一種利用液相芯片同時檢測五種食源性致病菌的基因探針及檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及農副產品安全檢測技術領域，具體設及一種利用液相忍片同時檢測五 種食源性致病菌的引物及檢測方法。
【背景技術】
[0002] 世界衛生組織（WHO)將食源性疾病定義為通過食物進入人體內的各種致病因子 引起的感染或中毒。根據WK)的估計，全球每年食源性疾病患者達數十億人，導致約300萬 5歲W下兒童死亡。發達國家平均每年有1/3的人群感染食源性疾病，在發展中國家，估計 每年腹瀉及相關疾病有217億病例，導致240萬5歲W下兒童死亡，造成巨大的健康危害 和經濟負擔。九種食源性病原體包括空腸彎曲菌、產氣芙膜梭狀芽胞桿菌、出血性大腸桿菌 0157 :H7、單核細胞增多性李斯特菌、沙口氏菌、金黃色葡萄球菌、圓抱子蟲、隱抱子蟲。
[0003] 據WK)統計，在全球發生的食源性疾病中，其中約70%是因生物源性污染食品所 致，主要是由致病菌引起的腹瀉、食物中毒等。沙口氏菌是全球報道最多的、各國公認的食 源性疾病首要致病菌，廣泛發生于家庭、學校、公共餐飲單位及醫院。近幾年，空腸彎曲菌引 起疾病的危險性在國際范圍內受到廣泛關注，很多發達國家，如美國、丹麥、芬蘭、愛爾蘭、 荷蘭、挪威、瑞典、瑞±和英國等，都有空腸彎曲菌病流行的報道。同時沙口氏菌多重耐藥菌 株的出現，空腸彎曲菌，大腸桿菌0157 :H7,單增李斯特菌和阪崎桿菌等新的食源性致病菌 導致的食品安全事件在全球范圍內屢屢發生。
[0004] 當前我國食品安全形勢十分不樂觀，1992-2005年國家食源性疾病監測網上報的 7669起食源性疾病爆發事件中，患病人數20余萬人。微生物引起的食源性疾病事件和設及 人數最多，分別占總體的38. 5% -47. 5%和50. 9% -71. 0%。衛生部發布的2001-2006年 食物中毒公告顯示，微生物性危害導致的中毒人數占總中毒人數的51. 33%，大約是化學性 危害導致中毒人數的2. 2倍。細菌性中毒約為化學性及有毒動植物性中毒的3倍。從2010 年起，食源性致病微生物在餐飲服務環節的污染狀況已被作為餐飲服務食品安全調查與評 價的主要內容。2010年，國家藥監局組織對全國18個省（自治區、直轄市）餐飲服務環節 涼拌菜和5個省（自治區、直轄市）餐飲服務環節生食水產品及其加工制作過程中的主要 致病性微生物進行全程調查與評價，結果顯示：致病微生物污染是餐飲服務環節加工制作 過程中產生食品安全風險的主要來源之一，從食品原料、加工過程、餐飲具各環節均有可能 帶入致病微生物污染餐飲食品，增加食品安全風險。
[0005] 目前實驗室用于食源性致病菌的檢驗方法可分為兩大類：傳統的細菌學方法和分 子生物學方法。傳統的細菌學診斷方法是先對標本進行細菌培養和生化鑒定，然后再對挑 出的可疑細菌進行血清學檢測，雖然是致病菌檢測的"金標準"，但存在繁瑣、費時、陽性率 低等缺點，很難適應公共衛生事件應急處理快速反應的需要。用于食源性致病菌檢測的分 子生物學方法有化ISA、多重PCR、巧光PCR、基于PCR的R化P和SSCP技術、固相基因忍片等， 雖然已廣泛用于食源性病原體的檢測，但仍存在不少問題。ELISA方法一次只能檢測一種病 原體或毒性蛋白，且有假陽性和假陰性的風險；PCR方法一般也僅能檢測4種W下的目的基 因；固相基因忍片可W實現高通量的檢測，但其成本過高，其結果也還不夠穩定可靠。鑒于 食源性致病菌是食品安全的主要問題，發展新的快速檢測與鑒定食源性致病菌的方法，特 別是能同時檢測多種致病菌的檢測方法，是及時有效地預防和控制食源性疾病的關鍵。而 唯一被美國食品及藥品管理局（抑A)批準用于臨床診斷的生物忍片一一液相忍片，可W滿 足W上要求。
[0006] 液相忍片技術是20世紀90年代中期發展起來的，被譽為后基因組時代的忍片技 術，也被稱為xMAP技術。它是集流式細胞技術、激光技術、數字信號處理技術及傳統化學技 術為一體的新型生物分子檢測技術。基于xMAP技術，美國Luminex公司于1999年推出第 1代LuminexlOO液相忍片檢測系統，2005年推出第2代Luminex200液相忍片檢測系統，后 者被美國FDA批準用于臨床診斷。液相忍片技術具有高通量和高效性的特點，可W同時對 1個樣本中的100種不同目的分子進行檢測，并能在30分鐘內檢測96個不同樣本。
[0007] Luminex液相忍片的技術原理是基于標記有不同巧光染料的直徑5. 6ym聚苯乙 締微球，每一種巧光微球都有一個獨特的編號，LuminexlOO/200技術在微球中加入2種不 同巧光素，根據巧光素的比例不同將微球分為1~100號。不同的巧光微球表面可帶有不同 的基團（如簇基、親合素和組氨酸等），共價結合不同類型的探針，如蛋白探針和核酸探針。 將共價結合有不同探針分子的不同巧光信號的微球懸浮于一個液相體系中，加入待測分子 與其充分反應，再加入標記有另一種巧光信號（一般為綠色巧光染料）的報告分子，就構成 了一個液相忍片反應系統。在檢測過程中，結合流式細胞技術和激光技術使微球逐個通過 特制的檢測通道。檢測系統內置有激光發射器用于發射兩束不同波長的激光，一束紅色激 光激發微球本身的巧光，用于鑒別微球的種類；另一束綠色激光激發報告分子結合的巧光， 通過檢測巧光的強度對被測物質進行定量分析。
[0008] 由此可見，利用LuminexxMAP液相忍片系統和菌株庫菌種資源，根據食源性疾病 由于其癥狀的相似性、病原體的廣泛性和檢測結果的重要性，能否發明出一種快速、高通 量、可靠的同時檢測多種食源性致病菌的方法成為本領域技術人員亟待解決的技術難題。
【發明內容】
[0009] 本發明的目的之一是為解決如何利用液相忍片同時檢測五種食源性致病菌的 問題，本發明提供一種利用液相忍片同時檢測五種食源性致病菌的引物及檢測方法，用 LuminexxMAP液相忍片系統和菌株庫菌種資源，建立快速檢測5種常見食源性致病菌（包 括沙口氏菌、副溶血性弧菌、霍亂弧菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌）的方法，為液相忍 片技術進一步應用于食源性疾病的快速有效防控提供科學依據。
[0010] 為了達到上述技術效果，本發明的技術方案包括：
[0011] 一種利用液相忍片同時檢測五種食源性致病菌的基因探針，包括W下用于檢測五 種食源性致病菌的基因探針：
[0012] 用于檢測沙口氏菌的侵襲蛋白invA基因的探針：
[0013] 其探針核巧酸序列為畑2-5'TTTTTTTTTTTTACCTATCTGGTTGATTTCCTG-3'；
[0014] 用于檢測單增李斯特菌的Hly基因的探針：
[0015] 其探針核巧酸序列為畑2-5'TTTTTTTTTTTTCGCCTGCAAGTCCTAAGA-3'；
[0016] 用于檢測金黃色葡萄球菌的sa442基因的探針：
[0017]其探針核巧酸序列為畑2-5 'TTTTTTTTTTTTTTGCATCGGAAACATTGT-3 ' ；
[0018] 用于檢測霍亂弧菌的hlyA基因的探針：
[0019]其探針核巧酸序列為畑2-5'TTTTTTTTTTTTATGCGATTGCCCAAGA-3' ；
[0020] 用于檢測副溶血弧菌toxR基因的探針：
[0021] 其探針核巧酸序列為畑2-5 'TTTTTTTTTTTTACAAGGCTCGACGGC-3 '。
[0022] 一種利用液相忍片同時檢測五種食源性致病菌的方法，所述五種食源性致病菌為 沙口氏菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、霍亂弧菌和副溶血弧菌，所述方法包括W下步 驟：
[0023] 步驟一：設計五種食源性致病菌的特異性引物和基因探針，所述基因探針為權利 要求1所述的基因探針，所述引物的核巧酸序列如下：
[0024] 沙口氏菌的侵襲蛋白invA基因引物對：
[00巧]上游引物：5,Biotin-TCATTTCTATGTTCGTCATTCCATTAC-3,，
[0026]下游引物：5'Biotin-AGAACGACCCCATAAACACCA-3' ；
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