基于基因沉默技術的舞毒蛾幾丁質酶基因及dsRNA的制作方法
【專利摘要】本發明提供一種昆蟲幾丁質酶5基因的基因片段及其dsRNA的應用，通過對舞毒蛾幾丁質酶5基因的克隆和測序，得到核苷酸序列為SEQIDNO：1的全長幾丁質酶5基因，從中選出序列為SEQIDNO：2的幾丁質酶5基因片段，用于dsRNA的合成。將上述dsRNA注入舞毒蛾的體腔后，舞毒蛾因蛻皮困難死亡。為安全無公害的害蟲防治方法的研制提供新的途徑。
【專利說明】基于基因沉默技術的舞毒蛾幾丁質酶基因及dsRNA
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，具體涉及基于基因沉默技術的舞毒蛾致死基因片段Chitinase5及其dsRNA和dsRNA在致死害蟲中的應用。
【背景技術】
[0002]在我國，化學藥劑連續單一長期使用已導致昆蟲對多種農藥產生了不同程度的抗藥性，例如，對于害蟲舞毒蛾需要不斷加大農藥使用量才能達到滿意的防治效果，造成了更為嚴重的環境污染，形成惡性循環。另外，舞毒蛾還會影響人類健康，當人們直接接觸舞毒蛾時，常會發生紅腫發癢現象，嚴重者甚至產生皮疹。因此，在農業生產實踐中，急需化學農藥之外的替代防治手段。
[0003]RNA干擾(RNA interference, RNAi )是一種由雙鏈RNA介導的基因沉默現象，雙鏈RNA最終被加工成大小約為22nt的小RNA (siRNA)，通過序列配對的方式與蛋白編碼基因結合，根據序列配對的程度降解靶標基因mRNA或抑制基因的蛋白翻譯過程。RNAi廣泛地存在于真菌、植物和動物中。2006年Andre Fire和Craig Mello因發現RNAi現象被授予諾貝爾醫學與生理獎。
[0004]在生物體中，一些重要的基因對維持生命是必須的。因此，從理論上而言，如果利用RNA干擾技術將農業害蟲中重要基因的表達進行干擾，則會引起害蟲的致畸或致死，從而達到控制害蟲的目的。
[0005]幾丁質降解和代謝是昆蟲等節肢動物體內特有的生物學現象，由于人類和其他高等動物體內不含幾丁質，因此昆蟲幾丁質降解系統已被公認為新型殺蟲劑作用的靶標。幾丁質酶在昆蟲幾丁質的降解過程中起著關鍵作用，采用RNA干擾技術，開展幾丁質酶dsRNA在害蟲防治中的應用具有重要意義。
【發明內容】
[0006]本發明的目的提供一種昆蟲舞毒蛾的幾丁質酶5基因和其致死基因片段，由該基因片段合成的dsRNA和dsRNA在致死害蟲舞毒蛾中的應用。
[0007]本發明是采用如下技術方案實現的:
一種舞毒蛾的幾丁質酶5基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；是通過設計昆蟲幾丁質酶的簡并引物后，PCR擴增獲得其保守區，通過RACE-PCR擴增獲得全長，命名為LdCHT5。其全長為1895bp，其中可讀框1737bp，編碼578個氨基酸，5丨-UTR和3丨-UTR的長度分別為42bp和116bp。
[0008]上述舞毒蛾的幾丁質酶5基因的致死片段，其核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示，是根據SEQ ID NO:1設計上游引物SEQ ID NO:3和下游引物SEQ ID NO:4，經PCR擴增獲得。
[0009]進一步利用相關試劑盒，根據舞毒蛾的幾丁質酶5基因致死片段合成dsRNA。
[0010]dsRNA在致死害蟲中的應用:注射dsRNA到舞毒蛾的預蛹期幼蟲體腔，結果表明:在昆蟲體內，dsRNA可以特異性的沉默幾丁質酶5基因的mRNA表達，致使舞毒蛾因蛻皮困難死亡。
[0011]本發明設計合理，獲得了舞毒蛾的幾丁質酶5基因的致死基因片段，及由該基因片段合成的dsRNA，提供了針對害蟲舞毒蛾的一種生物學防治方法，有望減少農藥的大量使用，保護環境，降低生產成本，提高經濟收益，具有市場應用前景。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0012]圖1表示預蛹期舞毒蛾幼蟲注射dsRNA后對其生長發育的影響。注射dsRNA的實驗組(圖中A、B)出現蛻皮困難無法化為成蟲而死亡的表型，注射DEPC處理水的對照組(圖中C、D)發育正常。
【具體實施方式】
[0013]實施例1
舞毒蛾幾丁質酶5基因全長的獲得方法如下:
(1)、PCR引物的設計
根據已知的昆蟲幾丁質酶5的氨基酸保守序列，設計了如下簡并性引物如下:
上游引物:CHT5F 5’ -GAYTGGGAGTACCCHGG-3’，
下游引物:CHT5R 5’-TCCATRTCRATRGCCCA-3’ ；
(2)、舞毒蛾幾丁質酶5基因RACE引物的設計基于上述得到的片段設計引物如下:
5’ RACE 上游引物:5’ - CGCTACGTAACGGCATGACAGTG(C) 16-3’
5’ RACE 下游引物:5’ - GGTGTACGGAGCAGGATCGCCACC-3’
3’ RACE 上游引物:5’ - GCTGGATGCTATCCACGTGATGTCG-3’
3’ RACE 下游引物:5’ - CGCTACGTAACGGCATGACAGTG(T) 18-3’
所有引物均由上海英濰捷基生物有限公司合成。
[0014](3)舞毒蛾總RNA的獲得
選取大小一致的舞毒蛾4齡幼蟲，3頭一組，冷凍于液氮中，待提取總RNA，提取總RNA的具體操作步驟按照TaKaRa的Trizol試劑盒。
[0015](4)、舞毒蛾cDNA第一鏈的合成
cDNA 第一鏈的合成的操作步驟參照 PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNAEraser試齊[J盒。
[0016](5)、PCR 擴增
以上述cDNA第一鏈為模板，根據Taq酶(TIANGEN)說明書進行PCR擴增，將所擴增的片段進一步克隆、測序。
[0017](6)序列分析
利用ExPASy分析所獲得的序列，并在NCBI網站中使用BLAST功能進行序列同源性比對，確定所獲得的基因片段為舞毒蛾幾丁質酶5基因。
[0018]上述舞毒蛾的幾丁質酶5基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0019]實施例2
舞毒蛾幾丁質酶5基因致死片段的獲得方法如下: 根據實施例1獲得的舞毒蛾幾丁質酶5基因的核苷酸序列,采用primerpremier5.0軟件設計特異性的引物，上游引物序列為SEQ ID NO:3，下游引物序列為SEQ ID N0:4，所有引物均由上海英濰捷基生物有限公司合成；其中，上游引物和下游引物需要針對實施例1獲得的舞毒蛾幾丁質酶5基因的核苷酸序列進行設計， 申請人:經過對多個上下游引物設計和多個基因片段的認真篩選后，才最終確定了具有實際應用效果的致死基因片段。
[0020]將成功連接實施例1獲得的舞毒蛾幾丁質酶5基因的重組pEASY-Tl質粒做為模板，PCR擴增獲得舞毒蛾幾丁質酶5基因致死片段，使用MicroElute Cycle Pure Kit(OMEGA)試劑盒進行純化。
[0021]上述舞毒蛾的幾丁質酶5基因致死片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0022]實施例3
舞毒蛾幾丁質酶5基因致死片段的dsRNA的獲得
用實施例2獲得的幾丁質酶5基因致死片段，按照T7RiboMAX Express RNAi System(Promega)試劑盒說明書，體外轉錄合成dsRNA。得到的dsRNA用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其單一性，用酶標儀(Thermo Scientific Multiskan GO, Thermo Fisher Scientific,USA)檢測其濃度，并濃縮至終濃度Ιμ8/μ?保存至-80°c備用。
[0023]實施例4
dsRNA在致死害蟲舞毒蛾中的應用如下:
舞毒蛾幾丁質酶5基因致死片段的dsRNA的致死舞毒蛾實驗
(I)舞毒蛾幾丁質酶5基因片段的dsRNA注射
選取預蛹期幼蟲用于注射上述合成的dsRNA。5ul規格的微量注射器用于注射，注射時不可用力過大，側腹部作為注射點，注意避開氣門。注射dsRNA的量為5Pg，并設置注射等量的DEPC處理的水的對照組，實驗組和對照組各20頭。注射完畢后，將幼蟲放置于生化培養箱中用購自中國林科院森林生態環境與保護研究所進行飼養(光照:黑暗時間=16h:8h，溫度 26±1°C，濕度 70%)。
[0024](2)、注入dsRNA后舞毒蛾表型的觀察
幼蟲注射完畢后繼續飼養，并及時地觀察。注射dsRNA舞毒蛾的實驗組有部分幼蟲因無法蛻蛹化為成蟲而死亡。
[0025](3)、注入dsRNA后舞毒蛾死亡情況的觀察
注射dsRNA的舞毒蛾實驗組死亡率為25%，這與注射DEPC處理的對照組(死亡率為
1.67%)相比，致死效果明顯。
【權利要求】
1.一種舞毒蛾的幾丁質酶5基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
2.—種舞毒蛾的幾丁質酶5基因致死片段，其核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
3.—種權利要求1所述的舞毒蛾的幾丁質酶5基因的獲得方法，其特征在于:包括如下步驟: (1)、PCR引物的設計 根據已知的昆蟲幾丁質酶5的氨基酸保守序列，設計了如下簡并性引物如下: 上游引物:CHT5F 5’ -GAYTGGGAGTACCCHGG-3’， 下游引物:CHT5R 5’-TCCATRTCRATRGCCCA-3’ ； (2)、舞毒蛾幾丁質酶5基因RACE引物的設計 基于上述得到的片段設計引物如下:
5’ RACE 上游引物:5’ - CGCTACGTAACGGCATGACAGTG (C) 16-3’
5’ RACE 下游引物:5’ - GGTGTACGGAGCAGGATCGCCACC-3’
3’ RACE 上游引物:5’ - GCTGGATGCTATCCACGTGATGTCG-3’
3’ RACE 下游引物:5’ - CGCTACGTAACGGCATGACAGTG(T) 18-3’ (3)、舞毒蛾總RNA的獲得 提取總RNA的具體操作步驟按照TaKaRa的Trizol試劑盒； (4)、舞毒蛾cDNA第一鏈的合成 cDNA 第一鏈的合成的操作步驟參照 PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNAEraser試齊[J盒； (5)、PCR擴增 以上述cDNA第一鏈為模板，根據Taq酶說明書進行PCR擴增，將所擴增的片段進一步克隆、測序； (6)、序列分析 利用ExPASy分析所獲得的序列，并在NCBI網站中使用BLAST功能進行序列同源性比對，確定所獲得的基因片段為舞毒蛾幾丁質酶5基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
4.一種權利要求2所述的舞毒蛾的幾丁質酶5基因致死片段的獲得方法，其特征在于:包括如下步驟: 根據權利要求3獲得的舞毒蛾幾丁質酶5基因的核苷酸序列，設計上游引物序列為SEQID NO:3，下游引物序列為SEQ ID NO:4 ;將成功連接權利要求3獲得的舞毒蛾幾丁質酶5基因的重組pEASY-Tl質粒做為模板，PCR擴增獲得幾丁質酶5基因致死片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，使用MicroElute Cycle Pure Kit試劑盒進行純化。
5.一種根據權利要求2所述的昆蟲幾丁質酶5基因致死片段合成的dsRNA。
6.權利要求5所述的利用舞毒蛾幾丁質酶5基因致死片段合成的dsRNA在致死害蟲舞毒蛾中的應用。
【文檔編號】C12N15/56GK104293810SQ201410439310
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月1日 優先權日:2014年9月1日
【發明者】范曉軍, 張建棟, 趙秋勇, 張常, 劉建紅, 糜艷霞 申請人:太原理工大學