產l-蘇氨酸微生物和使用該微生物生產l-蘇氨酸的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及RNA聚合酶〇 32因子變體，并且涉及使用該微生物生產L-蘇氨酸的 方法。
【背景技術】
[0002] L-蘇氨酸，是一種必需氨基酸，被廣泛用作動物飼料和食品的添加劑，并且被有效 用作醫藥和制藥用再水化溶液和合成材料。
[0003] L-蘇氨酸主要通過使用人工突變方法或基因重組方法開發的大腸桿菌 (Escherichia coli)或棒狀桿菌（Corynebacterium)發酵生產。源自野生型菌株（包括大 腸桿菌（Escherichia coil)、沙雷菌（Serratia)、普羅威登斯菌（Providencia)或棒狀桿 菌）的人工突變菌株被廣泛用于生產L-蘇氨酸。
[0004] 隨著基因重組技術的發展，通過隨機突變操縱具有L-蘇氨酸生產力的菌株的技 術已經被報道為用于提高L-蘇氨酸生產力的位點特異性基因置換、基因擴增與缺失等。已 開發了與蘇氨酸的生物合成有關的基因和用于增加這些基因表達的各種方法。但是仍然需 要能夠以高產量生產L-蘇氨酸的方法。
[0005] 全局轉錄機器的功能是控制所有細胞系統（原核的和真核的）的轉錄。全局轉錄 機器工程通過突變編碼全局性調控因子的核酸或控制其表達的啟動子而提供包含特性改 進的全局性調控因子的重組細胞，并且可通過該方法生產表型改進的細胞。
[0006] σ因子為一類基于RNA聚合酶全酶的啟動子偏好在調控全局轉錄中發揮重要作 用的全局性調控因子。σ因子是能使RNA聚合酶特異性結合到基因啟動子的原核生物的轉 錄起始因子。每個σ因子響應不同的環境條件而激活，并且每個RNA聚合酶分子都包含一 個〇因子亞基。眾所周知，大腸桿菌（E.coli)具有至少8個σ因子，并且σ因子的數量 變化取決于細菌種類。
[0007] 為了進一步增強具有L-蘇氨酸生產力的大腸桿菌菌株的耐高溫壓力，本發明人 已經進行了研究以修飾編碼已知控制熱激應答的σ 32的rpoH基因。因此，本發明人已經 研發了調控轉錄機制的RNA聚合酶σ 32因子變體，使得蘇氨酸生產力即使在高溫下也沒有 極大降低，并且已經將RNA聚合酶σ 32因子變體引入到產蘇氨酸菌株中，從而完成本申請。
【發明內容】
[0008] 摶術問題
[0009] 本申請的目的是提供RNA聚合酶σ 32因子變體。
[0010] 本申請的另一個目的是提供編碼RNA聚合酶〇32因子變體的核苷酸序列。
[0011] 本申請的又另一個目的是提供包含所述核苷酸序列的載體。
[0012] 本申請的又另一個目的是提供具有L-蘇氨酸生產力的埃希氏桿菌屬 (Escherichia)的重組微生物，其表達所述變體。
[0013] 本申請的又另一個目的是提供使用所述埃希氏桿菌屬的微生物生產L-蘇氨酸的 方法。
[0014] 摶術方案
[0015] 為了完成上述目的，本申請提供了具有SEQ ID N0:17所示的氨基酸序列的RNA聚 合酶σ 32因子變體。
[0016] 本申請也提供了編碼RNA聚合酶σ 32因子變體的核苷酸序列。
[0017] 本申請也提供了具有L-蘇氨酸生產力的埃希氏桿菌屬的重組微生物，其表達所 述變體。
[0018] 本申請也提供了使用所述埃希氏桿菌屬的微生物生產L-蘇氨酸的方法。
[0019] 有益效果
[0020] 根據本申請，用包含編碼耐高溫應激的RNA聚合酶σ 32因子變體的核苷酸序列的 載體轉化的菌株具有耐溫性并且也可以增加的產量生產L-蘇氨酸。因此，與常規菌株相 比，即使當在高溫下培養時，它可以顯著高的生產力生產蘇氨酸。因此，它能被有效用于以 高產量生產蘇氨酸。
[0021] 發明詳沐
[0022] 下文將詳細描述本申請。
[0023] 本申請提供了具有SEQ ID Ν0:17所示的氨基酸序列的RNA聚合酶σ 32因子變體。
[0024] 本文所用的術語"σ 32(〇32)因子"指的是稱為主要σ因子的全局性調控σ因 子，其在對數期控制熱激應答并且由rpoH基因編碼。
[0025] 此外，與本申請變體的氨基酸序列具有至少80%，特別是至少90%，更特別是至 少95 %，并且尤其特別是至少99 %同源性的變體也包括在本申請的范圍內。通過利用，例 如 Karlin 和 Altschul 的 BLAST 算法（參見 Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993))或 FASTA(參見Methods Enzymol.，183, 63(1990))可以測定氨基酸序列的同源性。已經在該 BLAST算法(參見www. ncbi.nlm. nih. gov)的基礎上開發了稱為BLASTN和BLASTX的程序。 本申請的變體的范圍包括與所述變體的氨基酸序列相比具有缺失、插入和氨基酸取代等的 突變體，并且也包括具有密碼子取代的突變體。
[0026] 在本申請的實施方案中，變體選自通過將隨機突變引入野生型大腸桿菌菌株 W3110中而獲得的突變rpoH DNA庫，并且選擇的變體命名為rp〇H2G6。分析提取的變體的 核苷酸序列，并且結果是，可以看出與野生型RNA聚合酶σ 32因子的氨基酸序列（SEQ ID NO: 16)相比，在變體的氨基酸序列中發生了突變（實施例3)。
[0027] 本申請還提供了編碼所述變體的核苷酸序列。
[0028] 在本申請的實施方案中，RNA聚合酶σ 32因子變體可特別具有SEQ ID N0:15所 示的核苷酸序列。
[0029] 在本申請的實施方案中，編碼所述變體的核苷酸序列的遺傳密碼可以是簡并的。 在本文中，遺傳密碼簡并性是在遺傳密碼中最后一個堿基是無意義的現象。如果開始兩個 堿基是相同的，即使當在該位置的密碼子是不同的，它們編碼相同。
[0030] 因此，本申請的變體的核苷酸序列可與SEQ ID N0:15所示的核苷酸序列具有至少 80 %，特別是至少90 %，更特別是至少95 %，最特別是99 %的同源性。
[0031] 本申請也提供了包含所述核苷酸序列的載體。
[0032] 本申請所用的載體并無特別限制，并且可以是本領域已知的任何載體，只要它可 以在宿主中復制即可。通常使用的載體的實例包括天然或重組質粒、粘粒、病毒和噬菌體。 例如，本申請所用的噬菌體載體或粘粒載體可以是pWE15、M13、XMBL3、XMBL4、λΙΧΙΙ、 AASHII、λΑΡΙΙ、AtlO、人1：11、〇1&1'〇1144、〇1&1'〇112]^等，并且本申請所用的質粒載體可以 是pBR類型、pUC類型、pBluescriptll類型、pGEM類型、pTZ類型、pCL類型、pET類型等。 本申請所用的載體并無特別限制，并且可以是本領域已知的任何表達載體。具體而言，可以 使用 PACYC177 載體、pACYC184 載體、pCL 載體、pECCG117 載體、pUC19 載體、pBR322 載體、 PMW118載體或pCCIBAC載體。最特別是，可以使用pACYC177載體、pCL載體或pCCIBAC載 體。
[0033] 本申請提供了具有L-蘇氨酸生產力的埃希氏桿菌屬的重組微生物，其表達所述 變體。
[0034] 在本申請中，所述變體的表達可通過用可操作地包含編碼所述變體的基因的重組 載體轉化或通過將編碼所述變體的多核苷酸插入到微生物的染色體中而獲得，但是不特別 限于此。
[0035] 本文所用的術語"轉化"意思是將包含編碼靶蛋白的多核苷酸的載體引入到宿主 細胞，從而能夠在宿主細胞中表達所述多核苷酸編碼的蛋白。可以使引入的多核苷酸插入 或位于宿主細胞的染色體中或染色體外，只要它能在宿主細胞中表達即可。此外，多核苷酸 包括編碼靶蛋白的DAN和RNA。只要多核苷酸可以被引入宿主細胞并且可以在其中表達，它 就可以以任何形式被引入。例如，可以以包括自我表達所需的所有元素的多核苷酸構建體 的表達盒的形式將多核苷酸引入到宿主細