可特異性結合嘔吐毒素抗原?抗體免疫復合物的納米抗體及其應用的制作方法

本發明涉及單域重鏈抗體技術(又稱為納米抗體技術)，以及基因工程抗體技術，屬于生物技術領域，具體涉及可特異性結合嘔吐毒素抗原-抗體免疫復合物(Immunocomplex)的納米抗體(Variable domain of heavy chain of heavychain antibody,VHH)制備及其應用。

背景技術：

免疫分析方法可分為競爭和非競爭型兩種形式。非競爭型免疫分析以其靈敏度高、步驟簡單而廣泛應用于微生物、病毒、蛋白等含有多個抗原表位的大分子物質的分析。對于小分子物質而言，由于小分子物質分子量過小，不易被兩個抗體同時結合，因此發展基于雙抗夾心的非競爭模式用于小分子物質的免疫分析就顯得十分困難。然而，近年來也有研究者基于新型免疫識別元件以及免疫分析組合新模式，發展出了一系列小分子物質的非競爭性免疫分析模式，比如：基于抗獨特性抗體的非競爭型免疫分析法、小分子肽的異雙位點復合物轉移免疫分析法、非競爭型免疫復合物檢測技術，基于化學修飾半抗原的非競爭型分析、特殊分離儀器、特殊抗體免疫分析法等，為小分子物質非競爭型免疫分析方法的發展提供了有益的探索。

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalneol，DON)是一種單端孢霉烯族的小分子真菌毒素，又名嘔吐毒素，廣泛存在于大麥、小麥、玉米、燕麥等農作物及其制品中。DON具有細胞毒性、胚胎毒性和免疫毒性等，輕微中毒可引起厭食、嘔吐、腹瀉、發燒、血壓升高等癥狀，嚴重時會威脅到人類及動物的生命。由于DON的高污染率和高毒性，對食品中的DON進行快速檢測具有重要的現實意義。在眾多的DON檢測方法中，免疫學檢測方法因其操作簡單、特異性和靈敏度高等特點，已廣泛應用于食品中DON的大規模篩查。DON屬于小分子物質，不能同時被兩個常規抗體所結合，導致目前DON的免疫學分析方法大多基于競爭型免疫分析。然而，相比較于競爭型免疫分析，非競爭型免疫分析方法具有操作步驟少、靈敏度高、檢測范圍廣等優勢，因此建立DON的非競爭型免疫分析方法就具有重要的現實意義。

重鏈抗體(Heavy-chain antibody)是一種天然缺失輕鏈，僅由重鏈組成的抗體，存在于駱駝、羊駝、鯊魚及軟骨魚類等動物中。單域重鏈抗體，即納米抗體(Variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody,VHH)是指僅由重鏈抗體可變區(Variable region)組成的基因工程抗體。與普通抗體相比，納米抗體具有分子量小，水溶性好，穩定性高等優點，目前已廣泛應用于食品科學研究，醫學診斷，藥物研發等領域。抗原-抗體免疫復合物(Immunocomplex)，是指抗原與抗體結合后形成的一種復合物。

本發明采用噬菌體展示納米抗體庫技術，以DON抗原-抗體免疫復合物為靶分子，從駝源天然單域重鏈抗體庫中淘選可特異性結合DON抗原-抗體免疫復合物的納米抗體，在此基礎上將其應用于DON的非競爭型免疫分析體系。通過噬菌體展示納米抗體庫技術淘選可特異性結合靶分子的納米抗體，該方法避免了傳統抗體制備所需的動物免疫過程，步驟簡單，方便快捷，篩選得到的納米抗體可應用于DON的非競爭型免疫分析。

技術實現要素：

本發明目的是提供一種可特異性結合DON抗原-抗體免疫復合物的納米抗體(包括含有所述納米抗體全部或部分功能區域的蛋白質或多肽)及其氨基酸序列，可以被用于真菌毒素DON的檢測分析。

本發明所提供的可特異性結合DON抗原-抗體免疫復合物的納米抗體，具有SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列。

其氨基酸序列的IMGT編號和結構域的劃分如圖1所示。

本發明所提及的納米抗體包括四個框架區(Framework region,FR)和三個互補決定區(Complementarity-determining region,CDR)。其中，框架區(FR1-FR4)分別選自SEQ ID NO.:2，SEQ ID NO.:4，SEQ ID NO.:6和SEQ ID NO.:8，互補決定區(CDR1-CDR3)分別選自SEQ ID NO.:3，SEQ ID NO.:5和SEQ ID NO.:7。框架區結構相對保守，主要起著維持蛋白質結構的作用；互補決定區結構相對多樣化，主要負責抗原-抗體免疫復合物的識別。

本發明提供一種蛋白質或多肽，包含SEQ ID NO.:2，SEQ ID NO.:4，SEQ ID NO.:6和SEQ ID NO.:8中的一個或兩個及以上的氨基酸序列，且至少與其中一個的氨基酸序列有90％同源性。

本發明提供一種蛋白質或多肽，包含SEQ ID NO.:3，SEQ ID NO.:5和SEQ ID NO.:7中的一個或兩個及以上的氨基酸序列，且至少與其中一個的氨基酸序列有80％同源性。

本發明提供了一種核酸分子，其特征是編碼SEQ ID NO.:1，通過遺傳密碼子的可以隨時獲得該核酸分子的具體序列。

本發明所提供的納米抗體可通過噬菌體擴增的方式進行大量制備。噬菌體擴增是指將展示有該納米抗體的噬菌體，通過生物擴增的方式，大量繁殖生產展示有該納米抗體的噬菌體粒子。

本發明所提供的納米抗體可以通過噬菌體擴增獲得的展示有納米抗體的噬菌體粒子直接用于分析檢測；

本發明所提供的核苷酸序列或部分序列可以通過合適的表達系統進行表達以已得到相應的蛋白質或多肽。這些表達系統包括細菌，酵母菌，絲狀真菌，動物細胞，昆蟲細胞，植物細胞，或無細胞表達系統。

本發明所提供的納米抗體可以應用于免疫學檢測分析。免疫學檢測的類型包括酶聯免疫吸附檢測、膠體金免疫層析、免疫斑點雜交等基于抗原-抗體特異性反應的免疫學分析檢測類型。

本發明所提供的氨基酸序列可以作為前體，通過隨機或定點突變技術進行改造，更夠獲得性質水溶性、穩定性、親和力以及特異性等)更好的突變體，用來發展進一步用于DON免疫分析的蛋白質或多肽。

本發明中所敘述的一些術語具有如下含義：

同源性：描述兩個或多個氨基酸序列的相似程度，第一個氨基酸序列和第二個氨基酸序列之間的同源性百分比可以通過【第一氨基酸序列中與第二氨基酸序列中相應位置處的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的數量】除以【第一個氨基酸序列中氨基酸總數】再乘以【100％】來計算，其中第二氨基酸序列中的某個氨基酸的缺失、插入、替換或添加(與第一氨基酸相比)被認為是有差別。另外，同源性百分比也可以利用已知的用于序列比對的計算機運算程序(如：NCBI Blast)獲得。

結構域：蛋白質三級結構的基本結構單位，通常具有一定的功能。

IMGT編號：IMGT數據庫(The International ImMunoGeneTics Database)中的一種已經標準化的抗體氨基酸序列編號方法。具體編號方法可以參考文獻(Ehrenmann,F.,Q.Kaas,et al.(2010)."IMGT/3Dstructure-DB and IMGT/DomainGapAlign:a database and a tool for immunoglobulins or antibodies,T cell receptors,MHC,IgSF and MhcSF."Nucleic Acids Res 38(Database issue):D301-307.Lefranc,M.P.,C.Pommie,et al.(2003)."IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains."Dev Comp Immunol 27(1):55-77.)中的描述。

密碼子(codon)：亦稱三聯體密碼(triplet code)，指對應于某種氨基酸的核苷酸三聯體。在轉譯過程中決定該種氨基酸插入生長中多肽鏈的位置。

附圖說明

圖1為納米抗體的氨基酸編號及結構域示意圖。

圖2為基于噬菌體展示納米抗體的非競爭型ELISA分析DON曲線。檢測范圍為0～500ng/mL。

具體實施方式

下面通過納米抗體的的淘選、分析以及應用，對本發明作進一步說明，這些具體實施不應以任何方式被解釋為限制本發明的應用范圍。

實施例1特異性結合DON抗原-抗體免疫復合物納米抗體的親和淘選及其鑒定

采用固相親和淘選的方法從駝源天然重鏈抗體庫中淘選針對DON抗原-抗體免疫復合物的納米抗體。采用親和柱純化抗DON單克隆抗體腹水，得到抗DON單克隆抗體；用PBS(pH 7.4)將抗DON單克隆抗體稀釋至終濃度20μg/mL，加入到兩個酶標板孔中，4℃包被過夜；吸出包被液，用PBST(10mM PBS，0.1％Tween-20(v/v))洗滌5次后，加入3％BSA-PBS(或3％OVA-PBS)37℃封閉2h；吸去封閉液，用PBST洗滌5次，一個孔(A孔)加入100μL駝源天然單域重鏈抗體庫(滴度約2.0×10¹¹cfu)，另一個孔(B孔)加入100μL 200ng/mL的DON標準品以形成DON抗原-抗體復合物，37℃孵育1h；將A孔中未結合的噬菌體轉移至形成DON抗原-抗體復合物的B孔中，37℃孵育1h；棄去B孔中未結合的噬菌體，用PBST洗滌10次，加入100μL的Glycine-HCl(0.2M,pH 2.2)洗脫8min后，立即用15μL Tris-HCl(1M，pH 9.1)中和。取10μL洗脫噬菌體測定滴度，其余洗脫物擴增后用于下一輪淘選。在第二、第三和第四輪的淘選過程中，用3％BSA和3％OVA交替封閉，其它步驟同上。

經過四輪淘選后，采用輔助噬菌體KM13對隨機挑選的單克隆進行救援，分別得到展示抗體可變區的噬菌體顆粒，再用非競爭phage-ELISA法測定噬菌體顆粒的結合活性，實驗設定背景對照，具體加樣步驟見表1。

表1非競爭phage-ELISA加樣表

將ELISA陽性克隆送測序公司進行序列測定，得到插入片段的DNA序列，其中納米抗體的編碼序列如下：

CCATGGCCCAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGATTGGTGCAGGCTGGGGGCTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGACGCACCTTCAGTAGAAGTGCCATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGAGAGCAGCGCGAGTGGCTCGCATTTATTAATGTACTTGGTCGCACAAACTATGCTGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATATCCAGAGACGACGCCAAGAACACGGTGTATTTGCAAATGAACAGCCTGATACCTGAGGACACGGCCGTCTATCGTTGTAATTCAGTCGGGGCGCGGTACAATTATTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGAACCCAAGACACCAAAACCACAAGCGGCCGC

(下劃線表示限制性內切酶識別位點)

根據密碼子，相對應的氨基酸系列如SEQ ID NO.:1。

實施例2特異性結合DON抗原-抗體復合物納米抗體噬菌粒的擴增

將展示有陽性納米抗體的噬菌體加入至20mL接種有E.coli TG1的培養物中，30℃220rpm振蕩培養6h；將培養物轉入另一離心管中，4℃、8000rpm離心15min，將上清轉入一新鮮的離心管中，加入1/6體積的PEG/NaCl，4℃靜置4h后，4℃、8000rpm離心10min，棄上清；1mL PBS重懸噬菌體，加入1/6體積的PEG/NaCl，4℃靜置1h后，4℃10000rpm離心10min，棄上清，加入500μLPBS進行重懸，即為噬菌體擴增液。

實施例3特異性結合DON抗原抗體免疫復合物納米抗體在大腸桿菌中的表達。

采用限制性內切酶NotI/NcoI，對噬菌粒pHEN1進行不完全酶切，瓊脂糖凝膠回收目的片段。

將得到的納米抗體雙酶切的基因片段克隆至表達載體pET-25b。

將重組質粒轉化至大腸桿菌Rosetta中，并進行誘導表達。將單菌落接種至5mL液體LB/Amp培養基中，于37℃、200rpm搖床震蕩培養10h；將上述培養液以1％的接種量接種于50mL液體LB培養基中，37℃、200rpm震蕩培養至OD為0.5后，加入終濃度為0.05mM IPTG，于30℃、180rpm搖床誘導培養8h。

誘導培養物通過8000rpm離心10min后，用15mL PBS重懸菌體并超聲破碎，超聲條件為220W，破碎2s，間歇3s，共50個循環；將破碎后的菌體于4℃、8000rpm離心15min，收集上清并進行親和柱純化獲得可溶性納米抗體。

通過優化誘導表達條件(如宿主菌、表達載體、IPTG濃度及誘導溫度等)，可以進一步提高納米抗體的表達量，為大量制備特異性結合DON抗原-抗體復合物納米抗體提供了途徑。

實施例4基于噬菌體展示納米抗體的非競爭型ELISA分析DON曲線的建立

用PBS(pH 7.4)將抗DON單克隆抗體稀釋至10μg/mL并加至酶標板孔中，100μL/孔，4℃包被過夜；棄去包被液，用0.05％PBST洗滌3次，加入300μL的3％脫脂乳，37℃封閉2小時；棄封閉液，用0.05％PBST洗板3次，每孔加入一系列不同濃度的DON標準品，100μL/孔，37℃孵育1小時，形成DON抗原-抗體免疫復合物；棄孔內液體，用0.05％PBST洗板3次后，每孔投入100μL展示有納米抗體的噬菌體(1.0×10⁹cfu)/可溶性表達納米抗體(10μg/mL)，37℃孵育1小時；加入1:5000稀釋HRP標記的抗M13噬菌體二抗/抗組氨酸標簽二抗，37℃孵育1小時。然后用TMB底物顯色，讀取OD₄₅₀。以DON濃度對數為橫坐標，OD₄₅₀為縱坐標，建立基于噬菌體展示納米抗體的非競爭型ELISA分析DON曲線(圖2)。結果表明，淘選獲得的納米抗體對DON抗原-抗體復合物具有結合活性和響應度。