一種抑制綠膿桿菌粘附角膜上皮的多肽的制作方法

一種抑制綠膿桿菌粘附角膜上皮的多肽的制作方法
【專利摘要】本發明涉及抑制綠膿桿菌粘附角膜上皮的多肽Pc-EP，包括有：(1)序列為SEQ?ID?NO：1的多肽；(2)與(1)中的多肽具有70％或以上同源性的多肽，該多肽的功能與(1)中的多肽功能相同或相似。本發明還涉及一種多核苷酸，所述的多核苷酸用于編碼Pc-EP多肽。本發明所篩選Pc-EP多肽對綠膿桿菌與角膜上皮細胞的相互作用都有不同程度的競爭性抑制作用，可以特異性的阻斷綠膿桿菌表面的配體與角膜上皮細胞受體的粘附，成為細菌性角膜炎治療藥物設計的新靶點，從而為其臨床治療提供新的思路。
【專利說明】一種抑制綠膿桿菌粘附角膜上皮的多肽

【技術領域】
[0001] 本發明屬于感染性眼病的生物防治【技術領域】，具體涉及一種抑制綠膿桿菌菌粘附 角膜上皮的多肽。

【背景技術】
[0002] 綠膿桿菌性角膜炎是一種常見的感染性角膜潰瘍，占細菌性角膜炎的58. 7%。綠 膿桿菌性角膜炎破壞速度極快，以大范圍的角膜潰瘍形成及基質溶解為特征，病變控制不 佳將導致角膜潰瘍穿孔甚至患眼失明，給患者帶來巨大的精神和經濟負擔。綠膿桿菌是一 種條件性致病菌，當角膜上皮遭到損害或機體免疫功能低下時，綠膿桿菌可直接侵入角膜， 引起綠膿桿菌性角膜炎。近年來，隨著角膜接觸鏡的廣泛佩戴，綠膿桿菌性角膜炎的發病率 明顯上升，在戴角膜接觸鏡引起的角膜炎中，綠膿桿菌的分離率高達60 - 70%。對于病情發 展迅速的綠膿桿菌性角膜炎來說，在發病初期進行有效的治療是至關重要的。目前的早期 治療主要依賴于抗生素，而綠膿桿菌臨床耐藥株的不斷出現，使得傳統的抗生素治療面臨 巨大的挑戰。這就迫切需要深入研究綠膿桿菌性角膜炎發病初期的分子機制，從而為尋找 綠膿桿菌性角膜炎新的治療靶點和開發更有效的防治手段提供新的思路。
[0003] 病原菌的致病過程是其與宿主相互作用的結果，而對于綠膿桿菌與宿主間相互作 用的具體機制目前并不十分清楚。已知綠膿桿菌粘附于宿主的角膜上皮細胞是綠膿桿菌 性角膜炎發生的首要步驟，這其中特異性配體-受體間的結合或非特異性的理化作用產生 的粘附都發揮著重要作用，所以阻斷這些粘附過程是防治綠膿桿菌性角膜炎的一個很好的 策略，可有效的將疾病控制在萌芽狀態。生命活動中（如分子識別、信號轉導、細胞分化及 個體發育等）起著決定性作用的往往不是那些分子量大、結構復雜的蛋白質體系，而是結 構相對簡單的小分子多肽物質。多肽由于高效性/無毒性和特異性，其作為藥物在臨床上 的應用越來越廣泛，目前國內生產的多肽類藥物已有15種，都集中在內分泌和免疫調節方 面，用于抗腫瘤或重度感染與急癥中，還未見防治細菌感染的多肽類藥物。在抗生素抗感 染治療日益棘手的背景下，多肽在抗菌方面的作用已成為目前國際上最活躍的研究領域之 一，其中關注較多的是抗菌肽。抗菌肽作用機制是多肽直接作用于病原，而多肽在保護宿主 不受病原侵染方面的研究卻比較少。若能找到病原菌粘附宿主細胞時配體一受體相互作 用結構域的替代多肽，并利用它對細胞表面的受體進行封閉，從而拮抗病原菌對宿主的粘 附；如果此多肽還可以提高宿主的免疫防御能力，那么便更能增強宿主抵抗病原菌感染的 能力。


【發明內容】

[0004] 本發明的目的是提供一種抑制綠膿桿菌粘附角膜的Pc-EP多肽，即可以更早、更 快、更強阻斷綠膿桿菌感染角膜的作用靶點，為感染性角膜病的臨床治療提供新的思路，以 彌補現有技術的不足。
[0005] 本發明利用人角膜上皮細胞對噬菌體展示的隨機12肽文庫進行三輪生物親和淘 篩，對所得的克隆大量擴增后，進行DNA的提取和序列測定，然后對所篩選的多肽進行生物 信息學分析，尋找并確定與綠膿桿菌細胞膜相關蛋白有高度同源的多肽，然后人工合成綠 膿桿菌細胞膜相關蛋白中多肽對應的氨基酸序列，經ELISA方法進一步驗證人工合成的肽 段與人角膜上皮細胞的親和力。接著利用細胞模型和器官模型研究合成肽段對綠膿桿菌與 角膜上皮細胞相互作用的影響，從而驗證多肽對感染性角膜病的防治效果。
[0006] 本發明的一個方面是提供抑制綠膿桿菌粘附角膜上皮的多肽，包括有：
[0007] (1)序列為 SEQ ID N0 :1 的多肽，
[0008] (2)分別與⑴中的多肽具有70%或以上同源性的多肽，該多肽的功能與⑴中 的多肽功能相同或相似。
[0009] 對于（2)中所述的多肽，可以是與（1)中的任一條多肽具有75 %同源性（3個氨 基酸的不同）、80%以上同源性（2個氨基酸的不同）和90%以上同源性（1個氨基酸的不 同）的多肽，該多肽的功能與⑴中的多肽功能相同或相似。
[0010] 本發明的另一個方面是提供包含序列為SEQ ID N0 :1多肽的融合多肽。所述的融 合多肽可以是通過化學結合方法、酶切方法或物理斷裂方法處理多肽片段所獲得的。例如 Pc-EP多肽與抗原載體連接形成的蛋白復合體，抗原載體可以是卵清白蛋白（0VA)或牛血 清白蛋白（BSA)。
[0011] 本發明還提供一種多核苷酸，所述的多核苷酸是編碼序列為SEQ ID N0 :1多肽的 多核苷酸核苷酸。
[0012] 所述的核苷酸為DNA或RNA，優選DNA。
[0013] 本發明還提供一種藥物組合物，包括序列為SEQ ID N0 :1的多肽中，所述的制品具 有預防綠膿桿菌粘附角膜上皮的功能。
[0014] 本發明所提供的序列為SEQ ID N0 :1的多肽可用于制備抗體。制備的抗體應用在 防治綠膿桿菌粘附角膜的藥物中，同時制備的抗體還可以應用在檢測綠膿桿菌的產品中。
[0015] 本發明所篩選的多肽對綠膿桿菌與角膜上皮細胞的相互作用有明顯的競爭性抑 制作用，可以特異性的阻斷綠膿桿菌表面的配體與角膜上皮細胞受體的粘附，成為細菌性 角膜炎治療藥物設計的新靶點，從而為其臨床治療提供新的思路。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 圖1 :本發明的多肽Pc-EP與人角膜上皮細胞親和力的ELISA檢測效果柱狀圖；
[0017] 圖2 :本發明的多肽Pc-EP對眼科常見致病細菌綠膿桿菌粘附人角膜上皮細胞的 抑制作用；
[0018] 圖3 :本發明多肽Pc-EP在小鼠模型中對綠膿桿菌粘附角膜上皮的抑制作用；
[0019] 圖4:本發明的多肽Pc-EP對綠膿桿菌引發的小鼠角膜炎發展進程的抑制作用，CK 為陰性對照組，Pc-EP為多肽處理組，LEV為陽性藥物處理組；
[0020] 圖5 :本發明的多肽Pc-EP對綠膿桿菌感染小鼠角膜3天時角膜病變的抑制作用， CK為陰性對照組，Pc-EP為多肽處理組，LEV為陽性藥物處理組；
[0021] 圖6 :本發明的多肽Pc-EP不同濃度對人角膜上皮細胞的毒性。

【具體實施方式】
[0022] 下面對本發明的多肽及其它方面的操作進行詳細描述。
[0023] -、多肽的篩選和確定
[0024] 噬菌體展示技術是將外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌體外殼蛋白結構基 因的適當位置，使外源基因隨外殼蛋白的表達而表達，同時外源蛋白隨噬菌體的重新組裝 而展示到噬菌體表面的生物技術，并且表達在噬菌體外殼上的蛋白能折疊成天然構象而具 有相應的生物學活性。這些載有外源蛋白的噬菌體可組成噬菌體肽庫，其在病原體與宿主 相互作用的研究中具有巨大的潛力。應用噬菌體多肽文庫篩選模擬配體（細胞因子等）的 多肽，篩選到的小肽可以與相應的受體結合，競爭性拮抗其配體的活性。噬菌體展示技術 是目前應用很廣泛的一種研究配體-受體相互作用的方法，利用此方法尋找已知受體的配 基，為研制用于疾病治療的生物技術新藥有著重要的理論意義和潛在的應用價值。
[0025] 實施例1 :篩選并確定抑制綠膿桿菌粘附角膜上皮的多肽
[0026] 1)將培養至單層的人角膜上皮細胞（HCEC)與KTpfu的噬菌體展示的12肽文 庫（New England Biolabs公司產品，在M13噬菌體的pill蛋白中嵌入12氨基酸長的隨機 肽）37°C孵育lhr，PBS洗去未結合的噬菌體，甘氨酸洗脫液洗脫下結合在HCEC表面的噬菌 體，經擴增滴定后再進行同樣的2輪淘篩，最終獲得能夠與HCEC發生結合的噬菌體多肽。 挑取噬菌體單克隆進行序列測定，將獲得的核苷酸序列利用NCBI提供的BLAST在線軟件進 行同源分析，發現其中一條多肽與綠膿桿菌的一個未知功能的細胞膜蛋白高度同源，通過 SMART蛋白結構在線預測軟件進一步預測綠膿桿菌此同源膜蛋白的結構，發現所篩多肽對 應位置恰好在膜外，那就有可能作為綠膿桿菌與宿主細胞互作的配體起作用，因此選擇此 位置的多肽序列進行下一步研究，其氨基酸序列為SEQ ID N0 :1，對應的核苷酸序列為SEQ ID N0 :2。
[0027] 2)多肽Pc-EP的人工合成與親和力鑒定
[0028] 將上述確定的有可能參與病原菌與宿主相互作用的12肽片段進行人工合成，N端 生物素化修飾以利于后續檢測，C端酰胺化修飾以防止降解。
[0029] 將一定量的合成肽段與封閉后的人角膜上皮細胞孵育，采用HRP直標的親和素通 過ELISA方法檢測合成的12肽片段與人角膜上皮細胞HCEC的親和力（圖1)。此合成多肽 與人角膜上皮細胞有較強的親和力。
[0030] 3)多肽Pc-EP抑制綠膿桿菌粘附角膜上皮細胞的實驗
[0031] 篩選并確定的多肽Pc-EP對眼科常見致病細菌綠膿桿菌粘附于人角膜 上皮細胞的抑制作用：將培養至80 %的人角膜上皮細胞先分別與不同濃度多肽 (lOOuM, lOuM, luM, 0· luM和 0· 01uM)37°C孵育 lhr，然后加入 106cfu 的綠膿桿菌再 37°C孵育 lhr，PBS洗去未結合的病原細菌，裂解液裂解后梯度稀釋鋪板計數，不加多肽處理的作為陰 性對照（圖2)。可見與對照相比，Pc-EP多肽對綠膿桿菌粘附于角膜上皮細胞有明顯的抑 制作用，且呈一定的劑量依賴性，隨著多肽濃度的升高，對粘附的抑制率升高。
[0032] 4)多肽Pc-EP抑制綠膿桿菌粘附小鼠角膜上皮的實驗
[0033] 將麻醉后的BALB/c小鼠角膜用25G針頭在角膜上皮劃"#"模擬角膜外傷，然后在 表面滴加 100uM的多肽與107cfu的綠膿桿菌的混合液，作用lhr后，PBS沖洗未結合的細菌， 剪下角膜勻漿，梯度稀釋鋪板計數，不加多肽處理的作為陰性對照（圖3)。結果表明Pc-EP 多肽對綠膿桿菌粘附小鼠角膜有一定的抑制作用，與對照相比粘附的菌量顯著減少。
[0034] 5)多肽Pc-EP抑制綠膿桿菌感染小鼠角膜的實驗
[0035] 利用BALB/c小鼠的細菌性角膜炎模型進一步檢測多肽對綠膿桿菌感染角膜進程 的抑制作用。即在角膜劃傷后感染前lhr用100uM的多肽點眼4次，間隔15min，然后滴加 10 7cfu的綠膿桿菌，繼續用用100uM的多肽每小時點眼1次，點5次。在感染后1，3, 5, 7和 10天時，對小鼠角膜病變情況在裂隙燈顯微鏡下觀察進行臨床評分（圖4)。同時對感染后 第三天的小鼠角膜進行組織病理染色觀察（圖5)。實驗中利用細菌性角膜炎臨床治療常用 藥物左氧氟沙星滴眼液作為陽性對照。結果表明多肽Pc-EP對綠膿桿菌引發的角膜炎有一 定程度的抑制作用。
[0036] 6)多肽Pc-EP對角膜上皮細胞的毒性實驗
[0037] 利用MTT法測定合成多肽對人角膜上皮細胞的毒性。測定多肽的濃度范圍為 0, 0. 01，0. 1，1，10和100 uM，結果發現多對人角膜上皮細胞的毒性較低（圖6)。
[0038] 二、與Pc-EP多肽具有同源性的多肽、多肽片段及其融合蛋白
[0039] 本發明還保護與SEQ ID NO: 1的多肽分別具有70%或以上同源性的多肽，該多肽 的功能與SEQ ID NO: 1的多肽Pc-EP功能相同或相似。
[0040] 所述的具有同源性多肽，可以是具有75%同源性（3個氨基酸的不同）、80%以上 同源性（2個氨基酸的不同）和90%以上同源性（1個氨基酸的不同）的多肽，該多肽的功 能與Pc-EP多肽功能相同或相似。
[0041] 例如，序列為SEQ ID NO: 3 SGSDGLFPMPPWLED的多肽，其與位點名稱為Pc-EP的多 肽相比，是在N端加上了 Ser-Gly-Ser (SGS)，而抑制病原菌粘附角膜上皮細胞的實驗表明 序列為SEQ ID N0:3的多肽也具有抑制綠膿桿菌粘附的功能。
[0042] 所述的同源性多肽可以用Applied biosystem合成儀或Pioneer?肽合成儀等多 肽合成儀器按固相化學技術合成。也可以通過插入目的核苷酸片段的表達載體表達出所需 要的多肽。
[0043] 本發明所述的多肽還可以與蛋白載體連接制成完全抗原，蛋白載體可以是卵清白 蛋白（0VA)或牛血清白蛋白（BSA)，通過碳化二亞胺法，將多肽N末端的氨基與載體蛋白上 的羧基相連，然后再采用梯度法透析后得到高純度的完全抗原。
[0044] 實施例2 :完全抗原的制備：
[0045] (1)將本發明所述的多肽溶于二甲基亞砜（DMS0)中配制成0. 1 μ g/μ L的多肽母 液；將水溶性碳化二亞胺（EDC)、Ν-羥基琥珀酰亞胺（NHS)和卵清白蛋白（0VA)用0. 01Μ磷 酸鹽緩沖液（PBS，pH7. 5)分別配制成lmg/mL的工作液；
[0046] (2)取100 μ L多肽母液，加入20 μ L EDC工作液和12 μ L NHS工作液，STX、EDC、 NHS反應的摩爾比為1 :2-3 :1-2,室溫震蕩反應3h，獲得最初反應液；
[0047] (3)將蛋白載體用0· 01M磷酸鹽緩沖液（PBS，ρΗ7· 5)配成lmg/mL的工作液。
[0048] (4) STX和載體蛋白反應的最佳摩爾比為10 :1 ;將⑵步驟中的反應物加入到 100 μ L的載體蛋白工作液中，4°C震蕩反應12h，獲得最終反應液；
[0049] (5)將上述的最終反應液轉移到透析卡中，用300mL0. 01M ρΗ7· 5的PBS緩沖液和 DMS0的混合液透析72h，每12h換液1次，透析采用梯度透析法，透析完后取出反應物，最終 得到連接有本發明多肽的完全抗原。
[0050] 在具體實驗中，將序列為SEQ ID NO: 1的多肽與卵清白蛋白0VA連接制成完全抗 原，并可用于后續實施例的抗體制備。
[0051] 三、包含序列為SEQ ID NO: 1多肽的藥物組合物
[0052] 實施例3 :復合多肽滴眼液的制備及其防治綠膿桿菌感染效果檢測
[0053] 取一定量Pc-EP多肽凍干粉溶解于滴眼液常用溶劑硼酸鹽緩沖液，配制成多肽 濃度為〇. 1 %的滴眼液，并且利用碳酸氫鈉調pH值至5. 5-7. 5,利用葡萄糖調節滲透壓為 270-310m0sm/kg，使其符合常規滴眼液的標準。
[0054] 于感染前1 hr用復合多肽滴眼液對健康BALB/c小鼠滴眼，15min/次，連續5次， 然后利用角膜劃傷法建立綠膿桿菌（l〇7cfu)感染的小鼠模型，感染后繼續用復合多肽滴眼 液進行點眼防治，15min/次，連續5次，8hr后取下角膜，勻漿裂解后梯度稀釋鋪板計數，只 感染不進行復合多肽滴眼液防治的同步實驗小鼠作為對照。結果發現此滴眼液對綠膿桿菌 的感染有較好的防治效果，抑菌率可達80 %。
[0055] 四、本發明的多肽用于制備抗體
[0056] 實施例4 :抗體的制備
[0057] 免疫6周齡的雌性BALB/c小鼠，首次免疫用200 μ L Pc-EP多肽（含5 μ g多肽）與 等體積弗氏完全佐劑，充分乳化后制成乳濁液，腹腔注射小鼠，之后每隔兩周取同量Pc-EP 多肽與等體積弗氏不完全佐劑充分乳化，腹腔注射。免疫三次后取尾血測定小鼠血清效價， 若效價不高，繼續免疫。待效價大于要求值后，殺死小鼠取血，取出的血室溫放置30min， 8000r/min離心20min，取上層血清，用蛋白A抗體離心純化試劑盒純化血清，制成抗Pc-EP 多肽的抗體。所制備的抗體用間接競爭ELISA法測其效價，以陽性血清的0D值大于陰性的 2倍為參照，小鼠血清效價達到2400,實驗證明小鼠體內產生了抗體。
[0058] 用實施例2制備的Pc-EP多肽的完全抗原免疫6周齡的雌性BALB/c小鼠，間接 競爭ELISA法測其效價，結果表明，連接了蛋白載體的Pc-EP多肽的小鼠血清效價達到了 3500,遠高于Pc-EP多肽半抗原的效價。
[0059] 制備的抗體可以用于制備藥品或檢測試劑盒，用于檢測綠膿桿菌。利用所制備的 抗體與綠膿桿菌表面多肽對應抗原的特異性反應，來對綠膿桿菌進行檢測。首先在利用綠 膿桿菌構建的BALB/c小鼠的細菌性角膜炎模型中進行實驗，刮取病變角膜表面病灶組織， 鋪片后利用制備的抗體行免疫組織化學檢測，若顯陽性則說明病變角膜上有綠膿桿菌存 在。另外可以在臨床上疑似細菌性角膜炎的病變角膜的病灶組織刮片中通過免疫組化方法 進行檢測試劑盒的有效性驗證，若可檢測到陽性抗原，則說明是綠膿桿菌感染角膜所致病 變。
【權利要求】
1. 一種抑制綠膿桿菌粘附角膜的多肽，其特征在于所述的多肽包含有： ⑴序列為SEQ ID NO :1的多肽； ⑵與⑴中的多肽具有70%或以上同源性的多肽，該多肽的功能與⑴中的多肽功 能相同或相似。
2. -種融合蛋白，其特征在于所述的融合蛋白是將權利要求1所述的多肽與載體蛋白 連接形成的。
3. 如權利要求2所述的融合蛋白，其特征在于所述的載體蛋白為卵清白蛋白或牛血清 白蛋白中的任一種或幾種。
4. 一種多核苷酸，其特征在于所述的多核苷酸是： 1) 編碼序列為SEQ ID NO :1多肽的核苷酸； 2) 編碼與⑴中所述的多肽具有70%或以上同源性的多肽的核苷酸，所編碼的多肽的 功能與⑴中所述的多肽功能相同或相似。
5. 如權利要求4所屬的多核苷酸，其特征在于所述的核苷酸的序列為SEQ ID NO :2。
6. -種抑制綠膿桿菌粘附角膜的藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物包含有 權利要求1所述的多肽。
7. -種單克隆或多克隆抗體，其特征在于所述的抗體是由權利要求1所述的多肽作為 抗原制備的。
8. -種單克隆或多克隆抗體，其特征在于所述的抗體是由權利要求2所述融合蛋白作 為抗原制備的。
9. 如權利要求7或8所述的抗體在制備防治綠膿桿菌粘附角膜的藥物中的應用。
10. -種藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物包含有如權利要求7或8所述的 抗體。
【文檔編號】A61P27/02GK104151400SQ201410384986
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月5日 優先權日:2014年4月30日
【發明者】趙格, 袁青, 孫士營 申請人:山東省眼科研究所