一種腫瘤抑制多肽及用途
【專利摘要】本發明涉及生物醫藥領域，具體涉及一種高效抑制血管生成多肽及其制備方法及用途。本發明設計了具有細胞穿入性的高效的血管生成抑制劑Tumstatin-7-TAT,該抑制劑含有tumstatin活性片段氨基酸序列（185-191），在其羧基端連接具有細胞穿越性的反式激活蛋白TAT(trans-activator?protein)的第47位到第57位氨基酸殘基組成的肽段。該融合肽對人臍靜脈內皮細胞的遷移有很好的抑制作用，并對人肝癌細胞,乳腺癌細胞都有很好的抑制作用，可用于制備血管生成抑制劑，各種腫瘤相關疾病等藥物。
【專利說明】一種腫瘤抑制多肽及用途
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物醫藥領域，具體涉及一種高效抑制血管生成多肽、其制備方法及用途。
【背景技術】
[0002]研究表明腫瘤組織的最大的一個特點為具有豐富的血管生成，即從宿主引發的新的毛細管內皮細胞的形成和轉移是腫瘤生長和轉移的必備條件。新生血管一方面給腫瘤提供了其惡性增長所需的營養，另一方面給腫瘤向遠處轉移提供了途徑。如果在腫瘤形成過程中能抑制其血管內皮細胞的生成和遷移，就可以阻止腫瘤的生長和轉移。因此抑制腫瘤血管生成是腫瘤治療中日漸引起重視的一類藥物，繼血管抑素(angiostatin)和內皮抑素(endostatin)這兩種已進入美國臨床試驗的藥物之后，Tumstatin是近年來發現的一種能夠抑制新生血管生成的蛋白藥物。Tumstatin是膠原alpha3 (IV)的NCl結構域，由245個氨基酸組成，具有抑制腫瘤新生血管生成和抑制腫瘤的生長和轉移作用，這兩種抗腫瘤的特性與一種非RGD依賴性的ITGB3介導的機制密切相關。Tumstatin經由與內皮細胞膜上的整合素alpha v beta3結合而抑制FAK (focal adhesion kinase)的磷酸化而進一步抑制PI3-K/Akt/mT0R/4EBPl信號轉導通路的活化，從而抑制內皮細胞蛋白質的合成，進而抑制內皮細胞的增殖，最終抑制腫瘤新生血管生長及腫瘤的生長和轉移(Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.2003，100:4766-4771)。
[0003]最近，小鼠黑色素瘤模型的藥理實驗(J Biol Chem.2004，279 (3):2091-100)證明Tumstatin的NCl (IV) N端7個氨基酸185-191 (CNYYSNS)組成的肽也具有同樣的抗腫瘤生長的特性，其在三維結構上共同的特征是YSNS序列呈beta-轉角構象，這種構象是維持其生物活性的至關重要的條件。
[0004]組織穿入是向細胞遞送藥物的嚴重限制之一，如何有效地把藥物內化至細胞內是藥物傳輸中的一個重要課題。目前為止，發現了兩種類型的細胞穿入肽(cell-penetringpeptide), 一類是疏水性的，一類是陽離子型的(Adv Drug Deliv Rev2005, 57，529-45)。Tat是其中一種可以把核酸和蛋白質引入細胞的陽離子型肽(Nat Med2007，12，327-78 ；Trends cell Bioll998 ;8，84_7)。并且在體內外的實驗中，TAT與多肽結合后確實顯示了其可將藥物內化至細胞內的輔助作用，從而增強了目的藥物的效果(Mol Ther.2009，17(9):1509-16.)。因此，TAT序列可以作為一種載體，將抗腫瘤多肽轉運如細胞內部，最大程度的發揮抗腫瘤多肽的效果。故聯合應用細胞穿入肽和抗腫瘤多肽的研究更有意義。
【發明內容】
[0005]本發明將抑制血管生成的tumstatin活性片段氨基酸序列(185-191)(Tumstatin-7),在其羧基端 連接具有細胞穿越性的反式激活蛋白TAT (trans-activatorprotein)的第47位到第57位氨基酸殘基組成的肽段序列，構建了一種具有細胞內化作用的血管生成抑制劑Tumstatin-7-TAT。本發明多肽序列為SEQ ID No:1所示的氨基酸序列。它具有不同的理化性質，等電點由融合前的5.52變為11.40，水溶性也大大增加，從而減少有機性增溶溶媒的使用，而避免在臨床使用中引起的不良反應。
[0006]本發明還公開了所述血管生成抑制劑的制備方法，包括:
[0007](I)依據本發明所述具有抑制血管生成作用的多肽序列，按常規方法設計得到相應的基因序列；
[0008](2)將上述人工合成的基因與原核載體進行重組，轉化至大腸桿菌，乳糖誘導表達包含本發明所述具有抑制血管生成的多肽Tumstatin-7-TAT ;表達產物以胞內可溶表達形式存在；
[0009](3)收集破碎后的菌體上清，進行金屬螯合親和層析，腸激酶酶切，收集穿過液，凍干。
[0010]本發明所述的血管生成抑制劑還也可用多肽合成方法制備。
[0011]體內及體外活性藥效試驗顯示，本發明的多肽具有抑制人臍靜脈內皮細胞的遷移和抑制人肝癌細胞的功效，還具有抑制人乳腺癌細胞增殖作用及小鼠體內抗腫瘤功效。
[0012]本發明所述的血管生成抑制劑是在tumstatin活性片段氨基酸序列(185-191)的基礎上構建獲得的，與現有技術相比，本發明所述的產物在體內及體外都顯示了比原有tumstatin活性片段氨 基酸序列(185-191)更強的抑制內皮細胞遷移及抑制腫瘤生長的效果，且具有更高的穩定性，說明本發明所設計并制備的的融合多肽合理可行，可作為腫瘤的治療藥物。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0013]圖1 是 TrxA-Tumstatin-7-TAT 的 SDS-PAGE 圖(1:蛋白質分子量 Markers ;2:未誘導的工程菌；3:誘導后的工程菌；4:親和層析分離后的重組蛋白)
[0014]圖2是Tumstatin-7-TAT體外抑制內皮細胞遷移效果
[0015]圖3是Tumstatin-7-TAT體外抑制黑色素瘤細胞增殖效果
[0016]圖4是Tumstatin-7-TAT體內抑制黑色素瘤效果
【具體實施方式】
[0017]實施例1
[0018]Tumstatin-7-TAT基因的克隆及表達載體構建與表達純化
[0019]依據本發明設計血管生成抑制劑Tumstatin-7-TAT的氨基酸序列轉換成基因序列，同時在基因的上游引入腸激酶識別序列DDDDK，5’及3’端的加入的酶切位點為KpnI和Hindlll。將合成后的基因導入原核表達載體pET32a構建得到重組表達載體，并以氯化鈣轉化法轉入大腸桿菌BL21 (DE3)中，其表達的氨基酸序列如下=TrxA-HisTag-DDDDK-CNYYSNSGGY GRKKR RQRRR0將重組菌以5-10mmol/L乳糖誘導表達4小時，收獲細胞并超聲破碎，以N1-1MAC金屬螯合親和層析進行純化，得到本發明多肽，以SDS-PAGE檢測結果詳見圖1。
[0020]實施例2
[0021]體外抑制內皮細胞遷移實驗
[0022]取對數生長期的人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)以I X IO5/孔的密度接種于24孔板，以含100mL/L胎牛血清的RPMI1640培養液來培養，待細胞生長面積達90%后，改無血清的RPMI1640培養液使細胞饑餓過夜，然后用200 μ L Tip頭在孔中央對細胞做一個約1.0mm左右的劃痕，然后用無血清的RPMI1640培養液沖洗掉懸浮的細胞，然后分別與100 μ mol/L的Tumstatin-7-TAT或Tumstatin-7孵育，用無血清的RPMI1640培養液作為陰性對照組，在培養0，24，36h后置I X 105的倒置顯微鏡下拍照記錄。
[0023]結果表明，對人臍靜脈內皮(HUVEC)細胞，本發明的血管生成抑制劑Tumstatin-7-TAT具有與Tumstatin-7幾乎一樣的抑制內皮細胞遷移的效果，詳細如圖2所示。以上實驗結果表明本發明的血管生成抑制劑Tumstatin-7-TAT可以顯著抑制人臍靜脈內皮(HUVEC)細胞的遷移。
[0024]實施例3
[0025]體外抑制黑色素瘤細胞增殖實驗[0026]取對數生長期的B16F10細胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，用完全培養基配成細胞懸浮液，以每孔5000個細胞接種于96微孔板中，每孔體積100 μ I, 37°C，5%C02孵箱中培養 7-8h0 每孔加入不同濃度藥物(0.4,0.8,1.6,3.2,6.3,12.7，25.4，50.8，101.5 μ mol/L) 100 μ 1，，以1640培養基處理組為陰性對照組10 μ g/ml紫衫醇為陽性對照組(每個藥物濃度設5個復孔)100ul。37°C，5%C02條件下處理24h后，每孔加入20 μ 1，5g/L的MTT，繼續培養4h，吸凈培養基，每孔加入150 μ I DMSO溶解MTT甲瓚沉淀，振蕩使其充分溶解后，測570nm波長處的吸光度(A)值，并以630nm處為參比波長。按以下公式可計算腫瘤細胞生長抑制率:腫瘤細胞的生長抑制率(％)=[(對照孔A值-實驗孔A值)/對照孔A值]。
[0027]結果表明，對B16F10細胞，本發明的血管生成抑制劑Tumstatin_7_TAT的腫瘤細胞生長的抑制率在6.25~400 μ mol/L的濃度范圍內皆比Tumstatin-7高，比如在濃度為25 μ mol/L時，Tumstatin-7-TAT的抑制率為34.04%，而Tumstatin-7的腫瘤細胞的生長抑制率為0.25%(p〈0.001)，詳細如圖3所示。以上實驗結果表明本發明的血管生成抑制劑Tumstatin-7-TAT可以顯著抑制B16F10腫瘤細胞的生長。
[0028]實施例4
[0029]小鼠B16F10黑色素瘤模型抑瘤實驗
[0030]制備5X 106/mlB16F10細胞懸液鼠模型，以0.1ml接種于小鼠右側腋下而建立鼠源黑色素瘤移植瘤，等皮下移植瘤體積生長至100mm3左右時，將小鼠隨機分成4組Gl陰性對照組)G2紫杉醇組)(G3Tumstatin-7_TAT組)G4Tumstatin_7組)每組8只。Gl每天皮下注射生理鹽水0.1ml; G2皮下注射紫杉醇10mg/kg, 2天I次；G3皮下注射Tumstatin-7-TAT,給藥量為10mg/kg，l，3，5，7，9d時注射；G4組為皮下注射Tumstatin-7，給藥量為10mg/kg，l，3，5，7，9d時注射。用游標卡尺每隔一天測量移植瘤直徑，腫瘤體積(TUMOR VOLUME, TV)的計算公式為:TV=1/2*A*B2其中A，B分別表示長寬；以給定時間內的腫瘤抑制率來表示治療效果；腫瘤抑制率的公式為(1-T/C) X 100%。T和C分別表示治療組和對照組的腫瘤體積。結果表明，在第13天是,Tumstatin-7-TAT的腫瘤抑制率為52.10%,而Tumstatin-7的抑制率為30.77%(p〈0.05)，詳細如圖4所示。以上實驗結果表明本發明的血管生成抑制劑Tumstatin-7-TAT可以顯著抑制小鼠體內的腫瘤生長。
[0031]
【權利要求】
1.一種腫瘤抑制多肽，其具有SEQ ID No:1所示的氨基酸序列。
2.權利要求1的多肽的制備方法，包括:設計得到權利要求1多肽的對應核苷酸序列，構建羧基端含有如權利要求1的氨基酸序列所對應基因的載體，進行基因工程表達和分離純化。
3.權利要求1的多肽用于制備抑制人臍靜脈內皮細胞的遷移或抑制黑色素瘤細胞增殖的藥物的用途。
4.權利要求1的多肽用于制備治療人新生血管生成有關的腫瘤疾病的藥物的用途。
【文檔編號】C07K7/08GK103897038SQ201410147068
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年4月11日 優先權日:2014年4月11日
【發明者】勞興珍, 張冉, 李斌, 鄭珩, 林雅芝 申請人:中國藥科大學