本發明涉及農林生物質資源利用和處理
技術領域：
，發明一種雙功能化離子液體預處理原生生物質提高酶解效率的新方法。
背景技術：
：隨著石油和煤炭等不可再生資源的短缺和價格的上升，以及人們對環境污染的關注，使得僅次于煤炭、石油和天然氣而居于世界能源消費總量第四位的生物質能源而備受關注。生物質能源作為一種潔凈而又可再生的能源，是唯一可替代化石能源轉化成氣態、液態和固態燃料以及其它化工原料或者產品的碳資源。生物質作為低品位的能源形式，將其轉化為高品位的液體燃料，是生物能源領域最為重要的研究方向。在木質纖維素的轉化過程中，基于糖平臺的生物轉化技術由于反應條件溫和、環境友好等優點備受青睞。木質纖維素原料由纖維素、半纖維素和木質素三大部分組成。半纖維素作為分子黏合劑結合在纖維素和木質素之間，而木質素具有的網狀結構，作為支撐骨架包圍并加固著纖維素和半纖維素[BioresourceTechnology,1996,55(1):1-33]。木質素的網狀結構和纖維素的結晶度等對纖維素的水解糖化均會產生很大的影響，在生物利用纖維素的過程中，為使微生物更易于利用纖維素，必須對基質進行預處理，以降解木質素的網狀結構，提高對纖維素的利用效率[BiotechnologyandBioengineering,1995,45(4):328-336]。傳統的生物質前處理方法如：酸預處理、堿預處理、汽爆法、熱水預處理、氨爆法，但是由于這些方法都存在固有的缺點，例如酸預處理方法容易產生微生物發酵抑制物，增加了后續處理的難度，此外，稀酸對預預處理裝置的腐蝕性也是制約其工業化的重要因素之一；堿處理難以破壞木質纖維素的結晶度， 與無定形纖維素相比，其酶解時間仍較長；蒸汽爆破法對設備要求較高，設備投入大，制約了規模化應用。近年來，離子液體以其獨特的優勢，成為生物質前處理體系的優良選擇[Chem.Commun.,2011,47:1405-1421]。與傳統的化學溶劑相比，離子液體具有以下特點：(1)極低的蒸氣壓，不容易揮發；(2)具有較寬的液程范圍(從低于或接近室溫到300℃)、較好的化學穩定性及較寬的電化學穩定電位窗口；(3)通過設計陰陽離子，可調節其對無機物、水、有機物及聚合物的溶解性。目前對于離子液體在生物質前處理領域的應用，主要是應用離子液體的超溶解能力，將盡可能多的木質素從生物質中提取或者是分離出來，因為木質素的存在一方面是網狀結構阻礙的微生物接近纖維素以及半纖維素，另一方面木質素會造成酶的無效吸附，使得酶活降低和酶解成本升高[ChemSusChem,2013,6(5):919–927]。但是在移除木質素的同時希望盡可能多的保留纖維素和半纖維，這樣有利于更有效的利用生物質中的纖維素和半纖維素。從已有的研究成果上看，1,3-dimethylimidazoliummethylsulfate(MMimMeSO4)[J.WoodChem.Technol.,2007,27,23–33],1-butyl-3-methylimidazoliummethylsulfate(BmimMeSO4)[J.WoodChem.Technol.,2007,27,23–33],1-butyl-3-methylimidazoliumacesulfamate(BmimAce)[GreenChem.,2011,13,3124-3136],1-ethyl-3-methylimidazoliumacesulfamate(EmimAce)[GreenChem.,2011,13,3124-3136]and1-ethyl-3-methylimidazoliumxylenesulfonate(EmimABS)[GreenChem.,2009,11,339–345]。含磺酸陰離子基的離子液體對木質素顯示出更好的溶解以及提取效果，但是由于離子液體很容易吸水，而磺酸陰離子基在有水以及加熱的條件下，很溶液水解成酸性基團，這樣纖維素和半纖維素在酸性條件下容易發生降解。而本發明提供了一種雙功能化離子液體預處理原生生物質提 高酶解效率的新方法，把堿性基團和磺酸基團相結合的雙功能化離子液體可以有效的去除木質素而又盡可能多的保留纖維素和半纖維素。并且相對于傳統的預處理方法，處理條件溫和，對實驗設備要求低，并且離子液體可循環等優點。技術實現要素：本發明的目的是提供一種雙功能化離子液體預處理生物質提高酶解效率的方法，本發明采用以下技術方案：(1)原生生物質經干燥、粉碎，其平均粒徑控制在20-200目；(2)以雙功能化離子液體為預處理溶劑，按著生物質和離子液體的質量比為1:2.5～25混合生物質和離子液體，于室溫～200℃下攪拌0.5～36h，然后冷卻至室溫，加入2～10倍離子液體體積的水，過濾，洗滌濾渣，干燥后獲得預處理后的生物質；(3)按著固液比為1～10mg/ml稱取預處理后的生物質原料加入到檸檬酸鹽緩沖液中，再按著5～30FPU/g預處理后的生物質的比例加入纖維素酶，在100-300r/min，40-60℃下反應，酶解時間為0.5-100h，溶液中葡萄糖收率遠遠大于未經處理的生物質原料所產生的葡萄糖量。所述雙功能化離子液體為含磺酸陰離子基但不含氟的-CHxSO3-陰離子，其中x＝0，1或2；且磺酸陰離子基含堿性基團。所述堿性基團為-NHx，其中X＝0,1或2。所述含磺酸陰離子基的離子液體：優選的含磺酸陰離子基的堿性離子液體的陰離子結構如下所示:M1和M2是分別獨立的，-H，-CH3，-C2H5，C3-C16直鏈或帶支鏈的烷烴、烯烴，芳烴，單取代芳烴，二取代芳烴以及多取代芳烴；n為1或2；X為-H，-CH3、-C2H5，C3-C8直鏈或帶支鏈的烷烴、烯烴，芳烴，單取代芳烴，二取代芳烴以及多取代芳烴。所述含磺酸陰離子基的離子液體：所述的陰離子優選為[Et2NC3SO3],[Et2NC4SO3],[Me2NC4SO3],[Me2NC3SO3],[n-BuNHC3SO3],[n-BuNHC4SO3],[n-HeNHC3SO3],[i-PrNHC3SO3],[i-PrNHC4SO3],[i-BuNHC3SO3],[i-BuNHC4SO3],[MeNHC4SO3],[MeNHC3SO3],[EtNHC4SO3]或[EtNHC3SO3]。所述含磺酸陰離子基的離子液體：所述的含磺酸陰離子基的離子液體的陽離子為咪唑類有機陽離子、吡啶類有機陽離子、哌啶類有機陽離子、吡咯類有機陽離子、季銨鹽類有機陽離子、季磷鹽類有機陽離子或膽堿類有機陽離子。所述咪唑類有機陽離子結構通式為：吡啶類有機陽離子結構通式為：哌啶類有機陽離子結構通式為：吡咯類有機陽離子結構通式為：季銨鹽類有機陽離子結構通式為：季磷鹽類有機陽離子結構通式為：膽堿類有機陽離子結構為：其中，R1-R6是分別獨立的，-CH3，-C2H5或者是C3-C6直鏈或帶支鏈的烷烴或烯烴；R7-R10是分別獨立的，-CH3，-C2H5或者是C3-C15直鏈或帶支鏈的烷烴或 烯烴。所述含磺酸陰離子基的離子液體：陽離子優選為四甲基胺(Me4N)，四乙基胺(Et4N)，四丁基胺(Bu4N)，1-甲基-3-乙基咪唑(Emim)，膽堿(Ch)。所述的雙功能化離子液體，優選的離子液體組合為:陽離子為四甲基胺(Me4N)，四乙基胺(Et4N)，四丁基胺(Bu4N)，1-甲基-3-乙基咪唑(Emim)，膽堿(Ch)中的一種；陰離子為[Et2NC3SO3],[Et2NC4SO3],[Me2NC4SO3],[Me2NC3SO3],[n-BuNHC3SO3],[n-BuNHC4SO3],[n-HeNHC3SO3],[i-PrNHC3SO3],[i-PrNHC4SO3],[i-BuNHC3SO3],[i-BuNHC4SO3],[MeNHC4SO3],[MeNHC3SO3],[EtNHC4SO3],[EtNHC3SO3]中的一種。所述的雙功能化離子液體：優選的離子液體為[Ch][Et2NC3SO3],[Ch][Me2NC4SO3],[Ch][n-BuNHC3SO3],[Ch][n-HeNHC3SO3],[Ch][i-PrNHC3SO3],[Ch][i-PrNHC4SO3],[Ch][i-BuNHC3SO3],[Et4N][i-PrNHC3SO3],[Et4N][Me2NC4SO3],[Et4N][Et2NC3SO3],[Et4N][n-BuNHC3SO3],[Et4N][i-BuNHC3SO3],[Me4N][MeNHC3SO3]，[Me4N][MeNHC4SO3]，[Emim][MeNHC3SO3]其中一種或者幾種的混合物。所述的原生生物質原料有各種樹木、農作物秸稈、農產品加工業副產品、畜禽糞便和能源作物等中的一種或者幾種混合物，所述樹木為軟木和/或硬木。所述的原生生物質原料優選粒徑為：40-80目；所述的預處理優選溫度為：50-180℃。所述的預處理后原生生物質干燥方法為冷凍干燥或者加熱干燥；加熱干燥溫度為65-110℃。所述檸檬酸緩沖液，濃度為50mmol/L，pH為4.8。本發明的優點在于：(1)離子液體預處理條件相對溫和，對實驗設備要求低。(2)與未處理生物質原料相比，經過雙功能化離子液體預處理后，酶解效率明顯增強，還原糖收率提高。(3)與傳統的離子液體預處理工藝相比較，經過雙功能化離子液體預處理后，纖維素和半纖維素最大程度的得到保留，對于工業上的共發酵技術來說這種處理工藝至關重要。具體實施方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍不受實施例的限制，如果該領域的技術熟練人員根據上述本
發明內容對本發明做出一些非本質的改進和調整，仍屬于本發明的保護范圍。實施例1[Et4N][Me2NC4SO3]120℃預處理提高桉樹皮酶解效率(1)預處理：準確稱量500mg按樹皮粉末(粒徑40-80目)和10g[Et4N][Me2NC4SO3]離子液體，置于100ml圓底燒瓶中，于120℃下攪拌10小時；冷卻至室溫后，加入40ml去離子水洗滌、過濾，再用40ml去離子水洗滌濾渣5次，濾渣經干燥后記得到預處理后的桉樹皮。(2)酶解實驗：精確稱量預處理后的桉樹皮20mg，置于50ml具塞三角燒瓶中，加入7ml檸檬酸鹽緩沖液(50mmol/L，pH4.8)和纖維素酶，密封后置于160r/min，50℃的恒溫振蕩器中反應。定時取樣200ul，然后拿出后置于沸水中以猝滅酶解反應，離心后，用高效液相色譜測定葡萄糖和木糖的濃度。根據預處理前桉樹皮中葡萄糖和木糖的理論產量，即可計 算最終的葡萄糖以及木糖的收率，如表1。表1時間(h)48244896葡萄糖收率(％)24.4630.3258.1364.5680.33木糖收率(％)21.0721.8645.1648.5460.30實施例2[Et4N][i-PrNHC3SO3]120℃預處理提高桉樹皮酶解效率(1)預處理：準確稱量500mg按樹皮粉末(粒徑40-80目)和10g[Et4N][i-PrNHC3SO3]離子液體，置于100ml圓底燒瓶中，于120℃下攪拌10小時；冷卻至室溫后，加入40ml去離子水洗滌、過濾，再用40ml去離子水洗滌濾渣5次，濾渣經干燥后記得到預處理后的桉樹皮。(2)酶解實驗：精確稱量預處理后的桉樹皮20mg，置于50ml具塞三角燒瓶中，加入7ml檸檬酸鹽緩沖液(50mmol/L，pH4.8)和纖維素酶，密封后置于160r/min，50℃的恒溫振蕩器中反應。定時取樣200ul，然后拿出后置于沸水中以猝滅酶解反應，離心后，用高效液相色譜測定葡萄糖和木糖的濃度。根據預處理前桉樹皮中葡萄糖和木糖的理論產量，即可計算最終的葡萄糖以及木糖的收率，如表2。表2時間(h)48244896葡萄糖收率(％)16.2524.0036.0039.7348.39木糖收率(％)10.8817.1026.6429.3238.83實施例3[Ch][Et2NC4SO3]120℃預處理提高桉樹皮酶解效率(1)預處理：準確稱量500mg桉樹皮粉末(粒徑40-80目)和10g[Ch][Et2NC4SO3]離子液體，置于100ml圓底燒瓶中，于120℃下攪拌10小時；冷卻至室溫后，加入40ml去離子水洗滌、過濾，再用40ml去離子水洗滌濾渣5次，濾渣經干燥后記得到預處理后的桉樹皮。(2)酶解實驗：精確稱量預處理后的桉樹皮20mg，置于50ml具塞三角燒瓶中，加入7ml檸檬酸鹽緩沖液(50mmol/L，pH4.8)和纖維素酶，密封后置于160r/min，50℃的恒溫振蕩器中反應。定時取樣200ul，然后拿出后置于沸水中以猝滅酶解反應，離心后，用高效液相色譜測定葡萄糖和木糖的濃度。根據預處理前桉樹皮中葡萄糖和木糖的理論產量，即可計算最終的葡萄糖以及木糖的收率，如表3。表3時間(h)48244896葡萄糖收率(％)12.8220.0428.1934.4437.73木糖收率(％)10.5416.9522.3229.2232.78實施例4[Ch][n-BuNHC3SO3]120℃預處理提高桉樹皮酶解效率(1)預處理：準確稱量500mg桉樹皮粉末(粒徑40-80目)和10g[Ch][n-BuNHC3SO3]離子液體，置于100ml圓底燒瓶中，于120℃下攪拌10小時；冷卻至室溫后，加入40ml去離子水洗滌、過濾，再用40ml去離子水洗滌濾渣5次，濾渣經干燥后記得到預處理后的桉樹皮。(2)酶解實驗：精確稱量預處理后的桉樹皮20mg，置于50ml具塞三角燒瓶中，加入7ml檸檬酸鹽緩沖液(50mmol/L，pH4.8)和纖維素酶，密封后置 于160r/min，50℃的恒溫振蕩器中反應。定時取樣200ul，然后拿出后置于沸水中以猝滅酶解反應，離心后，用高效液相色譜測定葡萄糖和木糖的濃度。根據預處理前桉樹皮中葡萄糖和木糖的理論產量，即可計算最終的葡萄糖以及木糖的收率，如表4。表4時間(h)48244896葡萄糖收率(％)11.6914.9620.3922.4323.37木糖收率(％)8.4810.4917.7819.5221.32實施例5[Et4N][Me2NC4SO3]180℃預處理提高桉樹皮酶解效率(1)預處理：準確稱量500mg桉樹皮粉末(粒徑40-80目)和10g[Et4N][Me2NC4SO3]離子液體，置于100ml圓底燒瓶中，于180℃下攪拌6小時；冷卻至室溫后，加入40ml去離子水洗滌、過濾，再用40ml去離子水洗滌濾渣5次，濾渣經干燥后記得到預處理后的桉樹皮。(2)酶解實驗：精確稱量預處理后的桉樹皮20mg，置于50ml具塞三角燒瓶中，加入7ml檸檬酸鹽緩沖液(50mmol/L，pH4.8)和纖維素酶，密封后置于160r/min，50℃的恒溫振蕩器中反應。96小時取樣200ul，然后拿出后置于沸水中以猝滅酶解反應，離心后，用高效液相色譜測定葡萄糖和木糖的濃度。根據預處理前桉樹皮中葡萄糖和木糖的理論產量，即可計算最終的葡萄糖以及木糖的收率，如表5。表5時間(h)96葡萄糖收率(％)92.10木糖收率(％)80.20實施例6[Et4N][Me2NC4SO3]140℃預處理提高速生楊酶解效率(1)預處理：準確稱量1000mg速生楊粉末(粒徑40-80目)和10g[Et4N][Me2NC4SO3]離子液體，置于100ml圓底燒瓶中，于140℃下攪拌6小時；冷卻至室溫后，加入80ml去離子水洗滌、過濾，再用80ml去離子水洗滌濾渣5次，濾渣經干燥后記得到預處理后的速生楊。(2)酶解實驗：精確稱量預處理后的速生楊20mg，置于50ml具塞三角燒瓶中，加入7ml檸檬酸鹽緩沖液(50mmol/L，pH4.8)和纖維素酶，密封后置于160r/min，50℃的恒溫振蕩器中反應。96小時取樣200ul，然后拿出后置于沸水中以猝滅酶解反應，離心后，用高效液相色譜測定葡萄糖和木糖的濃度。根據預處理前速生楊中葡萄糖和木糖的理論產量，即可計算最終的葡萄糖以及木糖的收率，如表6。表6時間(h)96葡萄糖收率(％)85.20木糖收率(％)63.20實施例7[Emim][Me2NC4SO3]150℃預處理提高紅麻芯酶解效率(1)預處理：準確稱量2000mg紅麻芯粉末(粒徑40-80目)和10g[Emim][Me2NC4SO3]離子液體，置于100ml圓底燒瓶中，于150℃下攪拌6小時；冷卻至室溫后，加入120ml去離子水洗滌、過濾，再用120ml去離子水洗滌濾渣5次，濾渣經干燥后記得到預處理后的速生楊。(2)酶解實驗：精確稱量預處理后的紅麻芯20mg，置于50ml具塞三角燒瓶中，加入7ml檸檬酸鹽緩沖液(50mmol/L，pH4.8)和纖維素酶，密封后置于160r/min，50℃的恒溫振蕩器中反應。96小時取樣200ul，然后拿出后置于沸水中以猝滅酶解反應，離心后，用高效液相色譜測定葡萄糖和木糖的濃度。根據預處理前紅麻芯中葡萄糖和木糖的理論產量，即可計算最終的葡萄糖以及木糖的收率，如表7。表7時間(h)96葡萄糖收率(％)73.20木糖收率(％)60.20對比例1未經預處理的桉樹皮酶解精確稱量未經預處理的桉樹皮20mg，置于50ml具塞三角燒瓶中，加入7ml檸檬酸鹽緩沖液(50mmol/L，pH4.8)和纖維素酶，密封后置于160r/min，50℃的恒溫振蕩器中反應。定時取樣200ul，然后拿出后置于沸水中以猝滅酶解反應，離心后，用高效液相色譜測定葡萄糖和木糖的濃度。根據桉樹皮中葡萄糖和木糖的理論產量，即可計算最終的葡萄糖以及木糖的收率，如表8。表8時間(h)48244896葡萄糖收率(％)2.953.866.487.148.83木糖收率(％)7.288.2115.1116.9118.20對比例2未經預處理的速生楊酶解精確稱量未經預處理的速生楊粉末20mg，置于50ml具塞三角燒瓶中，加入7ml檸檬酸鹽緩沖液(50mmol/L，pH4.8)和纖維素酶，密封后置于160r/min，50℃的恒溫振蕩器中反應。96小時取樣200ul，然后拿出后置于沸水中以猝滅酶解反應，離心后，用高效液相色譜測定葡萄糖和木糖的濃度。根據速生楊中葡萄糖和木糖的理論產量，即可計算最終的葡萄糖以及木糖的收率，如表9。表9時間(h)96葡萄糖收率(％)6.23木糖收率(％)15.20對比例3未經預處理的紅麻芯酶解精確稱量未經預處理的紅麻芯粉末20mg，置于50ml具塞三角燒瓶中，加入7ml檸檬酸鹽緩沖液(50mmol/L，pH4.8)和纖維素酶，密封后置于160r/min，50℃的恒溫振蕩器中反應。96小時取樣200ul，然后拿出后置于沸水中以猝滅酶解反應，離心后，用高效液相色譜測定葡萄糖和木糖的濃度。根據紅麻芯中葡萄糖和木糖的理論產量，即可計算最終的葡萄糖以及木糖的收率，如表10。表10時間(h)96葡萄糖收率(％)9.10木糖收率(％)17.65當前第1頁1 2 3