含4’-硫代修飾的核苷酸的核糖核酸及相關方法
【專利說明】含4' -硫代修飾的核苷酸的核糖核酸及相關方法
[0001] 本申請依據35U.S.C. § 119(e)要求2013年3月14日提交的美國專利申請號 61/785,098的權益，該案的內容通過引用并入本文中。
[0002] 背景
[0003] 本發明涉及包含4' -硫代修飾的核苷酸殘基的信使核糖核酸（mRNA)、包含這些 mRNA的組合物及其制備和使用方法。
[0004] 已經提出使用信使RNA的基因療法作為治療多種疾病的方法。先前已經報導過 引入信使RNA(mRNA)作為在宿主內產生蛋白質的一種手段的觀點。Yamam〇t〇，A.等人， Eur. J. Pharm. 71:484-489 (2009) ;Debus，H.等人，J. Control Rel. 148:334-343 (2010)。 然而，成功地施用mRNA以在體內產生蛋白質典型地需要對mRNA進行包裝（如使mRNA與 聚合物或脂質載體形成復合物）。參見例如，國際專利申請公開號WO 2011/06810和TO 2012/170930。施用未包裝的（裸）mRNA需要將化學修飾的核苷酸并入mRNA內以產生更穩 定并且更有益的治療劑。參見例如，MKormann等人，Nature Biotech. 29:154-159(2011); K.Kariko, Molecular Therapy 16(11):1833 - 1840(2008)〇
[0005] 施用編碼能夠在體內產生的治療性蛋白質的mRNA可以提供優于施用編碼該治療 性蛋白質的DNA以及直接施用該治療性蛋白質的顯著益處。然而，盡管編碼治療性蛋白質 的治療性mRNA的研發是藥物療法的一個頗具前景的進步，但此類治療的效用仍受到mRNA， 特別是編碼全長蛋白質的那些mRNA的體內弱穩定性的限制。
[0006] 明確地說，在基因替代療法中使用的mRNA的穩定性較弱會使得體內所編碼的治 療性蛋白質的產生不足或不太理想。在施用了編碼治療性蛋白質的mRNA之后，該mRNA可 能發生降解，例如在體內暴露于一種或多種核酸酶之后發生降解。核糖核酸酶（例如內切 核糖核酸酶和外切核糖核酸酶）是能夠催化RNA降解成較小組分并由此使mRNA無法產生 治療性蛋白質的一類核酸酶。因此，核酸酶（例如RNA酶）能夠縮短例如以合成方式制備 或重組制備的mRNA的循環半衰期。在核酸溶解降解之后，mRNA不能翻譯，并因此無法發揮 預期的治療益處，這會顯著降低mRNA基因療法的功效。
[0007] 概述
[0008] 本發明提供了一種改進的經過修飾的mRNA，用于更穩定、更穩固并且持續地在體 內產生蛋白質。本發明部分是基于認識到，用于在體內產生治療性蛋白質的mRNA的穩定性 可以通過并入核糖部分中的4'氧被硫取代的經過修飾的核糖核苷酸而得到進一步提高。 盡管先前 S. Hoshika 等人（Nuc. Ac. Res. Supp. 3:209-210 (2003))和 M. Takahashi, M.等人 (Nuc. Ac. Res. 37:1353-1362(2009))已經報導用硫取代核糖核苷酸的核糖部分中的4'氧， 但兩篇報導都涉及含4'-硫代殘基的至多15個殘基長的短合成RNA區段用于RNA干擾；也 已經報導包含4' -硫代修飾的核苷酸的具有19-21個殘基的短RNA用于RNA干擾（Dande 等人，J. Med. Chem. 49:1624-1634(2006))及適配體開發（長度達59個殘基；Hoshika等 人，Nuc. Ac. Res. 32:3815-3825 (2004) ;Kato 等人，Nuc. Ac. Res. 33:2942-2951 (2005); Minakawa 等人，Bioorg. Med. Chem. 16:9450-9456 (2008))。然而，這些報導都未預測將 4' -硫代核糖核苷酸并入全長mRNA( 即，編碼全長功能性治療性蛋白質并且任選地含有一 個或多個非編碼區的mRNA)中的作用，這種全長mRNA具有比現有技術中所測試的任何干擾 RNA或適配體長得多的長度，并且不是以均一的雙鏈體狀態存在，而且呈現的構象具有較大 非螺旋和/或單鏈組分。更重要的是，在本發明之前，尚不了解并入了 4'-硫代修飾的核苷 酸的mRNA是否能成功地用于在體內產生蛋白質。如本文（包括實施例）中所描述，本發明 人已經成功地合成了并入一個或多個4'-硫代修飾的核苷酸（例如，4'-硫代-ATP、4'_硫 代-UTP、4' -硫代-GTP和/或4' -硫代-CTP)的全長mRNA。盡管在mRNA的長度方面存 在問題，但本發明人能夠合成并入了多達100%的4' -硫代-ATP、100%的4' -硫代-UTP、 100%的4'-硫代-GTP和/或100%的4'-硫代-CTP的全長mRNA。如實施例中所示，此類 修飾的mRNA比未修飾的mRNA穩定，并且意外的是，此類廣泛修飾似乎不會影響修飾的mRNA 在體內有效翻譯的能力。
[0009] 因此，本發明提供了允許更好地控制例如mRNA的穩定性、免疫原性及翻譯效率的 mNRA，及包含這些mRNA和任選地載體的組合物，以及使用這些mRNA和組合物在體內誘導治 療性蛋白質的表達以治療疾病和/或病癥的方法。
[0010] 在一些實施方案中，本發明提供了一種具有編碼區和任選地一個或多個非編碼區 的mRNA分子，其中所述mRNA包含至少一個并入了 4'-硫代取代呋喃糖環的核苷酸殘基。在 一些實施方案中，提供的mRNA含有的核苷酸殘基中有至少約5 %、10 %、15 %、20 %、25 %、 30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、 97%、98%或99%并入了 4'-硫代取代呋喃糖環。在一些實施方案中，提供的mRNA含有的 核苷酸殘基中100%并入了 4' -硫代取代呋喃糖環。在一些實施方案中，提供的mRNA含 有多達約 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的4'-硫代4了？。在一些實 施方案中，提供的 mRNA 含有多達約 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的4'-硫代-UTP。在一些實施方案中，提供的mRNA含有多達約5%、10%、15%、20%、25%、 30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、 97 %、98 %、99 %或100 %的4' -硫代-GTP。在一些實施方案中，提供的mRNA含有多達 約 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的4'-硫代-〇?。在一些實施方案 中，提供的mRNA含有本文所描述的各種4' -硫代修飾的NTP的組合。
[0011] 在一些實施方案中，提供的mRNA包含非編碼區。在一些實施方案中，提供的mRNA 包含多聚腺苷酸尾和/或多聚尿苷酸尾。在一些實施方案中，提供的mRNA包含5'帽結構。
[0012] 在一些實施方案中，提供的mRNA另外包含至少一個非標準核苷酸殘基。在一些實 施方案中，所述至少一個非標準核苷酸殘基選自5-甲基-胞苷、假尿苷和2-硫代尿苷中 的一個或多個。在一些實施方案中，所述至少一個非標準核苷酸殘基并入了 4' -硫代呋喃 糖環。在一些實施方案中，多達 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的非標 準核苷酸殘基并入了 4' -硫代呋喃糖環。
[0013] 在一些實施方案中，提供的mRNA的長度是至少60個殘基。在一些實施方案中，提 供的mRNA的長度是至少約70個、約80個、約90個、約100個、約150個、約200個、約300 個、約400個、約500個、約1，OOO個、約1，500個、約2, OOO個、約2, 500個、約3, OOO個、約 3, 500個、約4, 000個、約4, 500個或約5, 000個殘基。
[0014] 本發明的其它實施方案提供了包含至少一個mRNA分子和載體的組合物，所述 mRNA分子具有編碼區和任選地一個或多個非編碼區，其中所述mRNA包含至少一個并入了 4' -硫代取代呋喃糖環的核苷酸殘基。在一些實施方案中，提供的組合物包含至少一個 mRNA和載體，所述mRNA具有編碼區和任選地一個或多個非編碼區，其中所述mRNA包含至 少一個并入了 4' -硫代取代呋喃糖環的核苷酸殘基，并且所述mRNA的長度是至少60個殘 基。在某些實施方案中，本發明的組合物包含至少一個mRNA分子，所述mRNA分子具有編碼 區和任選地一個或多個非編碼區，其中所述mRNA包含至少一個并入了 4'-硫代取代呋喃糖 環的核苷酸殘基，并且與基于聚合物的載體或脂質納米粒子形成復合物。
[0015] 本發明另外提供在體內產生治療性蛋白質的方法，所述方法包括向受試者施用至 少一個mRNA分子，或包含此類mRNA和載體的組合物，所述mRNA分子具有編碼區和任選地 一個或多個非編碼區，其中所述mRNA包含至少一個并入了 4'-硫代取代呋喃糖環的核苷酸 殘基。本發明還提供了治療需要治療性蛋白質的受試者的方法，所述方法包括施用至少一 個mRNA分子，或包含此類mRNA和載體的組合物，所述mRNA分子具有編碼區和任選地非編 碼區，其中所述mRNA包含至少一個并入了 4' -硫代取代呋喃糖環的核苷酸殘基。在一些 實施方案中，提供的方法中施用的mRNA是至少60個殘基長度。本文所描述的各種修飾的 mRNA可以用于產生治療性蛋白質或用于治療各種疾病、病癥或病況。
[0016] 在一些實施方案中，本發明提供了一種使用本文所描述的修飾的mRNA來產生蛋 白質的方法。這種產生蛋白質的方法可以用于體外無細胞系統、體外基于細胞的系統或體 內系統中。在各種實施方案中，適合的mRNA包含至少一個并入了 4'-硫代取代呋喃糖環的 核苷酸殘基。在一些實施方案中，適合的mRNA包含的核苷酸殘基（例如ATP、CTP、GTP、UTP， 和 / 或非標準 NTP)中有至少約 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 并入了 4'_硫代取代呋喃糖環。在一些實施方案中，提供的mRNA包含多聚腺苷酸尾和/或多聚尿 苷酸尾。在一些實施方案中，提供的mRNA的長度是至少60個殘基。
[0017] 在一些實施方案中，本發明提供了所提供的mRNA分子的用途，所述mRNA分子用于 制造能夠在體內產生治療性蛋白質的藥物。
[0018] 在一些其它實施方案中，本發明提供了一種用于制備所提供的mRNA的方法。在一 些其它實施方案中，本發明提供了一種用于在體外合成所提供的mRNA的方法。在一些其 它實施方案中，本發明提供了一種用于制備（例如在體外合成）所提供的mRNA的方法，所 述mRNA包含的核苷酸殘基（例如ATP、CTP、GTP、UTP，和/或非標準NTP)中有至少約5%、 10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、 85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%并入了4'-硫代取代呋喃糖環。在一些 實施方案中，本發明提供了一種用于制備（例如在體外合成）所提供的mRNA的方法，所述 mRNA的長度是至少約60個、約70個、約80個、約90個、約100個、約150個、約200個、約 300個、約400個、約500個、約1，000個、約1，500個、約2, 000個、約2, 500個、約3, 000 個、約3, 500個、約4, 000個、約4, 500個或約5, 000個殘基。
[0019] 本發明的其它目的和優勢將部分陳述于以下說明中，并且部分將從該說明易于了 解，或者可以通過本發明的實踐來學習。借助于所附權利要求書中特別指出的要素和組合， 將認識并獲得本發明的目的和優勢。
[0020] 應了解，前述大體說明和以下詳細說明都只是示例性和解釋性的，而不是對所要 求保護的發明的限制。附圖結合于本說明書中并構成本說明書的一部分，示出了本發明的 若干實施方案并且結合說明一起用于進一步解釋本發明的原理。
[0021] 附圖簡述
[0022] 這些圖只是用于說明而非限制性目的。
[0023] 圖1顯示了示例性4' -硫代RNA堿基的分子結構：4' -硫代-腺苷、4' -硫代-鳥 苷、4' -硫代-胞苷、4' -硫代-尿苷、4' -硫代-5-甲基-胞苷、4' -硫代-假尿苷及4' -硫 代-2-硫代尿苷。
[0024] 圖2顯示了在用修飾的FFL mRNA和未修飾的FFL mRNA轉染后，通過HEK 293T細 胞中FFL熒光素酶的產生進行的熒光素酶檢測。
[0025] 圖3顯示了有關修飾的FFL mRNA和未修飾的FFL mRNA的穩定性研究的結果。
[0026] 圖4顯示了在施用修飾的FFL mRNA和未修飾的FFL mRNA后，通過小鼠肝中FFL 熒光素酶的產生進行的熒光素酶檢測。
[0027] 發明詳述
[0028] 如本文中所使用，術語"mRNA"用于指包括編碼區和任選地非編碼區的修飾和/或 未修飾的RNA。術語"編碼區"是指mRNA中可以翻譯成氨基酸鏈（即，由肽鍵連接的兩個或 更多個氨基酸）的一部分或區域。氨基酸鏈又稱為肽或多肽，其可以折疊成蛋白質（例如， 治療性蛋白質）。術語"非編碼區"是指mRNA中典型地不被翻譯的一部分或區域。非編碼 區典型地包括5'非翻譯區和/或3'非翻譯區，包括但不限于，多聚腺苷酸尾或多聚尿苷酸 尾。
[0029] "非標準核堿基"是除天然堿基腺嘌呤（A)、胞嘧啶（C)、鳥嘌呤（G)、胸腺嘧啶（T) 或尿嘧啶（U)外的堿基部分。非標準核堿基是特定核堿基（A、C、G、T或U)的類似物，其在 核酸雙螺旋中的堿基配對特性以及在核酸雙螺旋（包括局部RNA-DNA螺旋，如在RNA聚合 酶轉錄DNA模板期間形成的RNA-DNA螺旋）中通過DNA或RNA聚合酶并入的位點與先前所 列的五個核堿基之一極其類似，不過T的類似物一般也會是U的類似物，并且反之亦然。結 合術語包括但不限于"核苷"、"堿基"、"核苷酸"或"殘基"的術語使用的術語"非標準"應與 該術語結合"核堿基"使用時相同的方式解釋。
[0030] 如本文中所使用，術語"治療性蛋白質"包括在施用給受試者時會對受試者的健康 和幸福提供有益作用的任何蛋白質。在一些實施方案中，受試者體內該蛋白質的缺陷、缺乏 或異常表達引起疾病或病況。"治療性蛋白質"還可以指并非通常存在或并非通常以足量存 在于受試者體內以實現希望的治療作用的蛋白質。
[0031] 如本文中所使用，術語"輔助脂"是指包括膽固醇在內的任何中性或兩性離子型脂 質材料。不希望受特定理論束縛，輔助脂可以使脂質雙層/納米粒子內的穩定性、剛性和/ 或流動性增加。
[0032] 本發明的mRNA采用了特定的化學修飾的堿基取代入信使核糖核酸分子中以在施 用給受試者后增強該信使核糖核酸分子的生物特性，在所述化學修飾的堿基中，核苷酸殘 基的核糖部分中的4'氧被硫置換。圖1中描繪了用于并入本發明的mRNA中的示例性4'-硫 代修飾的核苷酸殘基（顯示了含有硫代取代呋喃糖環的修飾的核苷酸殘基）。在一些實施 方案中，呋喃糖環的4'-硫代修飾改善了對外切核酸酶、內切核酸酶和/或人血清中的其它 RNA降解酶的抗性。這種穩定性可以使RNA的半衰期增加。因此，舉例來說，施用在呋喃糖 環中具有4'-硫代修飾的mRNA或包含此類mRNA的組合物引起細胞對具有改善的生物特性 (例如半衰期增加）的mRNA的吸收，而這又促成體內蛋白質產生的增加。
[0033] 在某些實施方案中，RNA中至少1 %的腺苷核苷酸殘基在呋喃糖環中具有4' -硫 代修飾。舉例來說，mRNA 中約 1-5%、5-15%、15-30%、30-50%、50-75%、75-90%、90-99% 或99-100%的腺苷可以是4' -硫代-腺苷。
[0034] 在一些實施方案中，mRNA中至少約1%、約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、 約 30%、約 35%、約 40%、約 45%、約 50%、約 55%、約 60%、約 65%、約 70%、約 75%、約 80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%的腺苷殘基是4' -硫 代-腺苷。在一些實施方案中，mRNA中約100%的腺苷殘基是4' -硫代-腺苷。
[0035] 在某些實施方案中，RNA中至少1%的鳥苷核苷酸殘基在呋喃糖環中具有4' -硫 代修飾。舉例來說，mRNA 中約 1-5%、5-15%、15-30%、30-50%、50-75%、75-90%、90-99% 或99-100%的鳥苷可以是4' -硫代-鳥苷。
[0036] 在一些實施方案中，mRNA中至少約1%、約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、 約 30%、約 35%、約 40%、約 45%、約 50%、約 55%、約 60%、約 65%、約 70%、約 75%、約 80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%的鳥苷殘基是4' -硫 代-鳥苷。在一些實施方案中，mRNA中約100%的鳥苷殘基是4' -硫代-鳥苷。
[0037] 在某些實施方案中，RNA中至少1 %的尿苷核苷酸殘基在呋喃糖環中具有4' -硫 代修飾。舉例來說，mRNA 中約 1-5%、5-15%、15-30%、30-50%、50-75%、75-90%、90-99% 或99-100%的尿苷可以是4' -硫代尿苷。
[0038] 在一些實施方案中，mRNA中至少約1%、約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、 約 30%、約 35%、約 40%、約 45%、約 50%、約 55%、約 60%、約 65%、約 70%、約 75%、約 80 %、約85 %、約90 %、約95 %、約96 %、約97 %、約98 %或約99 %的尿苷殘基是4' -硫 代-尿苷。在一些實施方案中，mRNA中約100%的尿苷殘基是4' -硫代-尿苷。
[0039] 在某些實施方案中，RNA中至少1 %的胞苷核苷酸殘基在呋喃糖環中具有4' -硫 代修飾。舉例來說，mRNA 中約 1-5%、5-15%、15-30%、30-50%、50-75%、75-90%、90-99% 或99-100%的胞苷可以是4' -硫代-胞苷。
[0040] 在一些實施方案中，mRNA中至少約1%、約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、 約 30%、約 35%、約 40%、約 45%、約 50%、約 55%、約 60%、約 65%、約 70%、約 75%、約 80 %、約85 %、約90 %、約95 %、約96 %、約97 %、約98 %或約99 %的胞苷殘基是4' -硫 代-胞苷。在一些實施方案中，mRNA中約100%的胞苷殘基是4' -硫代-胞苷。
[0041] 在一些實施方案中，提供的mRNA中的每個4' -硫代修飾的核苷酸都是4' -硫 代-尿苷。在一些實施方案中，提供的mRNA中的每個4' -硫代修飾的核苷酸都是4' -硫 代-胞苷。在一些實施方案中，提供的mRNA中的每個4' -硫代修飾的核苷酸獨立地是 4' -硫代-尿苷或4' -硫代-胞苷。在一些實施方案中，提供的mRNA包含至少5、10、15、 20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、