專利名稱：一種制備南極磷蝦磷脂酰膽堿標準品的工藝的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種制備南極磷蝦磷脂酰膽堿標準品的工藝。
背景技術：
南極磷奸(Euphausia superba)又名大磷奸或南極大磷奸,是一種生活在南冰洋的南極洲水域的磷蝦。南極磷蝦資源豐富，據估計最高有數億噸之巨可捕量，是世界現有漁業產量的I倍以上，具有巨大的開發和利用潛力。世界主要漁業國家為日本和波蘭。產品在日本主要用作為料理，而世界上其他地方則作為動物飼料及魚餌。在世界海洋漁業資源普遍衰退的背景下，南極磷蝦資源日益受到世界各國關注。
據報道，南極磷蝦中含有豐富的磷脂成分，磷脂中富含被稱為“抗脂肪肝因子”的磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine，縮寫PC，又稱卵磷脂)，其對脂肪肝、脂肪代謝障礙、動脈硬化癥、皮膚病以腦血管、心血管等微血管疾病有效；還能防止高血壓、治療皮膚干癬。磷脂酰膽堿可直接作為注射劑使用，更是脂肪輸液的乳化劑。磷脂酰膽堿也可用來作為脂質體，如一些毒性較強的藥物如抗癌藥物順鉬的包被載體，能使抗癌藥物順利通過以磷脂作為構成成份的細胞膜。我國治療肝病的珍貴藥物“肝得健”即是以磷脂酰膽堿為主要成分。 此外，磷脂酰膽堿在高級涂料，高級化妝品、農藥、殺蟲劑、紡織品、石油制品(如橡膠)、電子工業等方面也具有不同的優良用途。
我國南極磷蝦現已進入探捕階段，約I 2年后開始大量捕撈，屆時面臨的主要問題是南極磷蝦的深加工利用。國外對南極磷蝦的加工主要是制備南極磷蝦蝦油，其中磷脂含量約占40%，磷脂酰膽堿是蝦油磷脂的主要成分，蝦油有可能成為最佳的磷脂酰膽堿加工的原料，生產南極磷蝦蝦油，生產南極磷蝦磷脂酰膽堿，均需要定性定量檢測PC的含量。檢測過程中需要南極磷蝦PC的標準品標定。制備南極磷蝦PC標準品是未來南極磷蝦深加工產品檢測的關鍵。PC標準品本身也是一種產品。發明內容
針對上述現有技術，本發明提供了一種制備南極磷蝦磷脂酰膽堿標準品的工藝。
本發明是通過以下技術方案實現的
一種制備南極磷蝦磷脂酰膽堿標準品的工藝，步驟如下
(I)取干南極磷蝦(含水量為8% 10%) IOOg,加入500 600ml的正己烷，20 35°C下攪拌提取3次，每次提取lh，每提取一次，過濾將干南極磷蝦濾出；合并提取液(約 1350 1700ml)，在 30 45。。，-O. 07 -O. 09Mpa 下旋轉蒸發，得蝦油(約 4. 5 5. 5g)；
(2)向步驟(I)所得的蝦油中加入5 7倍(指質量體積倍數，即Ig物料加入5 7ml液體，下同)的丙酮，20 35°C下攪拌提取6次，每次提取O. 5h，提取液過濾，每提取一次，過濾得濾液和濾渣；合并6次的濾液(約135 210ml )，在30 40°C，-O. 07 -O. 09Mpa 下旋轉蒸發，得含磷脂的油狀樣品液；
(3)層析柱的制備稱取65 75g娃膠，110 120°C下活化6 IOh ；向娃膠中加入3倍氯仿(質量體積倍數)，攪拌成漿狀；采用濕法裝柱法將硅膠裝入到3 X 30cm2層析柱中，靜置，使硅膠充分沉降至體積穩定不變；
(4)取步驟(2)所得含磷脂的油狀樣品液I. 5 3ml，緩緩加入到層析柱內，用氯仿甲醇=1 :1 2 (體積比)洗脫液洗脫，流速為2 3ml/min,按每份100 300ml收集洗脫液；
(5)將收集的各份洗脫液濃縮，薄層層析定性鑒定各份洗脫液組分，將具單一磷脂酰膽堿組分的濃縮液合并，蒸發除去溶劑，得磷脂酰膽堿標準品(約8 12mg)，經HPLC檢測，磷脂酰膽堿的純度> 98%。
所述南極磷蝦磷脂酰膽堿(PC)的薄層層析定性檢測方法為
薄層層析使用GF254硅膠薄層板，展開劑為氯仿甲醇水:乙胺=14 6 0. 6 5(V VV V),展距為6cm，取各洗脫液的濃縮液點樣，展畢后晾干，放入溴百里酚藍染液缸中染色12秒；取出后晾干，將干燥后的薄層板放在薄層掃描儀上觀察PC的Rf值為O. 37。
所述南極磷蝦磷脂酰膽堿(PC)的HPLC定量檢測方法為
采用美國(waters)HPLC 儀，2489 紫外光檢測器，S印ax HP-silica (4. 6 X 250mm 5um)色譜柱，以甲醇作流動相，流速lml/min，柱溫35°C，檢測波長206nm，進樣量10ul，PC 出峰時間為6 7分鐘，檢測純度98% 98. 9%ο
本發明首先用正己烷從干的南極磷蝦中提取出蝦油，經丙酮提取除雜質，采用硅膠柱層析分離純化南極磷蝦PC標準品，經高壓液相分析檢測，PC純度> 98%。
本發明制備了南極磷蝦磷脂酰膽堿標準品，為未來南極磷蝦深加工產品的檢測做出了貢獻。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明作進一步的說明。
實施例I制備南極磷蝦磷脂酰膽堿標準品
步驟為
(I)干南極磷蝦100g，加入正己烷600ml，20°C下攪拌提取3次，每次lh，每提取一次，過濾將干南極磷蝦濾出；合并三次的提取液(1700ml )，在30°C，-O. OSMpa下旋轉蒸發除去正己燒，得奸油5. 5g。
(2)向上述制備的蝦油中加入丙酮30ml，25°C下攪拌提取6次，每次提取O. 5h，每提取一次，過濾得濾液和濾渣；合并6次的濾液(180ml)，濾液在30°C，-O. 08Mpa下旋轉蒸發除去丙酮，得含磷脂的油狀樣品液4ml。
(3)稱取硅膠(200 300目)65g，110°C活化6h，向硅膠中加入195ml氯仿攪拌成漿狀，采用濕法裝柱法將硅膠裝入到層析柱(3 X 30cm2)中，靜置，使硅膠充分沉降至硅膠體積穩定不變。
(4)取步驟(2)制備的樣品液I. 5ml，緩緩加入層析柱內，用氯仿甲醇=1 1 (體積比)洗脫液洗脫，流速為2. 5ml/min，按每份IOOml收集洗脫液，濃縮。薄層層析定性鑒定洗脫液組分，將具有單一 PC組分的濃縮液合并，蒸發除去溶劑，得PC標準品8mg，經HPLC檢測，PC純度為98%。
南極磷蝦磷脂酰膽堿(PC)的薄層層析定性檢測方法為
薄層層析使用GF254硅膠薄層板，展開劑為氯仿甲醇水乙胺=14 6 0. 6 5(V VV V),展距為6cm，取各洗脫液的濃縮液點樣，展畢后晾干，放入溴百里酚藍染液缸中染色12秒；取出后晾干，將干燥后的薄層板放在薄層掃描儀上觀察PC的Rf值為O. 37。
南極磷蝦磷脂酰膽堿(PC)的HPLC定量檢測方法為
采用美國(waters)HPLC儀。，2489 紫外光檢測器，S印ax HP-silica (4. 6 X 250mm 5um)色譜柱，以甲醇作流動相，流速lml/min，柱溫35°C，檢測波長206nm，進樣量10ul，PC 出峰時間為6 7分鐘，檢測純度98% 98. 9%ο
實施例2制備南極磷蝦磷脂酰膽堿標準品
步驟為
(I)干南極磷奸IOOg,加入正己燒500ml, 25 °C下攪拌提取3次,每次Ih,每提取一次，過濾將干南極磷蝦濾出；合并三次的提取液(1350ml )，在45°C，-O. 07Mpa下旋轉蒸發除去正己燒，得Φ下油4. 5g。
(2)向制備的蝦油中加入丙酮22. 5ml，20°C下攪拌提取6次，每次提取O. 5h，每提取一次，過濾得濾液和濾渣；合并6次的濾液(135ml)，濾液在40°C，-O. 07Mpa下旋轉蒸發除去丙酮，得含磷脂的油狀樣品液4ml。
(3)稱取硅膠(200 300目)68g，115°C活化8h，向硅膠中加入204ml氯仿攪拌成漿狀，采用濕法裝柱法將硅膠裝入到層析柱(3 X 30cm2)中，靜置，使硅膠充分沉降至硅膠體積穩定不變。
(4)取步驟(2)制備的樣品液2ml，緩緩加入層析柱內，用氯仿甲醇=1 1. 5洗脫液洗脫，流速為2ml/min，按每份300ml收集洗脫液，濃縮，薄層層析定性鑒定洗脫液組分。 將具有單一 PC組分的濃縮液合并，蒸發除去溶劑，得PC標準品10mg，經HPLC檢測，PC純度為 98. 5%ο
實施例3制備南極磷蝦磷脂酰膽堿標準品
步驟為
(I)干南極磷奸IOOg,加入正己燒550ml, 35 °C下攪拌提取3次,每次Ih,每提取一次，過濾將干南極磷蝦濾出；合并三次的提取液(1500ml )，在35°C，-O. 09Mpa下旋轉蒸發除去正己燒，得奸油5g。
(2)向制備的蝦油中加入丙酮35ml，35°C下攪拌提取6次，每次提取O. 5h，每提取一次，過濾將干南極磷蝦濾出；合并三次的提取液(210ml)，濾液在40°C，-O. 09Mpa下旋轉蒸發除去丙酮，得含磷脂的油狀樣品液4ml。
(3)稱取硅膠(200 300目)75g，120°C活化10h，向硅膠中加入225ml氯仿攪拌成漿狀，采用濕法裝柱法將硅膠裝入到層析柱(3 X 30cm2)中，靜置，使硅膠充分沉淀至體積穩定不變。
(4)取步驟(2)制備的樣品液3ml，緩緩加入層析柱內，用氯仿甲醇=1 :2洗脫液洗脫。流速為3ml/min每份200ml，收集洗脫液，濃縮，薄層層析定性鑒定洗脫液組分。將具有單一 PC組分的濃縮液合并，蒸發除去溶劑，得PC標準品12mg。經HPLC檢測，PC純度為 98. 9%。
權利要求
1.一種制備南極磷蝦磷脂酰膽堿標準品的工藝，其特征在于步驟如下(1)取干南極磷蝦100g，加入500 600ml的正己烷，20 35°C下攪拌提取3次，每次提取lh，每提取一次，過濾將干南極磷蝦濾出；合并提取液，在30 45°C，-O. 07 -O. 09Mpa 下旋轉蒸發，得蝦油；(2)向步驟(I)所得的蝦油中加入5 7倍的丙酮，20 35°C下攪拌提取6次，每次提取O. 5h，提取液過濾，每提取一次，過濾得濾液和濾渣；合并6次的濾液，在30 40 °C, -O. 07 -O. 09Mpa下旋轉蒸發,得含磷脂的油狀樣品液；(3)層析柱的制備稱取65 75g娃膠，110 120°C下活化6 IOh；向娃膠中加入3 倍氯仿，攪拌成漿狀；采用濕法裝柱法將硅膠裝入到3 X 30cm2層析柱中，靜置，使硅膠充分沉降至體積穩定不變；(4)取步驟(2)所得含磷脂的油狀樣品液I.5 3ml，緩緩加入到層析柱內，用氯仿甲醇=1 :1 2洗脫液洗脫，流速為2 3ml/min，按每份100 300ml收集洗脫液；(5)將收集的各份洗脫液濃縮，薄層層析定性鑒定各份洗脫液組分，將具單一磷脂酰膽堿組分的濃縮液合并，蒸發除去溶劑，即得磷脂酰膽堿標準品。
2.根據權利要求I所述的一種制備南極磷蝦磷脂酰膽堿標準品的工藝，其特征在于 所述硅膠為200 300目的硅膠。
全文摘要
本發明公開了一種制備南極磷蝦磷脂酰膽堿標準品的工藝，步驟如下(1)取干南極磷蝦，加入正己烷，攪拌提取3次，合并提取液，旋轉蒸發，得蝦油；(2)向蝦油中加入丙酮，攪拌提取6次，合并濾液，旋轉蒸發，得含磷脂的油狀樣品液；(3)制備層析柱；(4)取步驟(2)所得含磷脂的油狀樣品液1.5～3ml，緩緩加入到層析柱內，用氯仿-甲醇洗脫液洗脫，收集洗脫液；(5)將收集的各份洗脫液濃縮，薄層層析定性鑒定各份洗脫液組分，將具單一磷脂酰膽堿組分的濃縮液合并，蒸發除去溶劑，即得磷脂酰膽堿標準品，經高壓液相分析檢測，PC純度≥98%。本發明制備了南極磷蝦磷脂酰膽堿標準品，為未來南極磷蝦深加工產品的檢測做出了貢獻。
文檔編號C07F9/10GK102911201SQ20121041093
公開日2013年2月6日 申請日期2012年10月25日 優先權日2012年10月25日
發明者魏山山, 劉代成 申請人:山東師范大學