一種優化的發酵高產幾丁質酶的方法
【專利摘要】本發明提供了一種優化的發酵高產幾丁質酶的方法，是以已2009年11月30日保藏于中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心保藏編號為CGMCC3483一株高產幾丁質酶的Chitinolyticbacter?meiyuanensis?SYBC-H1菌株為發酵出發菌株，并采用我們優化的種子培養基配方和產酶培養基配方及優化的發酵生產幾丁質酶的方法來發酵高產幾丁質酶，發酵制備的幾丁質酶酶活最高可達10U/ml以上，所制備的酶可高效水解幾丁質，生成N-乙酰-D-氨基葡萄糖，可廣泛用于化工、醫藥、食品、材料、染料等領域，屬于生物【技術領域】。
【專利說明】一種優化的發酵高產幾丁質酶的方法
【技術領域】[0001]本發明提供了一種優化的發酵高產幾丁質酶的方法，是以已2009年11月30日保藏于中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心保藏編號為CGMCC3483 —株高產幾丁質酶的Chitinolyticbacter meiyuanensis SYBC-Hl菌株為發酵出發菌株，并采用我們優化的種子培養基配方和產酶培養基配方及優化的發酵生產幾丁質酶的方法來發酵高產幾丁質酶，發酵制備的幾丁質酶酶活最高可達10U/ml以上，所制備的酶可高效水解幾丁質，生成N-こ酰-D-氨基葡萄糖，可廣泛用于化工、醫藥、食品、材料、染料等領域，屬于生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002]幾丁質酶可高效降解幾丁質，生成N-こ酰-D-氨基葡萄糖。而N-こ酰-D-氨基葡萄糖是生物細胞內許多重要多糖的基本組成單位，尤其在甲殼類動物的外骨骼含量最高。它是合成雙歧因子的重要前體，在生物體內具有許多重要生理功能。臨床上用于治療風濕性及類風濕性關節炎。也可以作為食品抗氧化劑及嬰幼兒食品添加剤，糖尿病患者甜味劑。主要用于臨床增強人體免疫系統的功能，抑制癌細胞或纖維細胞的過度生長，對癌癥和惡性腫癌起到抑制和治療作用；對于各種炎癥，能起到有效的治療，對骨關節炎及關節疼痛也有治療作用。
[0003]幾丁質酶的價格極為昂貴，如日本的chitin T-1幾丁質酶市價為每50毫克20000日元，由于幾丁質酶具有廣闊的應用前景和極高的經濟開發價值，世界上一些發達國家都在進行生物技術生產幾丁質酶的研究。因此，我們以保藏于中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC3483 —株產幾丁質酶的菌株Chitinolyticbactermeiyuanensis SYBC-Hl為出發菌株對該菌株的種子培養基配方和產酶培養基配方進行優化探索研究，使其形成優化的發酵生產幾丁質酶的方法。
【發明內容】
[0004]本發明以保藏于中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心(地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所)，保藏編號為CGMCC3483的一株產幾丁質酶菌株Chitinolyticbacter meiyuanensisSYBC-HI為出發菌株，對該菌株的種子培養基配方和產酶培養基配方進行優化探索研究，使其形成優化的發酵生產幾丁質酶的方法，所制備的酶可高效水解幾丁質，生成N-こ酰-D-氨基葡萄糖，可廣泛用于化工、醫藥、食品、材料、染料等領域，來替代價格昂貴的進ロ的幾丁質酶。
[0005]本發明的技術方案:以保藏于中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，保藏編號 CGMCC3483 —株產幾丁質酶菌株 Chitinolyticbacter meiyiyuanensisSYBC-HI 為出發菌株，對該菌株的種子培養基配方和產酶培養基配方進行優化探索研究，使其形成優化的發酵生產幾丁質酶的方法，エ藝為:
[0006](I)種子培養[0007]種子培養基:磷酸二氫鉀0.75g/L，磷酸氫二鉀0.32g/L，硫酸鎂0.55g/L，七水硫酸亞鐵0.02g/L,酵母浸出物4.2g/L，葡萄糖3g/L，蛋白胨4.2g/L。
[0008]挑經過活化的產幾丁質酶菌落二環接種到盛有50ml種子培養基的250ml三角瓶中進行培養。培養條件:pH值:7.0，溫度:30°C，搖床轉速200rpm，培養時間:12h，即為發酵種子液。
[0009](2)產酶培養
[0010]產酶培養基:果糖3.2g/L，玉米漿粉12g/L，磷酸二氫鉀0.8g/L，磷酸氫二鉀0.4g/L,硫酸鎂0.5g/L，七水硫酸亞鐵0.02g/L,幾丁質粉粒1.5g/L。
[0011]以5%接種量，將發酵種子液250ml加入到含有5升產酶培養基的7L發酵罐中。發酵產酶條件:pH:7.5，溫度:30°C，發酵時間:75小時，轉速:400prm，通氣量:1.5L/min/
し
[0012](3)酶液提取及酶活力測定
[0013]發酵結束后，將發酵液用冷凍離心機離心，離心條件:6000rpm、4°C、10min，離心
后，取上清液即為幾丁質酶液，用酶活力測定方法測定酶活力。
[0014](4)酶活的測定方法
[0015]取0.5ml上清液，加入pH = 6.5的Iml0.1M醋酸-醋酸鈉緩沖液，0.5ml0.5%的膠體幾丁質(W/V)，37°C保溫30min，取出后加入DNS試劑0.5ml，沸水浴IOmin后，迅速用冰水冷至室溫，6000rpm離心8min, 530nm處比色,重復三次,取平均值作試驗結果，同時以高溫滅活的上清液同樣處理作為對照，最后以OD53tl的平均值來計算還原糖的含量，計算出酶活。酶活力定義為在上述條件下毎分鐘釋放相當于lmmol NAG所需要的酶量為ー個酶活單位⑶。
[0016]本發明的有益效果
[0017]提供了優化的種子培養基配方和產酶培養基配方及優化的發酵生產幾丁質酶的方法。與其他制備幾丁質酶方法相比較，具有酶活力高，發酵技術簡便和成本低的優點，且生產的幾丁質酶可高效水解幾丁質，因此，本發明有著廣泛的エ業使用價值和顯著的經濟效益前景。
【具體實施方式】
[0018]實施例1
[0019]種子培養基:磷酸二氫鉀0.75g/L，磷酸氫二鉀0.32g/L，硫酸鎂0.55g/L，七水硫酸亞鐵0.02g/L,酵母浸出物4.2g/L，葡萄糖3g/L，蛋白胨4.2g/L。
[0020]挑經過活化的產幾丁質酶菌落二環接種到盛有50ml種子培養基的250ml三角瓶中進行培養。培養條件:pH值:7.0，溫 度:30°C，搖床轉速200rpm，培養時間:12h，即為發酵種子液。
[0021]產酶培養基:果糖3.2g/L，玉米漿粉12g/L，磷酸二氫鉀0.8g/L，磷酸氫二鉀0.4g/L,硫酸鎂0.5g/L，七水硫酸亞鐵0.02g/L,幾丁質粉粒1.5g/L。
[0022]以5%接種量，將發酵種子液250ml加入到含有5升產酶培養基的7L發酵罐中。發酵產酶條件:pH:7.5，溫度:30°C，發酵時間:75小時，轉速:400prm，通氣量:1.5L/min/L。
[0023]發酵結束后，將發酵液用冷凍離心機離心，離心條件:6000rpm、4°C、10min，離心后，取上清液即為幾丁質酶液，用酶活力測定方法測定酶活力為10.21U/ml。
【權利要求】
1.一種優化的發酵高產幾丁質酶的方法，其特征在于:用已保藏于中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC3483，保藏日期為2009年11月30日的一株高產幾丁質酶的菌株Chitinolyticbacter meiyuanensis SYBC-H1為出發菌株,對該菌株的種子培養基配方和產酶培養基配方進行優化研究，形成優化的發酵生產幾丁質酶的方法，エ藝為: (1)種子培養 種子培養基:磷酸二氫鉀0.75g/L，磷酸氫二鉀0.32g/L，硫酸鎂0.55g/L，七水硫酸亞鐵0.02g/L,酵母浸出物4.2g/L，葡萄糖3g/L，蛋白胨4.2g/L ； 挑經過活化的產幾丁質酶菌落二環接種到盛有50ml種子培養基的250ml三角瓶中進行培養。培養條件=PH值:7.0，溫度:30°C，搖床轉速200rpm，培養時間:12h，即為發酵種子液； (2)產酶培養 產酶培養基:果糖3.2g/L，玉米漿粉12g/L，磷酸二氫鉀0.8g/L，磷酸氫二鉀0.4g/L，硫酸鎂0.5g/L，七水硫酸亞鐵0.02g/L,幾丁質粉粒1.5g/L ； 以5%接種量，將發酵種子 液250ml加入到含有5升產酶培養基的7L發酵罐中。發酵產酶條件:pH:7.5，溫度:30°C，發酵時間:75小時，轉速:400prm，通氣量:1.5L/min/L ； (3)酶液提取及酶活力測定 發酵結束后，將發酵液用冷凍離心機離心，離心條件:6000rpm、4°C、10min，離心后，取上清液即為幾丁質酶液，用酶活力測定方法測定酶活力； (4)酶活的測定方法 取0.5ml上清液，加入pH = 6.5的Iml 0.1M醋酸-醋酸鈉緩沖液，0.5ml0.5%的膠體幾丁質，37°C保溫30min，取出后加入DNS試劑0.5ml，沸水浴IOmin后，迅速用冰水冷至室溫,6000rpm離心8min, 530nm處比色,重復三次,取平均值作試驗結果，同時以高溫滅活的上清液同樣處理作為對照，最后以OD53tl的平均值來計算還原糖的含量，計算出酶活。酶活力定義為在上述條件下毎分鐘釋放相當于lmmol NAG所需要的酶量為一個酶活単位。
【文檔編號】C12R1/01GK103571810SQ201210278062
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2012年8月7日 優先權日:2012年8月7日
【發明者】張明, 李洪兵, 張峰 申請人:湖南鴻鷹生物科技有限公司