用于產量增加的方法中的重組體微生物的制作方法

用于產量增加的方法中的重組體微生物的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及能夠產生所需發酵產物、在微生物中功能性表達異源肽的重組體微生 物、和其中利用所述微生物的產生發酵產物的方法。在一種優選的實施方式中，所述微生物 為酵母。本發明進一步涉及CO2在微生物中的應用。
【背景技術】
[0002] 微生物發酵工藝被應用于廣泛且迅速擴展范圍的來自可回收利用的碳水化合物 進料的化合物的工業生產中。
[0003] 尤其是在厭氧發酵過程中，輔因子組NADH/NAD+的氧化還原平衡能夠引起對產量 的重要限制。這一挑戰的例證是在例如通過釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)生產 顏料乙醇的工業生產中作為主要副產物形成的甘油，其是需要再氧化在生物合成反應中形 成的NADH的直接后果。
[0004] 通過釀酒酵母生產乙醇目前是工業生物技術中的（以體積計）單次最大發酵工 藝，而其他化合物（包括其他醇類、羧酸、類異戊二烯、氨基酸等）目前是以工業生物技術工 藝生產的。
[0005] 已經提出了多種方法通過基因修飾來改善工業生物技術中生物體的發酵性質。
[0006] WO 2008/028019涉及利用具有至少一個異源的基因序列的微生物來形成發酵產 物的方法，該方法包括使至少一種碳水化合物轉化為3-磷酸甘油酯以及固定二氧化碳的 步驟，其中所述步驟中的至少之一是由至少一種外源酶催化的。此外，其還涉及用于通過至 少一種糖的發酵來形成發酵產物的微生物，該微生物包含編碼選自由磷酸戊糖表異構酶、 磷酸核酮糖激酶和核酮糖二磷酸羧化酶組成的組中的至少一種酶的至少一個異源基因序 列。
[0007] 在一個實例中提到了其中結合了異源PRK和異源Rubisco基因的酵母。在一種實 施方式中，酵母被用于乙醇生產。結果（圖24)示出了轉基因對照和經修飾菌株的濃度。在 經修飾的酵母和其相應對照物之間幾乎沒有可注意到的差異。沒有關于產物產量，糖轉化， 酵母生長、乙醇的蒸發速率的明顯信息。因此，顯然結果并不能得出關于乙醇產量得到改善 的結論。
[0008] 此外，WO 2008/028019中沒有提到甘油副產物形成的問題。
[0009] 關于基于酵母生產乙醇以及其他化合物的化學計量的主要挑戰在于，NADH-依賴 性副產品（尤其是甘油）的實際量通常作為副產物形成，尤其是在厭氧和氧受限條件下或 在呼吸作用受到抑制或不存的條件下。已經估計在常規的工業遺傳工藝中，高達約4wt. % 的糖進料被轉化為甘油（Nissen等人，Yeast 16(2000)463-474)。在對于厭氧生長是理想 的條件下，向甘油的轉化甚至會更高，高達約10%。
[0010] 在厭氧條件下生產甘油主要與氧化還原代謝有關。在釀酒酵母的厭氧生長過程 中，糖異化作用經由酒精發酵而發生。在該過程中，在糖酵解的3-磷酸甘油醛脫氫酶反 應中形成的NADH通過NAD+-依賴性醇脫氫酶將丙酮酸酯脫羧形成的乙醛再氧化為乙醇。 當代謝的其他地方發生NAD+向NADH的凈還原時，這種中性條件下氧化還原的異化途徑 (redox-neutral dissimilatory pathway)的固定的化學計量導致一些問題。在厭氧條件 下，釀酒酵母中的NADH再次氧化嚴格依賴于糖還原為甘油。甘油形成是通過糖酵解中間體 磷酸二羥丙酮（DHAP)還原為甘油3-磷酸（甘油-3P)開始的，這個反應由NAD+-依賴性甘 油3-磷酸脫氫酶催化。隨后，通過甘油-3-磷酸酶來水解在該反應中形成的甘油3-磷酸 以產生甘油和無機磷酸鹽。因此，在通過釀酒酵母厭氧生產乙醇的過程中甘油是主要的副 產物，其是不希望的因為其降低了糖向乙醇的總體轉化。此外，乙醇生產車間的廢水中甘油 的存在會增加廢水處理的成本。
[0011] 在WO 2011/010923中，通過提供包含編碼NAD+-依賴性乙酰化乙醛脫氫酶 (EC1. 2. 1. 10)活性的一種或多種重組體核酸序列的重組酵母細胞在由含碳水化合物進料 (尤其是來自木質纖維素生物質的碳水化合物進料）生產乙醇的過重形成NADH-相關的副 產物（甘油）的甘油副產品問題，所述細胞缺少NADH-依賴性甘油合成所需的酶活或者相 比于野生型酵母細胞該細胞在NADH-依賴性甘油合成方面具有降低的酶活性。細胞被描述 為在實質上降低甘油生產方面是有效的。而且，該細胞使用乙酸鹽以再氧化NADH，從而在使 用含乙酸鹽進料時能夠增加乙醇產量。
[0012] 盡管WO 2011/010923中描述的方法是有利的，但對于其變型仍存在持續的需要， 尤其是也能夠生產有用的有機化合物（例如乙醇）而不需要乙酸鹽或其他有機電子接受體 分子以消除或至少降低NADH-依賴性副產物合成的變型。尤其是合乎需要的是提供一種微 生物，其中減少了 NADH-依賴性副產物合成并且能夠增加產物產量并且不存在乙酸鹽。

【發明內容】

[0013] 發明人認識到利用二氧化碳作為底物通過在異養、化養微生物細胞，尤其是酵母 細胞中功能性表達重組體酶來減少或者甚至消除NADH-依賴性副產物合成是可能的。
[0014] 因此，本發明涉及二氧化碳作為電子接受體在重組體化異養微生物，尤其是真核 微生物中的應用。化養、（化）異養和自養和其他分類的微生物在本文中涉及重組前的微 生物，該生物體在本文中也被稱為宿主。例如，因為本文中所披露的應用使得重組的生物體 可以同化二氧化碳從而導致（部分）（化）自養作用，因此通過如本文中所披露的重組原來 為（化）異養和非自養的宿主微生物在重組之后可變成自養的。
[0015] 有利的是，發明人已經發現了合并二氧化碳在異養生物微生物的代謝工程中作為 輔助底物以用于改善產物產率和/或減少副產物形成的方式。
[0016] 尤其是，發明人發現，通過功能性表達來自真核微生物（尤其是酵母細胞）的兩個 特定組的中至少兩種重組體酶來減少或甚至消除NADH-依賴性副產物合成是可能的，其中 的一種酶對話其中利用二氧化碳的反應而另一種酶利用ATP作為輔因子。
[0017] 因此，本發明進一步涉及重組體，尤其是轉基因真核微生物，尤其是酵母細胞，所 述微生物功能性表達一種或多種重組體，尤其是編碼1，5-二磷酸核酮糖羧化酶加氧酶 (Rubisco)和磷酸核酮糖激酶（PRK)的異源核酸序列。
[0018] 已經發現根據本發明的微生物尤其具有優勢，因為在Rubisco和PRK的存在下， NADH-依賴性副產物形成（甘油）顯著減少或基本上被完全消除并且期望產物的生產增加。 這被認為是二氧化碳起到了 NADH的電子接受體的作用，從而少量的NADH可用于朝向生成 畐Ij產物（例如甘油）的反應。
[0019] 本發明進一步涉及用于制備有機化合物的方法，尤其是醇、有機酸或氨基酸，該方 法包括利用微生物使碳源，尤其是碳水化合物或另外的有機碳源轉化形成有機化合物，其 中該微生物是根據本發明的微生物或其中在重組體化養或化異養微生物中二氧化碳被用 作電子接受體。
[0020] 本發明進一步涉及用于在酵母細胞中功能性表達異源多肽的載體，其中所述載體 包含編碼Rubisco和PRK的異源核酸序列，其中所述Rubisco表現出固碳活性，除非另外具 體提及，在本文中使用的術語"一個"或" 一種"被定義為"至少一個/ 一種"。
【具體實施方式】
[0021] 當提到單數形式的名詞（例如，化合物、添加劑等）時，意味著復數形式也包括在 內。因此，除非另外具體提及，當提到具體的部分時，例如"化合物"，其意指該部分的"至少 一個/ 一種"，例如"至少一種化合物"。
[0022] 如在本文中使用的術語"或"應被理解為"和/或"。
[0023] 當提到存在若干異構體（例如D和L對映異構體）的化合物時，原則上該化合物 包括可用于本發明的特定方法中的該化合物的所有對映異構體、非對映異構體和順/反異 構體，尤其是當提到例如化合物時，其包括（一種或多種）天然異構體。
[0024] 出于清楚和簡要描述的目的，本文中作為相同或單獨實施方式的部分來描述特 征，然而，優選本發明的范圍可以包括具有所有或一些所述特征的組合的實施方式。在本文 中，對于本領域技術人員而言，如所提交的權利要求1的變體可與所提交的申請中描述的 其他特征進行組合，尤其是與從屬權利要求中的特征進行組合，例如那些通常涉及本發明 的最優選實施方式的權利要求。
[0025] 本文中使用的術語"發酵""、"發酵的"等具有經典的含義，即，其表示在厭氧條 件下或已經在厭氧條件下進行的工藝。厭氧條件在本文中被定義為不具有任何氧的條件 或在該條件下酵母細胞（尤其是酵母細胞）基本上不消耗氧，并且通常對應于耗氧量小于 5mmol/l. h，尤其是對應于耗氧量小于2. 5mmol/l. h，或更低于lmmol/1. h。更優選地，消耗 Ommol/L/h (即，耗氧量不可檢出）。這通常對應于培養物肉湯中的溶解氧濃度小于空氣飽 和的5%，尤其是溶解氧濃度小于空氣飽和的1%，或更低于空氣飽和的0. 2%。
[0026] 術語"酵母"或"酵母細胞"是指系統發生差異較大的一組單細胞真菌，其中的大 多數為子囊菌門（Ascomycota)和擔子菌亞門（Basidiomycota)的分支。芽酵母（"真酵 母（true yeasts)"）被分在酵母菌目（Saccharomycetales)，其中釀酒酵母是最為熟知的 物種。
[0027] 如本文中使用術語"重組體（細胞）"或"重組體微生物"是指含有作為利用重組 體DNA技術和/或另外的突變技術的一種或多種基因修飾的結果的核酸的菌株（細胞）。 尤其是重組體細胞可以包含相應的野生型細胞中不存在的核酸，該已利用重組體DNA技術 (轉基因細胞）將該核酸被引入到菌株（細胞）中，或所述野生型中不存在的核酸是所述野 生型（例如編碼野生型多肽的基因）存在的核酸序列的一種或多種突變的結果（例如利用 重組體DNA技術和/或另外的突變技術），或其中基因的核酸序列已被修飾為使該多肽產 物（編碼其）靶向于另外的細胞腔隙。此外，術語"重組體（細胞）"尤其涉及已利用重組 體DNA技術將來自其的DNA序列除去的菌株（細胞）。
[0028] 如本文中使用的術語"轉基因（酵母）細胞"是指含有該菌株（細胞）中非天然 存在的核酸，并且其已經利用重組體DNA技術白引入到該菌株（細胞）中的菌株（細胞）， 艮P，重組體細胞。
[0029] 如本文中使用的涉及蛋白質或多肽的術語"突變的"意指野生型或天然存在的 蛋白質或多肽序列中的至少一個氨基酸已經由編碼這些氨基酸的核酸的突變發生而被不 同氨基酸替代、插入或從該序列刪除。突變發生是本領域公知的方法，并且包括例如，通 過PCR的方式或經由寡核苷酸-介導的突變發生進行的定點突變發生，如Sambrook等 人，Molecular Cloning-A Laboratory Manual,第2版，第 1-3 卷（1989)中所描述的。如 本文中使用的涉及基因的術語"突變的"意指該基因或其常規序列的核酸序列中的至少一 個核苷酸突變發生已被不同的核苷酸替代，或已經從該序列刪除，使得蛋白質序列以定性 或定量改變的功能或基因敲除的方式發生轉錄。
[0030] 如本文中使用的術語"基因"是指含有核酸聚合酶的模板的核酸序列，在真核細胞 中該酶為RNA聚合酶。基因被轉錄為mRNA，并且然后被翻譯成蛋白質。
[0031] 如本文中使用的術語"核酸"包括指代單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖 核苷酸聚合物，即多核苷酸，并且除非另外限制，其包含具有天然核苷酸的必需性質的已知 類似物，因為其以類似于天然存在的核苷酸（即肽核酸）的方式雜交至單鏈核酸。多核苷 酸可以是全長或天然或異源結構或常規基因的子序列。除非另外說明，該術語包括指代具 體的序列及其互補序列。因此，如該術語在本文中的期望含義，具有出于穩定性目的或其他 目的進行修飾的骨架的DNA或RNA為"多核苷酸"。而且，包含非常規堿基例如次黃嘌呤核 苷（inosine)或修飾的堿基例例如三苯甲基化的堿基（僅僅是兩個實例）的DNA或RNA在 本文中也被稱作術語多核苷酸。應該理解，已經對DNA和RNA進行了大量不同的修飾以起 到本領域技術人員公知的許多不同目的。如在本文中使用的，術語多核苷酸涵蓋多核苷酸 的這些化學、酶促或代謝修飾的形式，以及病毒和細胞的DNA和RNA特征的化學形式，包括 除簡單和復雜細胞之外。
[0032] 術語"多肽"、"肽"和"蛋白"在本文中可以互換使用，其是指氨基酸殘基的聚合物。 該術語適用于其中的一個或多個氨基酸殘基為相應天然存在氨基酸的人工化學類似物的 氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物。天然存在的氨基酸的這些類似物的必需性 質是，當結合于蛋白質時，該蛋白質與形成相同蛋白質但全部由天然存在的氨基酸組成的 抗體特異性反應。術語"多肽"、"肽"和"蛋白質"還包括修飾，包括但不限于糖基化、脂粘 附、硫酸化、谷氨酸殘基的γ -羧化、羥基化和ADP-核糖基化。
[0033] 當參照酶分類（EC)提到酶時，該酶分類是其中酶基于國際生物化學與分子 生物學聯合會命名法學會（Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology， NC-IUBMB)提供的酶命名法（Enzyme Nomenclature)被分類或可以被分類成的類別，該命名法可在http://www. chem. qmul. ac.uk/iubmb/enzyme/找到。意在包括尚未分類在具體類別中但可以這樣進行分類的其他 適合的酶。
[0034] 除非另外說明，如果本文中參照登錄號提到蛋白或核酸序列，例如基因，則該號碼 尤其用于指具有能夠通過WWW. ncbi. nlm. nih. gov/(如2009年7月13日可用的）找到的 蛋白質或核酸序列。
[0035] 本文中參照遺傳密碼編碼多肽的每一核酸序列描述了核酸的每一可能沉默變異。 術語"保守修飾變體"應用于氨基酸和核酸序列。對于特定的核酸序列，保守修飾的變體是 指編碼相同氨基酸序列或者由于遺傳密碼的簡并而編碼氨基酸序列的保守修飾變體的那 些核酸。術語"遺傳密碼的簡并"是指大量功能上相同的核酸編碼任意給定蛋白質。例如， 密碼子GCA、GCC、GCG和G⑶均編碼氨基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸被密碼子指定的每一位 置，該密碼子都能夠變成所述的任意相應密碼子，而不需改變所編碼的多肽。這樣的核酸變 化是"沉默變化"并且代表一種類型的保守修飾的變化。
[0036] 如本文中所使用的，術語具有特定序列（例如SEQ ID Ν0:Χ)的多肽的"功能性同 源物"（或短"同源物"）是指包含所述特定序列的多肽，條件是一個或多個氨基酸被取代、 缺失、添加和/或插入，并且該多肽對于底物轉化具有（質量上）相同的酶促功能性。這種 功能性可通過利用包含重組酵母細胞的測試系統來進行測試，其中該重組酵母細胞包含用 于在酵母中表達同源物的表達載體，所述表達載體包含可操作地連接于在酵母中是功能性 的啟動子的異源核酸序列，并且所述異源核酸序列編碼該同系物多肽，對其在酵母細胞中 使乙酰基-輔酶A轉化為乙醛的酶活性進行測試，并且測定在所述細胞中是否發生該轉化。 可通過利用計算機輔助類似性分來來鑒定候選同源物。W02009/013159的實施例2中描述 了這樣的分析的具體實例。本領域技術人員能夠從中知曉可以發現多么適合的候選同源物 并且，可選地在密碼子（對）最后化之能夠如上文所述利用適合的測定系統來測試這樣的 候選同源物的所需功能性。適合的同源物代表具有類似于具體多肽50%，優選60%或更 多，尤其是至少70 %，，更加尤其是至少80 %，至少90 %，至少95 %，至少97 %，至少98 %或 至少99%的氨基酸序列，并且具有所需酶促功能性的多肽。對于核酸序列，術語功能性同源 物意在包括不同于由于遺傳密碼的簡并獲得的另一核酸序列并編碼相同多肽序列的核酸 序列。
[0037] 序列同一性在本文中被定義為如通過比較序列確定的兩種或更多種氨基酸（多 肽或蛋白）序列或兩種或更多種核酸（多核苷酸）序列之間的關系。通常，序列同一性或類 似性是在所比較的序列的全長上進行比較。在本領域中，"同一性"還意指氨基酸或核酸序 列之間序列聯系的程度，例如情況可以是如通過這樣的序列的字串自檢的匹配來確定的。
[0038] 當氨基酸或核苷酸序列表現出一定程度的相似性時被稱為同源物。被稱為同源 物的兩個序列表示相同的進化來源。不論兩個同源序列是否緊密相關或者關系較遠都分 別比或高或低的以"百分比同一性"或"百