQ ID NO :163) 或接頭131 (SEQ ID NO :164)。多特異性結合域可具有至少2個特異性亞結合域，其類似于駝類抗體組成；或具有至少4個特異性亞結合域，其類似于成對\和Vh鏈的更常規哺乳動物抗體組成。在其它實施方式中，本發明的GITRL特異性結合域可包含一個或多個互補決定區 (〃 OTR")，或者多個拷貝的一種或多種這類⑶R，這類⑶R由抗GITRL的scFv或Fab片段可變區或其重鏈或輕鏈可變區獲得、衍生或設計出。因此，本發明的結合域可包含來自抗 GITRL可變區的單個CDR，或其可包含多個相同或不同的CDR。在某些實施方式中，本發明的結合域包含GITRL特異性\和Vh結構域，其包含框架區以及⑶R1、⑶R2和⑶R3區。CD40 如上所述，在某些實施方式中，本發明提供含有作為CD40拮抗物(即可抑制CD40 信號傳導)的結合區或結合域的多肽。在一些實施方式中，所述CD40拮抗物結合域是CD40 特異性單鏈免疫球蛋白樣可變結構域，如scFv。CD40的拮抗物抗體見例如美國專利申請公開號 US 2008/0057070 和美國專利 5，874，082 和 6，838，261 所述。⑶40是發現于正常和腫瘤性B細胞、樹突細胞、抗炎呈遞細胞、內皮細胞、單核細胞和上皮細胞表面上的55kDa的細胞表面抗原。⑶40在抗原呈遞細胞上的表達在輔助性 T細胞和細胞毒性T淋巴細胞的作用中發揮重要的共刺激作用。⑶40配體(⑶40L，也稱為 ⑶154)在T細胞上的表達在正常免疫應答過程中上調。表達于T細胞的⑶40L與表達于B 細胞的CD40的結合引起B細胞增殖和分化、抗體產生、同種型轉換和B細胞記憶產生。已顯示人的抗CD40拮抗性抗體對人慢性淋巴細胞性白血病細胞具有抗白血病活性(Luqman 等(2008) Blood 112:711-720)。在一些實施方式中，本發明的結合域包含如例如美國專利申請公開號US 2008/0057070所述具有CD40特異性的\和Vh結構域。在某些實施方式中，所述\和Vh 結構域是人的結構域。\和Vh結構域可以任何取向排列，并可由本文所述的至多約30個氨基酸的接頭或能夠提供與兩個亞結合域相互作用相容的間隔物功能的任何其它氨基酸序列分隔開。在某些實施方式中，連接八和Vh結構域的接頭包含SEQ ID N0:43-166、244、 307,320,355-379和383-398中所示的氨基酸序列，如SEQ ID NO 244中提供的接頭、接頭 46 (SEQ ID NO :88)、接頭 130 (SEQ ID NO 163)或接頭 131(SEQ ID N0:164)。多特異性結合域可具有至少2個特異性亞結合域，其類似于駝類抗體組成；或具有至少4個特異性亞結合域，其類似于成對\和Vh鏈的更常規哺乳動物抗體組成。在其它實施方式中，本發明的CD40特異性結合域可包含一個或多個互補決定區 (〃 OTR")，或者多個拷貝的一種或多種這類⑶R，這類⑶R由抗⑶40的scFv或Fab片段可變區或其重鏈或輕鏈可變區獲得、衍生或設計出。因此，本發明的結合域可包含來自抗 ⑶40可變區的單個⑶R，或其可包含多個相同或不同的⑶R。在一些實施方式中，本發明的結合域包含如例如美國專利申請公開號US 2008/0057070所述具有CD40特異性的\和Vh 結構域，其包含框架區以及⑶Rl、⑶R2和⑶R3區。多特異性融合蛋白本發明提供包含結合⑶86的結構域(“⑶86結合域”)和結合非⑶86分子的結構域(“異源結合域”)的多特異性融合蛋白。在某些實施方式中，所述異源結合域是IL-10 激動劑、HLA-G激動劑、HGF激動劑、IL-35激動劑、PD-I激動劑、BTLA激動劑、LIGHT拮抗物、GITRL拮抗物或⑶40拮抗物。在某些實施方式中，所述異源結合域是IL-10激動劑，如IL10、ILlOFc或與ILlORl 或IL10R2特異性結合的單鏈結合域。在某些實施方式中，所述異源結合域是HLA-G激動劑， 如HLA-G1、HLA-G5、HLA-G突變蛋白或其功能區(如胞外域)、或與ILT2、ILT4或KIR2DL4 特異性結合的單鏈結合域。在某些實施方式中，所述異源結合域是HGF激動劑，如HGF或其亞結構域。在某些實施方式中，所述異源結合域是IL-35激動劑，如IL35或其亞結構域、單鏈IL-35或其亞結構域、或具有IL35R特異性和IL35激動劑活性的單鏈免疫球蛋白樣可變結構域。在某些實施方式中，所述異源結合域是LIGHT拮抗物，如HVEM胞外域或其亞結構域、或具有LIGHT特異性的單鏈免疫球蛋白樣可變結構域。在某些實施方式中，所述異源結合域是PD-I激動劑，如PD1-L1、PD1-L2或其亞結構域、或具有PD-I特異性的單鏈免疫球蛋白樣可變結構域。在某些實施方式中，所述異源結合域是BTLA激動劑，如HVEM胞外域或其亞結構域、或具有BTLA特異性的單鏈免疫球蛋白樣可變結構域。在某些實施方式中，所述異源結合域是GITRL拮抗物，如GITR胞外域或其亞結構域、或具有GITRL特異性的單鏈免疫球蛋白樣可變結構域。在某些實施方式中，所述異源結合域是CD40拮抗物，如具有CD40 特異性的單鏈免疫球蛋白樣可變結構域通常，本發明的融合蛋白利用不含前導肽(信號肽)的成熟蛋白質。因此，盡管本文提供的某些結合域蛋白序列(如本文所述的CTLA4、⑶28、!11^-61、!11^-65和其它)包括前導肽，技術人員很容易理解如何從包含信號肽的序列確定成熟蛋白質序列。在某些實施方式中，包含前導肽可能具有實用性。考慮到CD86結合域可位于融合蛋白的氨基末端，異源結合域可位于羧基末端。 在某些實施方式中，交叉受體分子如SEQ ID NO :9、13、17、24、28、31、35、42、171、173、175、 177、179、181、187、189、191、193、219、221、223、237、262、302、330、336、338、340 或 400 所示。還考慮到異源結合域可位于氨基末端，而CD86結合域可位于羧基末端。在某些實施方式中，交叉受體分子如SEQ ID NO :183、185、199、201、203、205、207、211、213、254、258、266、 276、350、352或354所示。如本文所述，本發明的結合域可與間插結構域(例如免疫球蛋白恒定區或其亞區)的任一端融合。此外，兩個或多個結合域可各自通過本文所述接頭與間插結構域連接。本文所用的“間插結構域”指一種氨基酸序列，其簡單地用作一個或多個結合域的支架以使融合蛋白主要(例如，50%或更多融合蛋白)或基本(例如，90%或更多融合蛋白)以單鏈多肽形式存在于組合物中。例如，某些間插結構域可具有結構功能(例如間隔、 柔性、剛性)或生物學功能(例如在血漿，如人血中半衰期延長)。可延長本發明融合蛋白的血漿半衰期的示例性間插結構域包括清蛋白、轉鐵蛋白、結合血清蛋白的支架結構域等， 或其片段。在某些實施方式中，本發明多特異性融合蛋白所含的間插結構域是“二聚化結構域”，其指能夠通過非共價或共價相互作用，例如通過形成氫鍵、靜電相互作用、范德華力、 二硫鍵、疏水相互作用等或其任何組合促進至少兩種單鏈多肽或蛋白質結合的氨基酸序列。示例性二聚化結構域包括免疫球蛋白重鏈恒定區或亞區。應理解，二聚化結構域可促進二聚體或更高級多聚體復合物(如三聚體、四聚體、五聚體、六聚體、七聚體、八聚體等) 的形成。本文定義的術語“恒定亞區”指對應于或衍生自來源抗體一個或多個恒定區結構域的部分或全部，但并非所有恒定區結構域的肽、多肽或蛋白質序列。在一個優選實施方式中，所述恒定亞區是IgG CH2CH3，優選IgGlCH2CH3。在一些實施方式中，本發明的融合蛋白恒定區結構域可能沒有或具有很少的抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)、補體激活和補體依賴性細胞毒性(CDC)的效應物功能，同時保持結合一些F。受體(如F。Rn結合)的能力并保持較長的體內半衰期。在某些實施方式中，本發明的結合域與人IgGl恒定區或亞區融合，其中所述IgGl恒定區或亞區中具有一個或多個以下突變氨基酸第234位的亮氨酸(L234)、第235位的亮氨酸(L235)、第237位的甘氨酸(G237)、第318位的谷氨酸(E318)、 第320位的賴氨酸(K230)、第322位的賴氨酸(K322)或其任何組合(根據Kabat編號)。 例如，可將這些氨基酸中的任何一個或多個改變為丙氨酸。在另一個實施方式中，IgGl Fc 結構域中L234、L235、G237、E318、K320和K322 (根據EU編號)各突變為丙氨酸(即分別為 L234A、L235A、G237A、E318A、K320A 和 K322A)，并任選具有 N297A 突變(即基本消除 CH2 結構域的糖基化)。本領域已知在Fc結構域內部或外部進行可改變Fc與Fc受體(⑶16、⑶32、⑶64、 ⑶89、Fc ε Rl、FcRn)或補體組分Clq相互作用的突變的方法(參見例如，美國專利號 5，624，821 ；Presta(2002)Curr. Pharma. Biotechnol. 3 237)。本發明的具體實施方式
包括含有具有來自人IgG的恒定區或亞區的免疫球蛋白或融合蛋白的組合物，其中與FcRn和蛋白A的結合被保留，且Fc結構域不再與其它Fc受體或Clq發生相互作用或與最大程度減少相互作用。例如，本發明結合域可與人IgGl恒定區或亞區融合，其中第297位的天冬酰胺(根據Kabat編號為Ν297)突變為另一種氨基酸，以減少或消除該位點的糖基化，因此消除了 Fc與Fc γ R和Clq的有效結合。另一個示例性突變是P331S，其消除了 Clq結合但不影響Fc結合。在其它實施方式中，免疫球蛋白Fc區可能相對于免疫球蛋白參比序列具有改變的糖基化模式。例如，可采用各種遺傳技術來改變構成糖基化位點的一個或多個特定氨基酸殘基(參見 Co 等(1993) Mol. Immunol. 30 1361 Jacquemon 等(2006) J. Thromb. Haemost. 4 1047 ；Schuster 等(2005) Cancer Res. 65 7934 ；Warnock 等(2005) Biotechnol. Bioeng. 92 831)，如CH2結構域的N297 (EU編號)。或者，可工程改造產生本發明融合蛋白的宿主細胞，以產生改變的糖基化模式。例如，本領域已知的一種方法提供改變的糖基化模式，采用平分的非巖藻糖基化變體形式提高ADCC。所述變體由含有寡糖修飾酶的宿主細胞表達產生。或者，考慮用BioWa/Kyowa Hakko的Potelligent技術降低本發明糖基化分子的巖藻糖含量。在一種已知方法中，提供了用于產生重組免疫球蛋白的CHO宿主細胞，其通過產生⑶P-巖藻糖改變免疫球蛋白Fc區的糖基化模式。

或者，采用化學技術改變本發明融合蛋白的糖基化模式。例如，各種糖苷酶和/或甘露糖苷酶抑制劑提供增加ADCC活性、提高Fc受體結合和改變糖基化模式中的一種或多種所需效果。在某些實施方式中，在含有濃度能提高所述宿主細胞產生的免疫糖蛋白分子的ADCC的碳水化合物調節物的培養基中培養表達本發明多特異性融合蛋白(含有與ILlO 激動劑、HLA-G激動劑、HGF激動劑、IL-35激動劑、PD-I激動劑、BTLA激動劑、LIGHT拮抗物、 GITRL拮抗物或CD40拮抗物連接的CD86拮抗物)的細胞，其中所述碳水化合物調節物的濃度小于800 μ M。在一個優選實施方式中，在含有濃度為100-800 μ Μ，如100μΜ、200μΜ、 300 μ Μ、400 μ Μ、500 μ Μ、600 μ Μ、700 μ M或800 μ M的澳粟精胺或幾夫堿，更優選澳粟精胺的培養基中培養表達這些多特異性融合蛋白的細胞。美國專利申請公開號2009/0041756 或PCT公開號WO 2008/052030中提供了用碳水化合物調節物如澳粟精胺改變糖基化的方法。在另一個實施方式中，免疫球蛋白Fc區可具有影響與效應物細胞Fc受體結合的氨基酸修飾。可采用本領域已知的任何技術，如Presta等(2001)Biochem. Soc. Trans. 30 487所公開的方法進行這些修飾。在另一種方法中，可使用Xencor XmAb 技術工程改造對應于Fc結構域的恒定亞區，以增強細胞殺傷性效應物功能(參見Lazar等(2006) Proc. Nat' 1. Acad. Sci. (USA) 103 4005)。例如，可使用這種方法產生對FC γ R的特異性和結合改進的恒定亞區，從而增強細胞殺傷性效應物功能。在 其它實施方式中，與缺少這類間插結構域的相應融合蛋白相比，恒定區或亞區可任選地增加血漿半衰期或胎盤轉移。在某些實施方式中，本發明融合蛋白在人體內的延長的血漿半衰期是至少2、至少3、至少4、至少5、至少10、至少12、至少18、至少20、至少 24、至少30、至少36、至少40、至少48小時，至少數日，至少一周，至少2周，至少數周，至少一個月，至少兩個月，至少數月，或更長時間。恒定亞區可包含任何以下結構域的部分或全部CH2結構域、Ch3結構域(IgA、IgD、 IgG、IgE或IgM)和Ch4結構域(IgE或IgM)。因此，本文定義的恒定亞區可指對應于免疫球蛋白恒定區一部分的多肽。恒定亞區可包括衍生自相同或不同的免疫球蛋白、抗體同種型或等位基因變體的C02結構域和Ch3結構域。在一些實施方式中，Ch3結構域是截短形式，其包含美國專利申請號 12/041，590(PCT/US2007/071052 的 CIP)列出的如 SEQ ID NOS :366_371 所示的的羧基末端序列。在某些實施方式中，本發明多肽的恒定亞區具有Ch2結構域和Ch3 結構域，其可任選具有氨基末端接頭、羧基末端接頭或在兩端均具有接頭。“接頭”是結合或連接其它肽或多肽的肽，如約2至150個氨基酸的接頭。在本發明的融合蛋白中，接頭可將間插結構域(例如免疫球蛋白衍生的恒定亞區)與結合域連接， 或接頭可連接結合域的兩個可變區或從異型二聚體分子形成的單鏈多肽內的兩個區域，如 EBI3(SEQ ID NO 25)和IL12(SEQ ID NO 26)或IL35的p35亞基。例如，接頭可以是由抗體絞鏈區序列獲得、產生或設計出的氨基酸序列，將結合域與受體連接的序列，或是將結合域與細胞表面跨膜區或膜錨定物連接的序列。在一些實施方式中，接頭可具有至少一個能夠在生理條件或其它標準肽條件(例如，肽純化條件、肽儲存條件)下參與至少一個二硫鍵的半胱氨酸。在某些實施方式中，對應于或類似于免疫球蛋白鉸鏈肽的接頭保留了對應于置于朝向該鉸鏈氨基末端的鉸鏈半胱氨酸的半胱氨酸。在其它實施方式中，接頭來自IgGl 或IgG2A鉸鏈，并含有對應于鉸鏈半胱氨酸的一個半胱氨酸或兩個半胱氨酸。在某些實施方式中，在間插結構域之間形成一個或多個二硫鍵，作為鏈間二硫鍵。在其它實施方式中， 本發明的融合蛋白可具有直接與結合域融合的間插結構域(即不存在接頭或鉸鏈)。在一些實施方式中，所述間插結構域是二聚化結構域，如IgGl CH2CH3 Fc部分。本發明多特異性融合蛋白的間插或二聚化結構域可通過肽接頭與一個或多個末端結合域連接。除提供間隔功能以外，接頭可在融合蛋白內以及融合蛋白和其靶點之間提供適合將融合蛋白的一個或多個結合域適當定向的柔性或剛性。此外，在給予有需要的對象如人后，接頭可在體外和體內支持全長融合蛋白的表達和純化蛋白的穩定性，且接頭在這些相同對象中優選無免疫原性或免疫原性較低。在某些實施方式中，本發明多特異性融合蛋白的間插或二聚化結構域的接頭可包含人免疫球蛋白鉸鏈的部分或全部。此外，結合域可包含Vh和\結構域，這些可變區結構域可通過接頭結合。示例性可變區結合域接頭包括屬于(GlynSer)家族的接頭，如(Gly3Ser)n(Gly4Ser) ” (Gly3Ser)1(Gly4Ser)n, (Gly3Ser)n(Gly4Ser)n 或(Gly4Ser)n，其中 η 是 1-5 的整數(參見例如，分別對應于 SEQ ID NO :64、71、88、131、132、149、163 和 164 的接頭 22、29、46、89、90、 116、130和131)。在優選實施方式中，這些基于(Gly4Ser)的接頭用于連接可變結構域，不用于將結合域(例如scFv)與間插結構域(例如IgG CH2CH3)連接。可用于將間插結構域(例如，免疫球蛋白衍生的恒定亞區)與結合域連接的示例性接頭或可連接結合域的兩個可變區的接頭見SEQ ID NO :43-166、244、307、320、355-379 和383-398所示。本發明考慮的接頭包括例如，衍生自免疫球蛋白超家族成員的任何域間區域(例如抗體絞鏈區)或II型膜蛋白家族C型凝集素的柄區域的肽。這些接頭的長度可以是約2 到約150個氨基酸、約2到約40個氨基酸、或約8到約20個氨基酸，優選約10到約60個氨基酸，更優選約10到約30個氨基酸，最優選約15到約25個氨基酸。例如，接頭1的長度為2個氨基酸，接頭116的長度為36個氨基酸(接頭1-133分別見SEQ ID NO 43-166 所示；其它示例性接頭見SEQ ID NO :244、307、320、355-379和383-398所示)。除通常的長度考慮外， 適用于本發明融合蛋白的接頭包括選自下組的抗體絞鏈區=IgG絞鏈、IgA絞鏈、IgD絞鏈、IgE絞鏈或其變體。在某些實施方式中，接頭可以是選自人IgGl、人IgG2、人IgG3、人IgG4、其片段或變體的抗體絞鏈區(上部和核心區域)。本文所用的作為“免疫球蛋白絞鏈區”的接頭指在CHl羧基端和CH2氨基端(就IgG、IgA和IgD 而言)或CH3氨基端(就IgE和IgM而言)之間發現的氨基酸。本文所用的“野生型免疫球蛋白絞鏈區”指在抗體重鏈中發現的置于CHl和CH2區之間并連接這兩個區域(就IgG、 IgA和IgD而言)或置于CH2和CH3區之間并連接這兩個區域(就IgE和IgM而言)的天然產生的氨基酸序列。在優選實施方式中，野生型免疫球蛋白絞鏈區序列是人的序列。根據結晶圖象研究，可按照功能和結構將IgG絞鏈結構域再分成以下三個區域 上部絞鏈區、核心或中部絞鏈區和下部絞鏈區(Shin等，(1992) Immunological Reviews 130 87)。示例性上部絞鏈區包括IgGl中發現的EPKSCDKTHT (SEQ ID NO 383)、IgG2 中發現的 ERKCCVE(SEQ ID NO :384)、IgG3 中發現的 ELKTPLGDTTHT(SEQ ID NO 385)或 EPKSCDTPPP (SEQ ID NO :386)、以及 IgG4 中發現的 ESKYGPP (SEQ ID NO :387)。示例性中部絞鏈區包括IgGl和IgG2中發現的CPPCP (SEQ ID NO 398)、IgG3中發現的CPRCP (SEQ ID NO 388)和 IgG4 中發現的 CPSCP (SEQ ID NO 389)。盡管 IgGl、IgG2 和 IgG4 抗體各顯示具有一個上部和中部鉸鏈，IgG3具有4個串聯鉸鏈——1個ELKTPLGDTTHTCPRCP (SEQ ID NO: 390)和 3 個 EPKSCDTPPPCPRCP(SEQ ID NO 391)。IgA和IgD抗體顯示缺少IgG-樣核心區，IgD顯示具有兩個串聯的上部絞鏈區(參見SEQ ID NO 392和393)。發現于IgAl和IgA2抗體的示例性野生型上部絞鏈區分別見 SEQ ID NO 394 和 395 所示。相反，IgE和IgM抗體包含具有鉸鏈樣性質的CH2區而非典型的絞鏈區。IgE和 1#的示例性野生型CH2上部鉸鏈樣序列分別見SEQ ID NO 396 (VCSRDFTPPT VKILQSSSDG GGHFPPTIQL LCLVSGYTPG TINITffLEDG QVMDVDLSTA STTQEGELAS TQSELTLSQK HWLSDRTYTC QVTYQGHTFE DSTKKCA)和 SEQ ID NO 397 (VIAELPPKVS VFVPPRDGFF GNPRKSKLIC QATGFSPRQI QVSffLREGKQ VGSGVTTDQV QAEAKESGPT TYKVTSTLTI KESDffLGQSM FTCRVDHRGL TFQQNAS SMC VP)所示。“改變的野生型免疫球蛋白絞鏈區”或“改變的免疫球蛋白絞鏈區”指(a)含有最多30 %氨基酸改變(例如，最多25 %、20 %、15 %、10 %或5 %氨基酸取代或缺失)的野生型免疫球蛋白絞鏈區，(b)長度為至少10個氨基酸(例如，至少12、13、14或15個氨基酸)、含有最多30 %氨基酸改變(例如，最多25 %、20 %、15 %、10 %或5 %氨基酸取代或缺失)的野生型免疫球蛋白絞鏈區的一部分，或(c)包含核心絞鏈區的野生型免疫球蛋白絞鏈區的一部分(該部分長度可以是4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個氨基酸，或至少4、5、6、 7、8、9、10、11、12、13、14或15個氨基酸)。在某些實施方式中，野生型免疫球蛋白絞鏈區中的一個或多個半胱氨酸殘基可被一個或多個其它氨基酸殘基(例如，一個或多個絲氨酸殘基)所取代。或者或此外，改變的免疫球蛋白絞鏈區可使野生型免疫球蛋白絞鏈區的脯氨酸殘基被另一個氨基酸殘基(例如絲氨酸殘基)取代。 可用作連接區的替代性鉸鏈和接頭序列可從連接IgV-樣或IgC-樣結構域的細胞表面受體各部分制備。當細胞表面受體含有多個串聯的IgV-樣結構域時在IgV-樣結構域之間，以及當細胞表面受體含有多個串聯的IgC-樣區域時在IgC-樣結構域之間的區域也可用作連接區或接頭肽。在某些實施方式中，鉸鏈和接頭序列的長度是5-60個氨基酸， 可能基本呈柔性，但也可能提供更剛性的特征，并可主要含有α-螺旋結構而β-片層結構很少。優選地，序列是在血漿和血清中具有穩定性，并能耐受蛋白水解切割。在一些實施方式中，序列可含有能形成一個或多個二硫鍵以穩定該分子C末端的天然產生的或添加的基序，如CPPC(SEQ ID N0:422)。在其它實施方式中，序列可含有一個或多個糖基化位點。鉸鏈和接頭序列的例子包括 CD2、CD4、CD22、CD33、CD48、CD58、CD66、CD80、CD86、CD96、CD150、 ⑶166和⑶244的IgV樣和IgC樣結構域之間或IgC樣或IgV樣結構域之間的結構域間區域。替代性鉸鏈也可從非免疫球蛋白超家族成員的II型受體如⑶69、⑶72和⑶161含二硫鍵的區域制備。在某些實施方式中，本發明的接頭包含蝎接頭。蝎接頭包括衍生自免疫球蛋白超家族成員結構域間區域的肽，例如，衍生自免疫球蛋白鉸鏈區如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA 和IgE鉸鏈區的鉸鏈樣肽。在某些實施方式中，鉸鏈樣蝎接頭保留至少一個能夠在生理條件下形成鏈間二硫鍵的半胱氨酸。衍生自IgGl的蝎接頭可具有1個半胱氨酸或2個半胱氨酸，并可保留對應于野生型IgGl的N末端鉸鏈半胱氨酸的半胱氨酸。也考慮將非鉸鏈樣肽作為蝎接頭，條件是這樣的肽提供足夠的間隔和柔性以提供能夠形成兩個結合域的單鏈蛋白質，所述各結合域相對于位置更為接近中心的恒定亞區結構域位置朝向各蛋白質末端 (N和C)。示例性非鉸鏈樣蝎接頭包括來自II型膜蛋白的C型凝集素柄區域的柄區域，如 ⑶69、⑶72、⑶94、NKG2A和NKG2D的柄區域。在一些實施方式中，蝎接頭包含選自SEQ ID NO 355-359 和 365 的序列。在一些實施方式中，接頭具有一個用于形成鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基。在其它實施方式中，接頭具有兩個用于形成鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基。在其它實施方式中，接頭衍生自免疫球蛋白結構域間區域(例如抗體絞鏈區)或II型C型凝集素柄區域(衍生自II 型膜蛋白；參見例如，PCT申請公開號W02007/146968所示的示例性凝集素柄區序列，如該公開文件的 SEQ ID NO :111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、149、 151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、231、233、235、237、239、241、243、245、247、 249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、287、289、 297、305、307、309-311、313-331、346、373-377、380 或 381，這些序列通過引用納入本文)。在一個方面，包含本文所述⑶86結合域的示例性多特異性融合蛋白還包含至少一個具有非CD86靶點特異性的額外結合區或結合域(“異源結合域”)。例如，本發明的多特異性融合蛋白具有通過間插結構域與作為IL-IO激動劑、HLA-G激動劑、HGF激動劑、IL-35 激動劑、PD-I激動劑、BTLA激動劑、LIGHT拮抗物、GITRL拮抗物或⑶40拮抗物的結合域連接的CD86結合域。在某些實施方式中，多特異性融合蛋白包含第一和第二結合域、第一和第二接頭以及間插結構域，其中間插結構域的一端通過第一接頭與作為CD86結合域(例如，CTLA4胞外域、⑶28胞外域、抗⑶86)的第一結合域融合，另一端通過第二接頭與作為 IL-10激動劑、HLA-G激動劑、HGF激動劑、IL-35激動劑、PD-I激動劑、BTLA激動劑、LIGHT 拮抗物、GITRL拮抗物或CD40拮抗物的不同結合域融合在某些實施方式中，本發明多特異性融合蛋白的第一接頭和第二接頭各自獨立地選自例如，如 SEQ ID NO :43-166 所提供的接頭 1-133 或 SEQ ID NO :244、307、320、355_379 和383-398所提供的接頭。例如，所述第一或第二接頭可以是接頭47、58、126-131 (分別為 SEQ ID NO :89、100 和 159-164)，或 SEQ ID NO :244 或 355-379 所示接頭，或其任何組合。 在其它實施例中，一個接頭是接頭47 (SEQ ID NO 89)或接頭132(SEQ ID N0:165)，另一個接頭是SEQ ID NO :355所示接頭或接頭127 (SEQ ID NO 160)；或一個接頭是接頭58 (SEQ ID NO 100)或接頭 133 (SEQ ID NO 166)，另一個接頭是接頭 126 (SEQ ID NO 159)；或一個接頭是接頭58 (SEQ ID NO: 100)或接頭133 (SEQ ID NO 166)，另一個接頭是接頭127 (SEQ ID NO: 160)；或一個接頭是接頭 58 (SEQ ID NO: 100)或接頭 133 (SEQ ID NO: 166)，另一個接頭是接頭128 (SEQ ID NO: 161)；或一個接頭是接頭58 (SEQ ID NO 100)或接頭133 (SEQ ID NO: 166)，另一個接頭是接頭129 (SEQ ID NO: 162)。在其它實施例中，包含如CD86特異性的結構域的本發明結合域在V1^nt結構域之間可具有額外(第三)接頭，如SEQ ID N0:244、SEQ ID NO :89 所示接頭，接頭 46 (SEQ ID NO :88)、接頭 130 (SEQ ID NO: 163) 或接頭131 (SEQ ID NO 164)。在這些實施方式的任何一個中，所述接頭可在任一端(例如， 接頭130在(G4S)核心序列的氨基端上具有絲氨酸)或兩端(例如，接頭120在(G4S)核心序列的一端具有2個氨基酸(天冬酰胺-酪氨酸)，在另一端具有3個氨基酸(甘氨酸-天冬酰胺_絲氨酸))內部側接1-5個額外氨基酸(例如，接頭131具有(G4S)核心序列內部的丙氨酸)，這可能完全是形成這樣的重組分子的結果(例如，采用特定限制性酶位點以連接核酸分子可導致插入一個到若干個氨基酸)，就本發明的目的而言，其可視作任何特定接頭核心序列的一部分。在其它實施方式中，本發明多特異性融合蛋白的間插結構域由免疫球蛋白恒定區或亞區組成，其中所述間插結構域位于CD86結合域和作為IL-10激動劑、HLA-G激動劑、HGF 激動劑、IL-35激動劑、PD-I激動劑、BTLA激動劑、LIGHT拮抗物、GITRL拮抗物或⑶40拮抗物的結合域之間。在某些實施方式中，本發明多特異性融合蛋白的間插結構域具有位于氨基末端的CD86結合域和位于羧基末端的作為IL-10激動劑、HLA-G激動劑、HGF激動劑、 IL-35激動劑、PD-I激動劑、BTLA激動劑、LIGHT拮抗物、GITRL拮抗物或CD40拮抗物的結合域。在其它實施方式中，本發明多特異性融合蛋白的間插結構域具有位于氨基末端的作為 IL-10激動劑、HLA-G激動劑、HGF激動劑、IL-35激動劑、PD-I激動劑、BTLA激動劑、LIGHT 拮抗物、GITRL拮抗物或CD40拮抗物的結合域和位于羧基末端的CD86結合域。在其它實施方式中，免疫球蛋白恒定區或亞區包含免疫球蛋白Gl (IgGl)的CH2和 CH3結構域。在相關實施方式中，所述IgGl CH2和CH3結構域具有一個或多個以下突變氨基酸(即在該位置具有不同的氨基酸)第234位的亮氨酸(L234)、第235位的亮氨酸(L235)、第237位的甘氨酸(G237)、第318位的谷氨酸(E318)、第320位的賴氨酸(K230)、 第322位的賴氨酸(K322)或其任何組合(根據Kabat編號)。例如，可將這些氨基酸中的任何一個改變為丙氨酸。在其它實施方式中，根據Kabat編號，CH2結構域中的L234、L235 和G237各突變為丙氨酸(即分別為L234A、L235A和G237A)，IgGl CH3結構域中的E318、 K320和K322各突變為丙氨酸(即分別為E318A、K320A和K322A)。在某些實施方式中，本發明的多特異性融合蛋白可包含“小模塊式免疫藥物” (SMIP )。在該方面，術語SMIP 指相對單克隆和重組抗體具有增強藥物性質的高模塊化化合物類別。SMIP包含具有靶點特異性結合域的單個多肽鏈，其基于例如抗體可變結構域，與允許特異性募集所需類別效應物細胞(如巨噬細胞和天然殺傷(NK)細胞)和/或募集補體介導的殺傷作用的可變FC區結合。根據選擇的靶點和鉸鏈區，SMIP可通過細胞表面受體進行信號傳導或阻斷信號傳導。本文所用的稱為“小模塊式免疫藥物”或“SMIP 產物”的工程改造融合蛋白見美國專利公開號2003/133939、2003/0118592和2005/0136049， 以及國際專利公開 W002/056910、W02005/037989 和 W02005/017148 所述。 在一些實施方式中，多特異性融合蛋白可包含PIMS分子，如美國專利公開號 2009/0148447和國際專利公開W02009/023386所述分子。在某些實施方式中，可將本發明的多特異性融合蛋白工程改造為具有不同的前端和后端親和力以靶向特定細胞類型。例如，可采用對CD86的親和力高于工程改造ILlO激動劑(例如，具有I87A或I87S突變，或為單ILlO結構)對huILlORl親和力的抗CD86結合域(例如，3D1、FUNl或其人源化變體)，并在本發明的交叉受體分子中組合這樣的分子， 以有利于靶向感興趣的特定細胞類型，如抗原呈遞細胞(APC)。在該方面，根據靶向的所需細胞類型，可制備對CD86具有較高或較低親和力，或對本文所述任何異源靶點蛋白質具有較高或較低親和力的融合蛋白。在優選實施方式中，CD86拮抗物結合域通過大于異源結合域對其結合伙伴親和力的CD86親和力優先將多靶點特異性交叉受體分子靶向APC。在一些實施方式中，本發明的多特異性融合蛋白具有包含CTLA4胞外結構域或亞結構域、CD28胞外結構域或亞結構域、或CD86特異性抗體衍生結合域的CD86結合域。 在某些實施方式中，CD86特異性抗體衍生結合域衍生自FUNl單克隆抗體(參見例如，J Pathol. 1993Mar ； 169 (3) :309_15)，或衍生自3D1抗CD86單克隆抗體。在某些實施方式中， ⑶86結合域是SCTLA4，如SEQ ID NO :1的成熟多肽序列。在某些實施方式中，⑶86結合域是SCTLA4，如SEQ ID NO :1的序列，或CTLA4的可變樣結構域，如SEQ ID NO :3，或其亞結構域。在某些實施方式中，⑶86結合域是s⑶28，如SEQ ID NO :2的成熟多肽序列(信號肽氨基酸1-18)。在其它實施方式中，⑶86結合域包含來自FUNl (例如，SEQ ID NO 305 和306)或3D1 (例如，SEQ ID NO 318和319)的輕鏈和重鏈可變結構域，優選scFv形式。在其它實施方式中，本發明的多特異性融合蛋白具有CD86結合域和作為IL-10激動劑、HLA-G激動劑、HGF激動劑、IL-35激動劑、PD-I激動劑、BTLA激動劑、LIGHT拮抗物、 GITRL拮抗物或CD40拮抗物的異源結合域(參見例如，SEQ ID NO :7、14、15、18_22、25、26、 29、32、33、36、39和40提供的異源結合域氨基酸序列)。這樣的多特異性融合蛋白在本文稱為交叉受體分子，其示例性結構包括 N-BD1-ID-BD2-C和N-BD2-ID-BD1-C，其中N和C分別表示氨基末端和羧基末端；BDl是CD86 結合域，如免疫球蛋白樣或免疫球蛋白可變區結合域或胞外域；X是間插結構域；BD2是作為IL-IO激動劑、HLA-G激動劑、HGF激動劑、IL-35激動劑、PD-I激動劑、BTLA激動劑、LIGHT 拮抗物、GITRL拮抗物或⑶40拮抗物的結合域。在一些構建體中，X可以包含置于第一和第二結合域之間的免疫球蛋白恒定區或亞區。在一些實施方式中，本發明的多特異性融合蛋白具有的間插結構域⑴從氨基末端到羧基末端包含以下結構-Ll-X-L2-，其中Ll和L2 各自獨立地是含有2到約150個氨基酸的接頭；X是免疫球蛋白恒定區或亞區。在其它實施方式中，所述多特異性融合蛋白具有的間插結構域是清蛋白、轉鐵蛋白或其它血清蛋白結合蛋白，其中所述融合蛋白在組合物中主要或充分保持單鏈多肽的形式。 示例性交叉受體融合蛋白的氨基酸序列見SEQ ID NO :9、13、17、24、28、31、35、38、 42、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、 207、209、211、213、215、217、219、221、223、237、239、252、254、256、258、260、262、266、276、 302、330、334、336、338、340、350、352和354所示；其分別由 SEQ ID NO :8、12、16、23、27、30、 34、37、41、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、 204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、236、238、251、253、255、257、259、261、265、 275、301、329、333、335、337、339、349、351 和 353 所示多核苷酸序列編碼。在其它實施方式中，本發明的多特異性融合蛋白具有以下結構 N-BD1-X-L2-BD2-C，其中BDl是CD86結合域，如與CTLA4胞外域至少約90%相同的結合域；-X-是-L1-CH2CH3-，其中Ll是第一 IgGl鉸鏈，任選通過取代第一或第二半胱氨酸突變，且CH2CH3-是 IgGl Fc 結構域的 CH2CH3 區；L2 是選自 SEQ ID NO :43_166、244、307、320、 355-379或383-398的接頭；BD2是如本文所述作為IL-10激動劑、HLA-G激動劑、HGF激動齊[J、IL-35激動劑、PD-I激動劑、BTLA激動劑、LIGHT拮抗物、GITRL拮抗物或⑶40拮抗物的結合域。在具體實施方式
中，多特異性交叉受體融合蛋白具有(a)包含與SEQ ID NO 1或 SEQ ID NO :2 成熟多肽序列至少 80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或至少 100%相同的氨基酸序列的⑶86結合域，和(b)作為IL-10激動劑、HLA-G激動劑、HGF激動劑、IL-35 激動劑、PD-I激動劑、BTLA激動劑、LIGHT拮抗物、GITRL拮抗物或⑶40拮抗物的結合域， 其包含與SEQ ID NO :7、14、15、18-22、25、26、29、32、33、36、39和40提供的上述異源結合蛋白的相應成熟多肽序列至少80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或至少100%相同的氨基酸序列，其中從氨基末端到羧基末端，或從羧基末端到氨基末端，(i)(a)的CD86結合域或(b)的結合域與第一接頭融合，(ii)第一接頭與如SEQ ID NO 409和415-417中任何一個序列所示的免疫球蛋白重鏈恒定區CH2和CH3融合，(iii)CH2CH3恒定區多肽與第二接頭融合，和(iv)第二接頭與(a)的CD86結合域或(b)的結合域融合。在某些實施方式中，所述第一接頭是接頭47 (SEQ ID NO :89)、接頭132 (SEQ ID NO 165)或接頭133 (SEQ ID NO 166)，所述第二接頭是接頭126-129 (SEQ ID NO 159-162)中任何一個，CD86結合域Vh 和Vl結構域之間的額外(第三)接頭是接頭130(SEQ ID NO 163)或接頭131(SEQ ID NO 164)。示例性交叉受體融合蛋白的氨基酸序列見SEQ ID NO :9、13、17、24、28、31、35、38、 42、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、 207、209、211、213、215、217、219、221、223、237、239、252、254、256、258、260、262、266、276、 302、330、334、336、338、340、350、352和354所示；其分別由 SEQ ID NO :8、12、16、23、27、30、34、37、41、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、 204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、236、238、251、253、255、257、259、261、265、 275、301、329、333、335、337、339、349、351 和 353 所示多核苷酸序列編碼。制備多特異件融合蛋白 為有效產生本文所述的任何結合域多肽或融合蛋白，采用前導肽促進所表達的多肽和融合蛋白的分泌。預期使用任何常規的前導肽(信號序列)以指導初始表達的多肽或融合蛋白進入分泌通路并引起從成熟多肽或融合蛋白上前導肽和所述多肽或融合蛋白之間的連接點處或其附近切割前導肽。根據本領域已知因素選擇特定的前導肽，例如使用易于在前導肽的編碼序列起始處或末端插入限制性內切核酸酶切割位點以便于分子工程操作的多核苷酸編碼的序列，條件是這類引入序列確定的氨基酸不會不可接受地干擾由初始表達的蛋白質進行前導肽的所需處理；或如果所述前導肽在該多肽或融合蛋白成熟過程中未被切割，則其不會不可接受地干擾多肽或融合蛋白分子的任何所需功能。本發明的示例性前導肽包括天然前導序列(即隨天然蛋白質一起表達的序列)或使用異源前導序列，如 h3n-mdfqvqifsfllisasvimsrg(x)n-co2h,其中 χ 是任何氨基酸，η 是 o-3 (seq id no :i67、 419,420 和 421)，或 H3N-MEAPAQLLFLLLLWLPDTTG_C02H(SEQ ID NO 168)。如本文所述，考慮到本文所述的結合域，如胞外域、輕鏈和重鏈可變區以及CDR的變體和衍生物。在一個實施例中，提供用一個或多個氨基酸殘基補充特定結合劑氨基酸序列的插入變體。插入可位于蛋白質的任一端或兩端，或可位于特定結合劑氨基酸序列的內部區域內。本發明的變體產物也包含成熟的特定結合劑產物，即去除前導或信號序列且所得蛋白質具有額外氨基末端殘基的特定結合劑產物。所述額外的氨基末端殘基可來自另一種蛋白質，或可包含無法鑒定為來自某具體蛋白質的一個或多個殘基。考慮到在-ι位上具有額外甲硫氨酸殘基的多肽，以及在_2和-1位上具有額外甲硫氨酸和賴氨酸殘基的本發明多肽。具有額外的Met、Met-LyS或Lys殘基(或總體具有一個或多個堿性殘基)的變體可特別用于提高細菌宿主細胞中的重組蛋白產量。本文所用的“氨基酸”指天然(天然產生)的氨基酸、取代的天然氨基酸、非天然氨基酸、取代的非天然氨基酸或其任何組合。天然氨基酸的名稱在本文中表示為標準的單字母或三字母代碼。天然極性氨基酸包括天冬酰胺(asp或n)和谷氨酰胺(Gln或Q)；以及堿性氨基酸如精氨酸(Arg或R)、賴氨酸(Lys或K)、組氨酸(His或H)及其衍生物；以及酸性氨基酸如天冬氨酸(asp或D)和谷氨酸(Glu或e)及其衍生物。天然疏水性氨基酸包括色氨酸(Trp或W)、苯丙氨酸(Phe或F)、異亮氨酸(lie或I)、亮氨酸(Leu或L)、甲硫氨酸 (Met或M)、纈氨酸(Val或V)及其衍生物；以及其它非極性氨基酸如甘氨酸(GIy或G)、丙氨酸(Ala或A)、脯氨酸(Pro或P)及其衍生物。中等極性的天然氨基酸包括絲氨酸(Ser 或S)、蘇氨酸(Thr或T)、酪氨酸(Tyr或Y)、半胱氨酸(Cys或C)及其衍生物。除非另有說明，本文所述的任何氨基酸可以是D-或L-構型。取代變體包括氨基酸序列中一個或多個氨基酸殘基被去除或用替代性殘基取代的融合蛋白。在一些實施方式中，取代具有保守性質；然而，本發明也包括非保守取代。可根據物理性質以及在蛋白質二級和三級結構中的貢獻對氨基酸進行分類。本領域將保守取代認定為用具有類似性質的另一個氨基酸取代氨基酸。示例性保守取代見以下表1所示 (參見WO 97/09433，第10頁，1997年3月13日公開)。
表1保守取代I
權利要求
1.一種多特異性融合蛋白，包含通過間插結構域與異源結合域連接的CD86結合域，其中所述異源結合域是IL-10激動劑、HLA-G激動劑、HGF激動劑、IL-35激動劑、PD-I激動劑、 BTLA激動劑、LIGHT拮抗物、GITRL拮抗物或⑶40拮抗物。
2.如權利要求1所述的多特異性融合蛋白，其特征在于，所述CD86結合域是CTLA4胞外域或CTLA4胞外域的亞結構域。
3.如權利要求1所述的多特異性融合蛋白，其特征在于，所述CD86結合域是具有CD86 特異性的Fab、scFv、結構域抗體或僅含重鏈的抗體。
4.如權利要求3所述的多特異性融合蛋白，其特征在于，所述CD86結合域包含FUNl抗 CD86抗體或其人源化變體的輕鏈和重鏈可變結構域。
5.如權利要求4所述的多特異性融合蛋白，其特征在于，所述FUm結合域包含SEQID NO 187或237的氨基酸1-258。
6.如權利要求1所述的多特異性融合蛋白，其特征在于，所述CD86結合域包含SEQID NO 1-6中任一項所列的氨基酸序列。
7.如權利要求1所述的多特異性融合蛋白，其特征在于，所述異源結合域包含SEQID NO :7、14、15、18-22、25、26、29、32、33、39 和 40 中任一項所列的氨基酸序列。
8.如權利要求1所述的多特異性融合蛋白，其特征在于，所述異源結合域包含ILlO激動劑，所述ILlO激動劑包含SEQ ID NO :7或其包含第87位點突變的變體提供的氨基酸序列。
9.如權利要求1所述的多特異性融合蛋白，其特征在于，所述異源結合域包含HLA-G激動劑，所述HLA-G激動劑包含SEQ ID NO 14或15提供的氨基酸序列。
10.如權利要求1所述的多特異性融合蛋白，其特征在于，所述異源結合域包含HGF激動劑，所述HGF激動劑包含SEQ ID NO 18-22中任一項提供的氨基酸序列。
11.如權利要求1所述的多特異性融合蛋白，其特征在于，所述異源結合域包含IL-35 激動劑，所述IL-35激動劑包含SEQ ID NO 25或沈提供的氨基酸序列。
12.如權利要求1所述的多特異性融合蛋白，其特征在于，所述異源結合域包含PD-I激動劑，所述PD-I激動劑包含SEQ ID NO :32或33提供的氨基酸序列。
13.如權利要求1所述的多特異性融合蛋白，其特征在于，所述異源結合域包含BTLA激動劑，所述BTLA激動劑包含SEQ ID NO : 提供的氨基酸序列。
14.如權利要求1所述的多特異性融合蛋白，其特征在于，所述異源結合域包含LIGHT 拮抗物，所述LIGHT拮抗物包含SEQ ID NO : 提供的氨基酸序列。
15.如權利要求1所述的多特異性融合蛋白，其特征在于，所述異源結合域包含GITRL 拮抗物，所述GITRL拮抗物包含SEQ ID NO 39或40提供的氨基酸序列。
16.如權利要求1所述的多特異性融合蛋白，其特征在于，所述間插結構域包含置于 CD86結合域和異源結合域之間的免疫球蛋白恒定區或亞區。
17.如權利要求16所述的多特異性融合蛋白，其特征在于，所述免疫球蛋白恒定區或亞區是 IgGl CH2CH3。
18.如權利要求1所述的多特異性融合蛋白，其特征在于，所述間插結構域包含置于第一和第二接頭之間的免疫球蛋白恒定區。
19.如權利要求18所述的多特異性融合蛋白，其特征在于，所述第一和第二接頭獨立地選自 SEQ ID NO :43-166、244、307、320、355-379 和 383-398 提供的接頭。
20.如權利要求18所述的多特異性融合蛋白，其特征在于，所述間插結構域包含人免疫球蛋白Fc區、清蛋白、轉鐵蛋白或結合血清蛋白的支架結構域。
21.如權利要求1所述的多特異性融合蛋白，其特征在于，所述間插結構域從氨基末端到羧基末端包含如下結構-L1-X-L2-其中Ll和L2各自獨立為包含2到約150個氨基酸的接頭；和X是免疫球蛋白恒定區或亞區、清蛋白、轉鐵蛋白或另一血清蛋白結合蛋白。
22.如權利要求21所述的多特異性融合蛋白，其特征在于，所述免疫球蛋白恒定區或亞區是 IgGl CH2CH3。
23.如權利要求21所述的多特異性融合蛋白，其特征在于，Ll是人免疫球蛋白鉸鏈區， 其經任選突變用其它氨基酸取代一個或多個半胱氨酸。
24.如權利要求21或23所述的多特異性融合蛋白，其特征在于，X是人IgGlFc結構域或它的至少一個CH結構域，其經任選突變以消除Fc YRI-III相互作用并保持Fcfoi相互作用。
25.如權利要求1所述的多特異性融合蛋白，其特征在于，所述間插結構域是二聚化結構域。
26.如權利要求1所述的多特異性融合蛋白，其特征在于，其具有以下結構N-BD1-X-L2-BD2-C其中BDl是與CTLA4胞外域至少約90%相同的⑶86結合域；-X-是-L1-CH2CH3-，其中Ll是第一 IgGl鉸鏈，其任選通過取代第一半胱氨酸而發生突變，且-CH2CH3-是IgGl Fc結構域的CH2CH3區，其經任選突變以消除Fc γ RI-III相互作用并保持Fcfoi相互作用；L2 是選自 SEQ ID NO :43-166、244、307、320、355_379 和 383-398 的接頭；和BD2是異源結合域。
27.如權利要求1所述的多特異性融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含以下任一項提供的氨基酸序列:SEQ ID NO :9、13、17、24、沘、31、35、38、42、171、173、175、177、179、 181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、 219、221、223、237、239、252、254、256、258、260、262、266、276、302、330、334、336、338、340、 350,352 和 354。
28.一種組合物，其包含以上權利要求中任一項所述的一種或多種多特異性融合蛋白， 以及藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
29.如權利要求觀所述的組合物，其特征在于，所述多特異性融合蛋白在所述組合物中以二聚體或多聚體形式存在。
30.一種多核苷酸，其編碼如權利要求1-27中任一項所述的多特異性融合蛋白。
31.如權利要求30所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸包含以下任一項提供的多核苷酸:SEQ ID NO :8、12、16、23、27、30、34、37、41、170、172、174、176、178、180、182、、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、 222、236、238、251、253、255、257、259、261、265、275、301、329、333、335、337、339、349、351和 353。
32.—種表達載體，其包含與表達控制序列操作性連接的如權利要求30或31所述的多核苷酸。
33.一種宿主細胞，其包含權利要求32所述的表達載體。
34.一種治療患與 CD86、IL-10、HLA-G, HGF、IL-35、PD-I、BTLA、LIGHT、GITRL 或 CD40 相關疾病的對象的方法，包括給予治療有效量的以上權利要求中任一項所述的多特異性融合蛋白或其組合物。
35.如權利要求34所述的方法，其特征在于，所述疾病是類風濕性關節炎、青少年類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡或實體器官移植。
全文摘要
本發明提供一種多特異性融合蛋白，其由CD86拮抗物結合域和作為IL-10激動劑、HLA-G激動劑、HGF激動劑、IL-35激動劑、PD-1激動劑、BTLA激動劑、LIGHT拮抗物、GITRL拮抗物或CD40拮抗物的另一個結合域組成。所述多特異性融合蛋白還可包含分隔其它結構域的間插結構域。本發明還提供編碼所述多特異性融合蛋白的多核苷酸、所述融合蛋白的組合物以及使用所述多特異性融合蛋白和組合物的方法。
文檔編號C07K16/28GK102227447SQ200980148182
公開日2011年10月26日 申請日期2009年10月2日 優先權日2008年10月2日
發明者J·W·布蘭肯什普, P·A·湯普森, P·R·包姆, P·丹, S·K·納塔拉加 申請人:新興產品開發西雅圖有限公司