一株黃綠木霉T?321010菌株及其培養方法與應用與流程

本發明涉及一株黃綠木霉(trichodermasp.)t-321010菌株及其培養方法與應用，屬于微生物技術領域。

背景技術：

木霉菌(trichodermaspp.)屬于真菌(fungi)真菌門(eumycota)半知菌亞門(deuteromycotina)絲孢綱(hyphomycetes)絲孢目(hyphomycetales)叢梗孢科(moniliaceae)木霉屬(trichoderma)，廣泛存在于土壤、根圍、葉圍、種子、球莖、腐爛的秸稈等生態環境中。由于木霉菌適應性廣，生存能力強，作用具有廣譜性及多機制性，一直是植病生防學家研究的重點對象。

1932年，weindling實驗(weindlingr.trichodermalignorumasaparasiteofothersoilfungi.phytopathology,1932,22:837～845)發現木霉菌(trichodermalignorum)可以寄生于多種植物病原真菌，建議將該菌用于土傳植物病害的生物防治，木霉菌生防研究工作從此開始。cn1028883489a描述了深綠木霉防治玉米莖腐病和紋枯病。cn103045483a提供了棘孢木霉防治葡萄灰霉病。lorito等進一步研究(loritom,harmange,hayesck,etal.chitinolyticenzymesproducedbytrichodermaharzianum:antifungalactivityofpurifiedendochitinaseandchitobiosidase.phytopathology,1993,83:302～307)發現木霉能誘導產生一系列幾丁質酶、葡聚糖酶，這些酶能降解病菌細胞壁，抑制病菌孢子萌發，引起病菌菌絲和孢子崩解。allen等還研究(allenmc,haenselercm.antagonisticactionoftrichodermaonrhizoctoniaandothersoilfungi.phytopathology,1935,25:244～252)報道木霉對立枯絲核菌等土傳病菌產生抗生作用，陳凱等把抗生素進一步具體化研究(陳凱、楊合同、李紀順等.木霉菌產生的聚酮類抗生性代謝產物.中國生物防治.2009,25(2)：171～175)證實木霉能產生一些對病菌有拮抗作用的次生代謝產物聚酮類物質。cn102071148a提供了利用擬康氏木霉smf2產生的細胞壁降解酶和抗生素哌珀毒素抑制植物病菌作用。

以色列elad等開發(elady.trichodex:commercializationoftrichodemaharzianumt39-acasestudy.agrowreport,biopesticides:trendsandopportunities.pjbpublicationsltd,richmond,gb2001,pp.45～50.)出的trichodex哈茨木霉制劑能防治灰霉病、霜霉病等多種葉部病害。harman及其團隊(harmange.mythsanddogmasofbiocontrol:changesinperceptionsderivedfromresearchontrichodermaharzianumt-22.plantdis.,2000,84(4):377～393.)成功地研制出商品制劑top-shield。楊合同等通過毒性試驗(楊合同，唐文華，ryderm.木霉菌與植物病害的生物防治.山東科學.1999,12(4):7-9)表明，用大白鼠進行的綠色木霉菌急性經口毒性測定，ld50/kg至少在500克以上，因此實際木霉制劑是無毒的，木霉菌對植物和人畜的安全系數很高。cn1786150a提供了綠色木霉的發酵工藝的基礎、植物抗生素的制備及土傳植物病害的生物防治制劑的配制。

guetsky等實驗(guetskyr,shtienbergd,eladyanddinoora.combiningbiocontrolagentstoreducethevariabilityofbiologicalcontrol.phytopathology,2001,91:621～627)表明，木霉菌與其他生防菌可以互作，木霉對一些殺菌劑如甲基托布津、克露、福生、三乙磷鋁、波爾多液等有天然抗性，可以交替防病。木霉生長及孢子萌發能適應較廣的溫濕度范圍和ph范圍。進一步實驗表明，每克土中含木霉分生孢子2×10³～2×10⁴時，可降低土壤根腐病菌群體數量，抗生菌在不同土壤中可連續存活半年到3年并可增殖。cn101781565a描述了擬康氏木霉應用于土壤后誘導植物抗病。

sivan等通過原生質體融合技術(sivana.harmange,staszte.transferofisolatednucleiintoprotoplastsoftrichodermaharzianum.appliedandenvironmentalmicrobiology.1990,56(8):2404～2409)獲得優良木霉菌株哈茨木霉菌t-22，木霉菌已由單一地從自然界分離篩選達到有目的地利用生物技術進行改造以獲得新型菌株。長期使用化學農藥，土壤日趨惡化，連作障礙更加嚴重，生態環境遭到破壞，制約蔬菜、水果、作物高產栽培和質量安全，木霉菌作為生防因子和土壤有益菌，應用潛力巨大，選擇多功能木霉菌作為研發對象是合適的。同時木霉菌的營養要求簡單，生長速度快，對于將來的工業化生產十分有利。木霉制劑通過種子處理、葉面噴施等方法配合化學農藥能夠防治立枯病、疫病、枯萎病、灰霉病等多種植物土傳病害和葉面病害，降低了作物藥害，減少化學污染，是改良農業生態、減少污染的重要措施。

技術實現要素：

本發明是針對現有技術的不足，提供一株黃綠木霉(trichodermasp.)t-321010菌株菌株及其培養方法與應用。

本發明技術方案如下：

一株黃綠木霉(trichodermasp.)t-321010菌株，2011年12月22日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號cgmccno.5638，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所。

黃綠木霉(trichodermasp.)t-321010菌株菌落在pda平板上生長快，氣生菌絲層較厚，致密叢束狀，初期為白色，平坦，逐漸產生分生孢子而呈黃綠色，產孢區常呈環狀，菌落最終顏色為灰黃綠色，反面的培養基顏色為暗黃綠色。菌絲有隔，透明，細胞壁光滑，分生孢子梗主分枝纖細，近直角伸出，次級分枝2～3個為一組。瓶梗長而細，基部微溢縮，2～3個一組在終極瓶梗下呈假輪狀，座生角度大。分生孢子卵形，大小為3.6～4.8×2.5～3.6μm。結果如圖1和圖2所示。

通過pcr(polymerasechainreaction，多聚酶鏈式反應)對本發明黃綠木霉t-321010菌株進行系統發育學的鑒定，確定黃綠木霉t-321010菌株的進化關系。將引物its1用于擴增18srdna和5.8srdna之間的轉錄間隔區，從而得到序列段，通過ncbigenbank建立的dna序列數據庫中數據進行比對，1096bp的序列段與黃綠木霉的相似度達到100％，核苷酸序列如seqidno.1所示。

引物its1核苷酸序列如下：

tccgtaggtgaacctgcgc

將引物its4用于擴增5.8srdna和28srdna之間的轉錄間隔區，從而得到序列段，通過ncbigenbank建立的dna序列數據庫中數據進行比對，1096bp的序列段與黃綠木霉的相似度達到100％，核苷酸序列如seqidno.2所示。

上述黃綠木霉(trichodermasp.)t-321010菌劑的制備方法，步驟如下：

(1)將黃綠木霉(trichodermasp.)t-321010菌株接種于pda固體培養基中，在25～27℃活化培養6d～9d，制得活化菌株；

(2)將步驟(1)制得的活化菌株接種至pd液體培養基中，在25～27℃搖瓶培養36h～48h，制得液體種子；

(3)將步驟(2)制得的液體種子接種至液體發酵培養基中，在25～27℃的條件下發酵培養，制得發酵液；

(4)將步驟(3)制得發酵液按質量百分比10％～30％的比例接種于固體發酵培養基中，在20℃～30℃、含水量50％～60％、空氣相對濕度80％～100％的條件下，固體發酵72h～96h；然后經干燥至含水量為5～10％，即得。

根據本發明優選的，所述步驟(3)中的液體發酵培養基，每升組分如下：

玉米粉12～18g，葡萄糖4～6g，豆粉4～6g，磷酸氫二鉀0.8～1.2g，碳酸鈣4～6g，水定容至1l，ph6.0。

根據本發明優選的，所述步驟(3)中，發酵培養包括三級液體發酵，具體步驟如下：

a、將步驟(2)制得的液體種子按體積比1％～5％的比例接種至液體發酵培養基中，在25～27℃的條件下，進行一級種子發酵培養36h～48h，制得一級種子液；

b、將一級種子液按體積比3％～8％接種至液體發酵培養基中，在25～27℃的條件下，進行二級發酵培養30h～40h，制得二級發酵液；

c、將二級發酵液按體積比5％～10％接種至液體發酵培養基中，在25～27℃、通氣量1：0.6-0.8、攪拌速度為200r/min的條件下，進行三級發酵培養30h～40h，制得發酵液。

根據本發明優選的，所述步驟(4)中，固體發酵培養基按如下方法制備：

將麥麩65～75份、作物秸稈粉末25～35份混合后，加入混合物質量1.1～1.3倍的水，攪拌均勻，調ph6～6.5，即得。

上述作物秸稈粉末為普通作物秸稈如玉米、花生、小麥等作物秸稈經粉碎機粉碎后制得的，為普通市售產品。

根據本發明優選的，所述步驟(4)中，干燥先進行通風晾干24～48h；然后去除培養基上的覆蓋物，再自然晾干24～48h；然后翻倒培養基再33～37℃條件下，干燥至含水量5～10％。

上述黃綠木霉(trichodermasp.)t-321010菌株在制備生防菌劑中的應用。

一種農用復合劑，包括上述黃綠木霉(trichodermasp.)t-321010菌劑0.5～45份，復配物55～99.5份，均為重量份；

所述復配物選自可溶性甲殼素、豆粕、甲基托布津、農家肥或黃腐酸鉀。

有益效果

1、本發明首次分離獲得了菌株黃綠木霉t32，并通過輻照誘變的方法獲得了黃綠木霉t-321010(原菌號即保存菌號：t321010)菌株；經檢測，黃綠木霉t-321010菌株在生長特性、拮抗作用、固體發酵產孢量、耐貯性與孢子存活率、土壤內定殖存活量、生物防治效果均顯著優于現有的生防菌哈茨木霉菌t-22，具有更顯著的長效性、多功能性，與紋枯病、根腐病、黃萎病、枯萎病病菌抗衡，進而抑制作物土傳病菌生長，提高植物抗病性，克服連作障礙效果顯著；

2、本發明所述的生防菌劑采用黃綠木霉t-321010菌株與有機質豆粕等復配后，有機質豆粕等為黃綠木霉t-321010菌株提供營養，利于木霉在土壤中快速定殖和增殖，黃綠木霉t-321010菌株對豆粕等利用代謝并轉化為寡聚糖、多肽、氨基酸、單糖、有機酸以及植物激素、水解酶及生化活性物質，提高有機質的活性，增強有機質作用，優化組合新的營養鏈，微生態平衡植物需求，促進植物生長發育，提高作物產量和品質；

3、本發明所述的生防菌劑采用黃綠木霉t-321010與甲基托布津等其他農藥化肥配合力高，具有與土壤及土壤有益微生物高度配合力和正向作用，抑制土傳病原真菌的生長，同時具有促進土壤有益微生物生長，調整土壤微生物結構，改善土壤微生態，促進土壤水穩性團聚體的形成，改善土壤物理結構，保護植物根系的作用，提高肥料利用率；

4、本發明所述的抗重茬土壤微生態改良劑采用黃綠木霉t-321010與可溶性甲殼素復配，可溶性甲殼素含有羥基等活性基團，羥基與粘粒礦物晶體表面上的氫原子形成氫鍵，能將分散的土粒膠結在一起形成團聚體，疏水基覆蓋在粘粒表面，改變了粘粒的水合性，同時協調、促進植物根系或葉面對土壤中無效養分的吸收利用，從而提高礦物質的利用率；可溶性甲殼素能誘導微生物幾丁質酶活性，黃綠木霉t-321010與其同時使用，提高黃綠木霉t-321010及放線菌的防病能力，可以促進土壤中增殖的有益菌固定氮、活化鉀、溶解磷，促進作物對氮、磷、鉀和微量元素的吸收，提高肥料利用率。

附圖說明

圖1是黃綠木霉t-321010菌分生孢子梗的顯微鏡照片；

圖2是黃綠木霉t-321010菌瓶梗的顯微鏡照片；

圖3是黃綠木霉野生菌t32與突變株t-321010(圖中為t1010)生長性狀初步分析實驗結果對比柱狀圖；

圖4是黃綠木霉野生菌t32與突變株t-321010(圖中為t1010)生物性狀深入分析實驗結果對比柱狀圖。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明的技術方案做進一步說明，但本發明所保護范圍不限于此。

實施例參照標準：

田間藥效試驗，棉花的出苗率、長勢、健康情況判斷標準參照中華人民共和國國家標準殺菌劑防治棉花黃、枯萎病gb/t17980.92-2004；

黃瓜、番茄的出苗率、長勢、健康情況判斷標準參照中華人民共和國國家標準農藥田間藥效試驗準則gb/t17980.144-2004；

小麥的出苗率、長勢、健康情況判斷標準參照中華人民共和國國家標準殺菌劑防治小麥紋枯病gb/t17980.108-2004；

花生的出苗率、長勢、健康情況判斷標準參照中華人民共和國國家標準殺菌劑防治大豆根腐病gb/t17980.88-2004；

水穩性團聚體數量的檢測標準執行中華人民共和國農業行業標準ny/t1121.19-2008，有機質檢測標準執行中華人民共和國農業行業標準ny/t1121.6-2006；

微生物群落測定：用去離子無菌水稀釋平板培養法，放線菌培養用高氏一號培養基，固氮菌培養用阿須貝氏培養基，菌體個數計算方法按慣用方式計算。土樣稀釋10⁵倍，取0.1ml在高氏一號培養基涂皿，30℃培養5～7天，測定放線菌數量，土樣稀釋10⁶倍，取0.1ml涂皿，在阿須貝氏培養基上涂皿，37℃培養3～5天，測定固氮菌數量。

高氏一號培養基每升組分如下：

可溶性淀粉20g，kno31g，nacl0.5g，k2hpo40.5g，mgso4.7h2o0.5g，feso4.7h2o0.01g，3％k2cr2o72ml，瓊脂20g，ph7.0～7.4，水定容至1000ml

阿須貝氏培養基每升組分如下：

kh2po40.2g，mgso4.7h2o0.2g，nacl0.2g，caso4.2h2o0.2g，caco33.0g，甘露醇10.0g，瓊脂20g，ph7.2，水定容至1000ml。

實施例中所述棉花魯棉18號購自山東棉花研究中心，小麥濟麥17號購自山東省農業科學院作物研究所，花生花育22號購自山東省花生研究所。

實施例1黃綠木霉t-321010菌株的選育

野生菌株的采集、分離及純化

采集樣品為日光溫室蔬菜田土，地點為濰坊市，用鐵锨刨開表層土，在土壤耕作層5～25cm取土，放入牛皮紙袋，外套聚乙烯袋裝好，帶回實驗室。用馬丁培養基對稀釋土壤涂皿，培養3～4d，挑取菌落形態近似木霉菌落的單菌落，經鏡檢初步鑒定為木霉菌，再顯微技術單孢分離，轉接pda平板純化培養，編號保存于pda斜面上。

上述pda平板培養基、馬丁(martin)培養基均為本領域常用培養基。

pda平板培養基每升組分如下：

馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂粉20g，ph自然，水定容至1000ml。

配制方法：將馬鈴薯去皮。切成約0.5mm見方的小塊，放入1500ml的燒杯中煮沸30min，注意用玻璃棒攪拌以防糊底，然后用雙層紗布過濾，取其濾液加糖，再補足水至1000ml。

馬丁(martin)培養基即虎紅瓊脂培養基每升組分如下：

蛋白胨5g，葡萄糖10g，kh2po41g，mgso4.7h2o0.5g，瓊脂20g，孟加拉紅(1％)3.3ml，鏈霉素33mg，ph7.0～7.2，水1000ml

制作：上述各成分加入蒸餾水溶解后，再加孟加拉紅水溶液；待培養基融化后冷卻至55～60℃時加入鏈霉素(鏈霉素含量為33ug/ml)。

出發菌株黃綠木霉t32獲得

將木霉菌株接種于pda平板培養基上平板培養，然后轉接到pd液體培養基中液體培養，在pda平板培養基上對峙培養病原真菌與木霉菌株。

測定平板培養條件下木霉菌株的生長速度(菌落直徑)，木霉菌株的產量(分生孢子量)，測定液體培養條件下木霉菌株的菌絲重量，對峙培養結束后測定病原真菌菌落半徑和被木霉覆蓋情況。t32比一般木霉菌株生長速度提高10％以上，比一般木霉產孢量提高15％以上，拮抗作用強，覆蓋病菌能力達二級。

上述pda平板培養基、pd液體培養基均為本領域常用培養基。pd液體培養基每升制備過程如下：

采用200g去皮洗凈的馬鈴薯與1000ml水混合煮沸15min，過濾后加入20g葡萄糖，水定容至1l。

pda固體培養基為在pd液體培養基基礎上加入15～20g/l瓊脂。

上述所用病原真菌選自：大麗輪枝菌(verticilliumdahliae)、立枯絲核菌(rhizoctoniasolani)、尖鐮刀菌(fusariumoxysporum)之一。

所述5級拮抗標準如下：

1級：木霉菌完全長過病菌，并覆蓋整個培養皿；

2級：木霉菌占整個培養皿面積的2/3以上；

3級：木霉菌占整個培養皿面積的1/2至2/3；

4級：病菌占整個培養皿面積的2/3以上；

5級：病菌長過木霉菌，并覆蓋整個培養皿。

出發菌株黃綠木霉t32的篩選及誘變菌劑的選擇

t32遺傳變異能力強，誘變效應大，進行物理誘變，用無菌蒸餾水將木霉孢子制成孢子懸浮液10⁴cfu/ml放在18×180mm試管中⁶⁰co-γ射線0.8～1kgy輻照誘變，孢子致死率在90％～99％，突變率在50％以上，突變頻譜寬，所得菌株轉接培養三代，變異菌株穩定率在10％～30％，對生長速度及產孢量超過出發菌株的突變菌株再進行紫外線照射0.6～2min，孢子致死率在99％～99.9％，所得菌株轉接培養三代，變異菌株穩定率在30％，如表1所示。

表1、黃綠木霉t32菌株復合誘變變異率

黃綠木霉t-321010菌株鑒定試驗

穩定性試驗

黃綠木霉t-321010突變菌株在pda平板培養基繼代培養10代以上穩定，結果如表2所示。

表2、突變菌株后代穩定性

生物性狀初步試驗

黃綠木霉t-321010突變菌株在pda平板固體培養基，在pd液體培養基液體培養基，與病菌對峙pda平板固體培養，對峙培養病原真菌選自：大麗輪枝菌(verticilliumdahliae)、立枯絲核菌(rhizoctoniasolani)、尖鐮刀菌(fusariumoxysporum)之一。

黃綠木霉t-321010突變菌株生長速度、菌絲量、產孢量、覆蓋病菌率和抑菌率等方面分別比出發菌株提高13.6％、29％、48.5％、57.4％、87.5％，結果如圖3所示。

抗逆性試驗

黃綠木霉t-321010突變菌株在定向選擇培養培養，將農藥定向培養基為pda培養基加入田間農藥使用濃度的1/4，配制土壤浸液或農業副產物濾液貧瘠培養基，平板培養t-321010突變菌株。與出發菌株t32相比，t-321010突變菌株抗逆境能力強，產孢能力比t32多一成以上。

生物性狀深入分析試驗

pd液體培養基培養t-321010突變菌株。與黃綠木霉t32出發菌株相比，黃綠木霉t-321010突變菌株發酵過程，生長速度快，培養成分利用率高，黃綠木霉t-321010對培養液中氨態氮的吸收率比出發菌株t32提高37.09％，t-321010對無機磷的吸收率比出發菌株提高15.17％，黃綠木霉t-321010對k⁺吸收率比出發菌株高16.49％，在ph7.34的培養液中培養3d后，黃綠木霉t-321010的ph值為5.77，出發菌株的ph值為6.67，黃綠木霉t-321010菌株調整培養液酸堿能力強；黃綠木霉t-321010對培養液中葡萄糖的吸收能力比出發菌株提高19.64％；黃綠木霉t-321010菌絲水解酶活力產生比例高，培養液和菌絲幾丁質酶活力分別比出發菌株提高83.76％、106.88％；葡聚糖酶活力分別比出發菌株提高189.11％、81.99％。結果如圖4所示。

上述水解酶活力測定：

酶粗提液分別與基質幾丁質膠體、葡聚糖溶液混合，37℃培養30min后，加95％乙醇，離心(4000r/min)15min，用3，5—二硝基水楊酸比色定糖法測定酶反應后葡萄糖含量。

固體發酵培養

固體發酵培養基為按65～75wt％的麥麩與25～35wt％的棉籽皮混合，再加入1.1～1.3倍重量的水攪拌均勻，調ph為6～6.5制得，滅菌后接種黃綠木霉t-321010菌株，生長速度快，產孢量大，比黃綠木霉t32提高21.4％。

黃綠木霉t-321010菌株驗證試驗

黃綠木霉t-321010菌株的固體發酵培養20批次，產孢量穩定，按以下步驟進行，以下均為重量比或重量百分比。

黃綠木霉t-321010菌原菌種在pda固體培養基平板活化培養，26℃培養6d～9d；轉接pd液體培養基搖瓶培養，26℃，200rpm，培養36h～48h；1～2個搖瓶培養菌轉向16lpd液體培養基液體發酵罐，26℃，攪拌速度為200rpm，發酵36h～48h；

固體發酵培養基按70wt％的麥麩與30wt％的棉籽皮混合，再加入1.1～1.3倍重量的水攪拌均勻，調ph為6～6.5制得；121℃滅菌40min后，在混合接種器內將液體菌種與固體培養基混合均勻，接種量為8％～15％，固體培養室培養。

參照cn102660627a一種木霉生防菌種質評價辦法，將黃綠木霉t-321010菌株進行種質評價：

黃綠木霉t-321010菌株室內生長特性

將黃綠木霉t-321010菌株、哈茨木霉菌t-22分別接種于pda平板培養基上，25～28℃培養5～7d；然后分別轉接到pd液體培養基中，25～28℃搖床培養2～4d，搖床轉速180～210r/min。黃綠木霉t-321010菌株比哈茨木霉菌t-22菌落直徑、產孢量、菌絲重量提高12.5％、11.2％、15.6％。

黃綠木霉t-321010菌株拮抗作用

在pda平板培養基上對峙培養病原真菌與黃綠木霉t-321010菌株、病原真菌與哈茨木霉菌t-22，25～28℃培養3～5d；對峙培養結束后測定病原真菌菌落半徑和被覆蓋情況，黃綠木霉t-321010菌株拮抗作用比t22提高6.5％，拮抗程度為1級或2級；

上述拮抗作用標準：

1級：木霉菌完全長過病菌，并覆蓋整個培養皿；

2級：木霉菌占整個培養皿面積的2/3以上；

3級：木霉菌占整個培養皿面積的1/2至2/3；

4級：病菌占整個培養皿面積的2/3以上；

5級：病菌長過木霉菌，并覆蓋整個培養皿。

黃綠木霉t-321010菌株孢子貯存期活性

黃綠木霉t-321010菌株、哈茨木霉菌t-22制劑分別0℃處理7d、55℃處理14d，室溫放置6個月、12個月、18個月、24個月后，測定稀釋平板培養基上的萌發孢子數，計算孢子存活率，貯存24個月以上，黃綠木霉t-321010菌株孢子存活率達78.4％。

黃綠木霉t-321010菌株在盆栽條件下土壤定殖量及生物防治效果

將黃綠木霉t-321010菌株、哈茨木霉菌t-22制劑按每克滅菌土壤加入1～1.5×10⁵cfu分生孢子的量分別與滅菌土壤混合，做盆栽試驗，同時按土壤重量20％～30％加水定殖10～15d，然后按每克滅菌土壤注入2～5×10⁴cfu的棉蔫萎鐮刀菌菌絲及孢懸液。

觀察記錄棉花出苗率、長勢、健康情況，分別于種植后25d對盆栽土壤進行取樣，采用平板計數法，黃綠木霉t-321010菌株在土壤中存活量為7.03×10⁴cfu/g，比哈茨木霉菌t-22在土壤中存活量提高25.54％；施用黃綠木霉t-321010菌株的棉花發病率比施用哈茨木霉菌t-22的棉花發病率降低12.43％；

黃綠木霉t-321010菌株在田間應用條件下定殖存活量、生物防治效果

棉花種植前10～30d，按150～200kg/hm²用量將黃綠木霉t-321010菌株、哈茨木霉菌t-22施入大田15～20cm的耕層土壤，灌溉至耕層土壤相對含水量為55％～65％；

分別于棉花種植后苗期、生長期、結果期對耕層土壤進行取樣，采用平板計數法測定，黃綠木霉t-321010菌株在土壤中存活量比哈茨木霉菌t-22提高25.04％；

觀察記錄棉花出苗率、長勢、健康情況，施用黃綠木霉t-321010菌株的木霉防病效果比施用哈茨木霉菌t-22的提高9.51％。

黃綠木霉t-321010菌株制劑生產及應用

黃綠木霉t-321010菌株的固體發酵培養，按以下步驟進行，以下均為重量比或重量百分比。

原種擴配：

黃綠木霉t-321010菌原菌種連續轉接活化至生長旺盛。菌種活化，26℃培養6d～9d。

種子擴培過程包括試管斜面菌種、平板、搖瓶(或固體種子培養瓶)、種子罐發酵(或種子固體發酵)培養三個階段，分別在pda固體培養基和pd液體培養基培養，26℃，菌種斜面或平板擴大培養3d～7d；種子搖瓶培養36h～48h；搖瓶種子轉向種子發酵罐培養的接種量為1％～5％，一級種子罐發酵36h～48h。

液相發酵

培養基，玉米粉1.5％，葡萄糖0.5％，豆粉0.5％，磷酸氫二鉀0.1％，碳酸鈣0.5％，ph6.0，121℃滅菌30min，種子發酵罐向二級液體發酵罐的接種量為3％～8％，二級液體發酵罐向三級液體發酵罐發酵的接種量為5％～10％，通氣量1：0.6～0.8，攪拌速度為200r/min，二級液體發酵30h～40h；三級液體發酵：30h～40h。

固相發酵

固體發酵培養基按65～75wt％的麥麩與25～35wt％的作物秸稈粉末混合，再加入1.1～1.3倍重量的水攪拌均勻，調ph為6～6.5制得；121℃滅菌40min后溫度降為30℃，在混合接種器內將液體菌種與固體培養基混合均勻，接種量為10％～30％，接種完畢轉移至固體培養室培養。

培養基厚度5cm，發酵溫度應控制在20℃～30℃，環境溫度不低于15℃，不高于32℃，固體發酵初期適宜發酵的物料含水量為50％～60％，空氣相對濕度80％～100％。固體發酵72h～96h。發酵結束時，發酵物含水量應控制在20％～40％，空氣相對濕度30％。

培養完畢，無菌通風良好的環境中，第一次在絲網架上自然晾24～48h，第二次去掉曲盤上的覆蓋物，自然晾24～48h，第三次倒曲盤，35℃控溫干燥40h。制劑含水量控制在5～10％。

制得黃綠木霉t-321010菌固體發酵劑，可用于配制農用制劑，依據產品的不同，細度分原狀大小、0.50mm(35目)、0.125mm(120目)、0.0450mm(325目)。

實施例2

一種農用復合劑，組分如下，均為重量份：

實施例1經固體發酵培養制備的細度35目的黃綠木霉t-321010菌粉12份，可溶性甲殼素(購自山東奧康生物科技有限公司)88份；

實施例3

一種農用復合劑，組分如下，均為重量份：

實施例1經固體發酵培養制備的原狀大小的黃綠木霉t-321010菌粉1.5份，豆粕(購自東營福可得生物有機肥有限公司)98.5份；

實施例4

一種農用復合劑，組分如下，均為重量份：

實施例1經固體發酵培養制備的細度120目的黃綠木霉t-321010菌粉45份，甲基托布津(農藥市場購買)55份；

實施例5

一種農用復合劑，組分如下，均為重量份：

實施例1經固體發酵培養制備的原狀大小的黃綠木霉t-321010菌粉0.5份，農家肥99.5份；

實施例6

一種農用復合劑，組分如下，均為重量份：

實施例1經固體發酵培養制備的細度35目的黃綠木霉t-321010菌粉9.3份，黃腐酸鉀90.7份(購自山東創新腐植酸科技有限公司)；

對比例1

如實施例2所述的農用復合劑，不同之處在于，菌種為中國專利文獻cn102660627a(申請號201210112684.5)中所述的哈茨木霉菌t22。

對比例2

如實施例3所述的農用復合劑，不同之處在于，菌種為中國專利文獻cn102660627a(申請號201210112684.5)中所述的哈茨木霉菌t22。

對比例3

如實施例實施例4所述的農用復合劑，不同之處在于，菌種為中國專利文獻cn102660627a(申請號201210112684.5)中所述的哈茨木霉菌t22。

對比例4

如實施例實施例5所述的農用復合劑，不同之處在于，菌種為中國專利文獻cn102660627a(申請號201210112684.5)中所述的哈茨木霉菌t22。

對比例5

如實施例實施例6所述的農用復合劑，不同之處在于，菌種為中國專利文獻cn102660627a(申請號201210112684.5)中所述的哈茨木霉菌t22。

對比例6

如實施例2所述的農用復合劑，不同之處在于，將可溶性甲殼素替換為玉米纖維素(山東壽光巨能金玉米開發有限公司提供)。

對比例7

如實施例3所述的農用復合劑，不同之處在于，將豆粕替換為牛糞(山東大地乳業有限公司提供)。

對比例8

如實施例4所述的農用復合劑，不同之處在于，將甲基托布津替換為多菌靈。

對比例9

如實施例5所述的農用復合劑，不同之處在于，將農家肥替換為玉米秸稈。

對比例10

如實施例6所述的農用復合劑，不同之處在于，將黃腐酸鉀替換為硅藻土(購自青島三星硅藻土有限公司)。

實驗例1

實驗地塊為山東省壽光市日光溫室。參照cn102660627a生防菌株種質評價標準、黃瓜田間藥效試驗參照中華人民共和國國家標準農藥田間藥效試驗準則gb/t17980.144-2004。

測試樣品分別為實施例2制備的黃綠木霉t-321010農用復合劑、對比例1制得的農用復合劑、實施例1經固體發酵培養制備的細度35目的黃綠木霉t-321010菌粉和對比例6制得的農用復合劑，分別標記為檢測組、對比組1、對比組2和對比組3。

田間使用重量相同。

對育苗床處理，做黃瓜種育苗試驗，黃瓜苗移栽前將試驗基質進行穴施，移栽黃瓜。不同的配比劑具有以下結果：

表3、黃瓜出苗比較

表4、黃瓜生長比較

通過對檢測組和對比組1的數據比較可以看出，檢測組黃瓜出苗整齊，成苗率好，苗葉茂株壯，對黃瓜出苗和成苗作用明顯，分別比對比組1提高56.81％和8.24％，立枯病感病指數比對比組1降低31.24％，黃瓜單株干重比對比組1提高44.29％，黃瓜側根數比對比組1提高40.49％，開花時間更集中，花期比對比組1縮短6天，與對比組1相比防病效果更好。

通過對檢測組和對比組2的數據比較可以看出，檢測組較對比組2出苗率提高38％，利于黃瓜出苗，立枯病感病指數比對比組2降低50％，黃瓜單株干重比對比組2提高12.22％，黃瓜側根數比對比組1提高46.79％，開花時間集中，花期比對比組2縮短4天，防病效果提高7.68％。

通過對檢測組和對比組3的數據比較可以看出，檢測組比對比組3黃瓜出苗整齊、苗壯，成苗率，苗葉深綠色，出苗率、成苗率分別比對比組3提高81.58％和22.67％，立枯病感病指數比對比組3降低90.62％，黃瓜單株干重比對比組3提高274.07％，黃瓜側根數比對比組3提高47.74％，開花時間更集中，花期比對比組3縮短6天，與對比組3相比防病效果提高25.22％。

黃綠木霉t-321010與可溶性甲殼素配比，明顯促進黃瓜生長發育，促進側根發育，提高黃瓜防病能力。

實驗例2

實驗地塊為山東省壽光市日光溫室。參照cn102660627a生防菌株種質評價標準、番茄田間藥效試驗參照中華人民共和國國家標準農藥田間藥效試驗準則gb/t17980.144-2004。

測試樣品分別為實施例3制備的黃綠木霉t-321010農用復合劑、對比例2制得的農用復合劑、實施例1經固體發酵培養制備的原狀大小的黃綠木霉t-321010菌粉和對比例7制得的農用復合劑，分別標記為檢測組、對比組1、對比組2和對比組3。

番茄種植前20天，對復配生物肥作為基肥撒施，灌溉至耕層土壤相對含水量為55～60％，土壤發酵15～20d，番茄移栽。不同的配比劑具有以下結果：

表5、番茄果比較

通過對檢測組和對比組1的數據比較可以看出，檢測組番茄葉片綠色濃，棵壯，果大小均勻，成熟時間一致，單功能葉干重比對比組1提高23.75％，坐果數比對比組1提高10.81％，正常果數比對比組1提高42.31％。

通過對檢測組和對比組2的數據比較可以看出，檢測組番茄葉片綠色濃，棵壯，果大小均勻，成熟時間一致，單功能葉干重比對比組2提高40.76％，坐果數比對比組2提高20.59％，正常果數比對比組2提高8.82％。

通過對檢測組和對比組3的數據比較可以看出，檢測組番茄葉片綠色濃，棵壯，果大小均勻，成熟時間一致，單功能葉干重比對比組3提高104.83％，坐果數比對比組3提高24.24％，正常果數比對比組3提高37.04％。

黃綠木霉t-321010與豆粕配比，明顯促進番茄生長，調控發育，裂果、畸形果少，大果、小果少，每穗開花結果及成熟時間一致。

實驗例3

實驗地塊為山東省農業科學院試驗地。參照cn102660627a生防菌株種質評價標準、棉花田間藥效試驗參照中華人民共和國國家標準gb/t17980.92-2004。魯棉研18號，山東省棉花中心提供。

測試樣品分別為實施例4制備的黃綠木霉t-321010農用復合劑、對比例3制得的農用復合劑、實施例1經固體發酵培養制備的細度120目的黃綠木霉t-321010菌粉和對比例8制得的農用復合劑，分別標記為檢測組、對比組1、對比組2和對比組3。

將各種制劑穴施后種棉花，不同的配比劑具有以下結果：

表6、棉花防病比較

通過對檢測組和對比組1的數據比較可以看出，檢測組棉花生長旺盛，結鈴集中，吐絮好，葉面感病指數比對比組1降低14.45％，莖桿感病指數比對比組1降低12.39％，成株發病率比對比組1降低32.02％。

通過對檢測組和對比組2的數據比較可以看出，檢測組棉花生長旺盛，結鈴集中，吐絮好，葉面感病指數比對比組2降低28.12％，莖桿感病指數比對比組2降低21.74％，成株發病率比對比組2降低46.49％。

通過對檢測組和對比組3的數據比較可以看出，檢測組棉花生長旺盛，結鈴集中，吐絮好，葉面感病指數比對比組3降低48.75％，莖桿感病指數比對比組3降低45.60％，成株發病率比對比組3降低54.00％。

黃綠木霉t-321010與甲基托布津混合施用，明顯防治棉花黃枯萎病，而與多菌靈混合抑制木霉生長，降低了多菌靈藥效。

實驗例4

本實驗例地塊為山東省濟南市華山鎮。采用平板計數法，培養測定木霉定殖存活的數量。參照cn102660627a生防菌株種質評價標準。參照中華人民共和國國家標準殺菌劑防治小麥紋枯病gb/t17980.108-2004。

測試樣品分別為實施例5制備的黃綠木霉t-321010農用復合劑、對比例4制得的農用復合劑、實施例1經固體發酵培養制備的原狀大小的黃綠木霉t-321010菌粉和對比例9制得的農用復合劑，分別標記為檢測組、對比組1、對比組2和對比組3。

小麥種植前10d，按3000kg/hm²用量將黃綠木霉t-321010農用復合劑，施入耕層土壤，不同處理的耕層土壤進行取樣，測定各指標。結果如下：

表7、小麥田土壤性狀比較

通過對檢測組和對比組1的數據比較可以看出，小麥生長后期，檢測組黃綠木霉t-321010在土壤中存活量為1.24×10⁴cfu/g干土，比對比組1中的哈茨木霉菌t22提高24％，與對比組1相比水穩性團聚體、固氮菌、放線菌分別提高17.97％、23.18％、22.06％。

通過對檢測組和對比組2的數據比較可以看出，檢測組較對比組2土壤水穩性團聚體數量提高8.24％、土壤黃綠木霉t-321010種群數提高10.71％、土壤固氮菌、放線菌群落數提高8.5％和10.37％。

通過對檢測組和對比組3的數據比較可以看出，檢測組較對比組3土壤水穩性團聚體數量提高29.85％、土壤黃綠木霉t-321010種群數提高34.78％、土壤固氮菌、放線菌群落數提高37.76％和32.17％。

由以上數據可以看出，黃綠木霉t-321010菌株與農家肥復配后，農家肥比玉米秸稈好，為黃綠木霉t-321010菌株提供營養，利于木霉在土壤中快速定殖和增殖，黃綠木霉t-321010菌株對腐熟農家肥進行有機物再降解比降解玉米秸稈強，提高有機質的活性，增強有機質作用，增加土壤營養，改善土壤性狀。

實驗例5

本實驗地塊為山東省臨沂市莒南縣。參照cn102660627a生防菌株種質評價標準。觀察記錄花生出苗率、長勢、健康情況，參照中華人民共和國國家標準殺菌劑防治大豆根腐病gb/t17980.88-2004。

測試樣品分別為實施例6制備的黃綠木霉t-321010農用復合劑、對比例5制得的農用復合劑、實施例1經固體發酵培養制備的細度35目的黃綠木霉t-321010菌粉和對比例10制得的農用復合劑，分別標記為檢測組、對比組1、對比組2和對比組3。

花生種植時，按450kg/hm²用量將黃綠木霉t-321010農用復合劑施入耕層土壤，花生壟做，記錄花生農藝性狀。結果如表8所示：

表8花生生長發育比較

通過對檢測組和對比組1的數據比較可以看出，檢測組中黃綠木霉t-321010菌株促進了側根的生長和發育，根瘤菌著生多，果針入土深度增加，莢果飽滿，檢測組較對比組1花生病情指數比哈茨木霉菌t22降低38.41％，防治根結線蟲效果明顯，產量提高38.57％，花生的側根數、根瘤數、果針入土深度均大幅度提高，提高數量分別為60.56％、296.88％、14.04％。

通過對檢測組和對比組2的數據比較可以看出，檢測組較對比組2花生側根長提高23.36％，根瘤數提高115.25％，主莖高度增加22.73％，植株鮮重提高24.27％，雙莢果單穴粒重提高14.6％。

通過對檢測組和對比組3的數據比較可以看出，檢測組較對比組3花生側根數提高132.65％，根瘤數提高423.35％，主莖高度增加26.09％，果針入土深度提高24.25％，產量提高57.69％。

由以上數據可以看出，黃綠木霉t-321010分生孢子粉為微生物活體和有效殺菌成分，黃腐酸鉀、硅藻土作為載體促進木霉土壤中分散定殖，黃綠木霉t-321010菌株與黃腐酸鉀復配，黃腐酸具有螫合作用和絡合作用，能將難溶的金屬離子絡合或螫合，協調、促進植物根系或葉面對微量元素在體內的吸收、運轉，黃腐酸鉀添加后，利于花生吸收利用鉀及其他礦物質，提高花生抗病能力，促進木霉的增殖，同時木霉提高黃腐酸鉀的利用率，兩者混合增效作用顯著。

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<110>山東省農業科學院農產品研究所

<120>一株黃綠木霉t-321010菌株及其培養方法與應用

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