一種采用60Co-γ射線誘變的酸性蛋白酶高產菌株選育方法
【專利摘要】本發明公開了一種采用60Co?γ射線誘變的酸性蛋白酶高產菌株選育方法，包括以下步驟：a）孢子懸浮液制備：取恒溫培養箱內的平板孢子，震蕩后用無菌蒸餾水稀釋，即得孢子懸浮液并備用；b）60Co?γ射線誘變：將孢子懸浮液置于0.5～2.0 KGy的輻照臺面上，處理5?10min后取出做分離培養，吸取60Co?γ射線照射后的樣品稀釋，計算菌落數；c）菌株篩選：以得到的菌株為基礎，挑選其中HC值大于平均值的變異菌株作為初篩菌株，以備復篩；c2)取步驟c1)得到的菌株，加入1 mL 2%的硫代硫酸鈉作為解毒劑，選育出酸性蛋白酶酶活力提高值最大的為高產菌株。
【專利說明】
一種采用60C〇- γ射線誘變的酸性蛋白酶高產菌株選育方法
技術領域
[0001] 本發明屬于菌株選育的技術領域，尤其是涉及一種采用eoco-γ射線誘變的酸性 蛋白酶高產菌株選育方法。
【背景技術】
[0002] 從自然界篩選得到的野生菌，一般其酸性蛋白酶產量都比較低，并不能直接用于 工業化的發酵生產，所以必須對野生菌進行選育以提高其酸性蛋白酶產量是工業化生產很 關鍵的一環節。工業上生產酸性蛋白酶的高產菌株大多數都是通過誘變后改變基因組列而 篩選得到的突變株。實驗室采用常規誘變方法，以產酸性蛋白酶的黑曲霉菌株為出發菌獲 得耐高溫酸性蛋白酶生產菌株。或者采用黑曲霉為出發菌株，經原生質體紫外誘變，得到了 產酸性蛋白酶優良菌株。采用單因素和正交實驗，對其液態發酵的培養基成分進行了優化， 得到最佳培養基組成。
[0003] 工業級酸性蛋白酶制劑的生產市通過微生物菌種經液體通風發酵，成熟發酵醪， 再經硫酸銨鹽析，板框壓濾，氣流(沸騰)干燥，粉碎，化驗，包裝等工序，便制成工業級粉劑 酸性蛋白酶。最初生產的微生物酸性蛋白酶只有工業級的，主要用于皮毛軟化。食品級酸性 蛋白酶制劑的生產是成熟發酵醪進入絮凝罐，加入絮凝劑絮凝沉淀，再用板框壓濾機壓濾， 濾餅經干燥后可作飼料酶添加劑，濾清液用超濾膜濃縮，經化驗合格，加入防腐劑、穩定劑 便成為成品濃縮酸性蛋白酶制劑。
[0004] 誘變育種的主要步驟分為出發菌株的誘變處理和突變株的篩選兩大部分。出發菌 株的誘變處理包括出發菌株的選擇、誘變劑的選擇和誘變劑量的確定。在出發菌株的選擇 上盡量選擇經多次自發或誘變突變且每次誘變都有較好效果的菌株作為出發菌株，誘變劑 的選擇原則是使用方便并行之有效，并選擇既能擴大變異幅度，又能促進正突變的劑量。突 變體的篩選主要通過科學的初篩和復篩方法來選擇正突變株。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是針對上述問題，提供一種采用6〇c〇-y射線誘變的酸性蛋白酶高 產菌株選育方法。
[0006] 為達到上述目的，本發明采用了下列技術方案： 一種采用6〇c〇-y射線誘變的酸性蛋白酶高產菌株選育方法，包括以下步驟： a) 孢子懸浮液制備:取恒溫培養箱內40°C下培養5 d的平板孢子，用無菌蒸餾水洗脫平 板孢子，置于無菌并盛有玻璃珠的三角瓶中，在250~300 r/min的震蕩裝置上震蕩2~5 h， 使孢子活化和分散，孢子分散率在90%以上，在光學顯微鏡下觀察孢子并計數，然后用無菌 蒸餾水稀釋孢子懸浮液至115個/mL，即得孢子懸浮液并備用； b) 60C〇-y射線誘變:洗脫麥芽汁瓊脂平板培養基上的孢子，制備稀釋成孢子濃度為 個/mL的孢子懸浮液，分裝2 mL注入無菌試管，置于0.5~2.0 KGy的福照臺面上，處理 5-10min后取出做分離培養，吸取60C〇-y射線照射后的樣品稀釋、涂布于0.4%的干酪素培 養基上，放置于30°C~50°C培養箱內倒置培養36~72 h，計算每皿菌落數； c)菌株篩選： cl)以步驟b中得到的菌株為基礎，挑選其中HC值大于平均值的變異菌株作為初篩菌 株，以備復篩;HC值=透明圈直徑/菌落直徑； c2)取步驟cl)得到的菌株，加入1 mL 2 %的硫代硫酸鈉作為解毒劑，培養基中30°C 培養2d，然后利用福林酚法檢測中性蛋白酶酶活力，選育出酸性蛋白酶酶活力提高值最大 的為高產菌株。
[0007] 作為優選，所述的步驟a)中的培養箱為恒溫電熱培養箱，震蕩裝置為恒溫培養搖 床，震蕩速度為300r/min，震蕩時間為6h。
[0008] 作為優選，所述的步驟b)中的干酪素培養基為分離培養基，在PDA培養基為內加入 〇.4%干酪素，放置于30°C培養箱內倒置培養72 h。
[0009] 作為優選，所述步驟b)中的選取菌體致死率大約在60 %~95 %之間的誘變劑量來 觀察其正突變率，且選擇正突變率在致死率為70%~80%時最大的劑量。
[0010] 與現有的技術相比，本發明的優點在于:60C〇-Y射線是一種廣泛應用于誘變劑， 能顯著影響組織或者細胞的生長發育，高劑量的eoco-γ射線可以使細胞染色體斷裂和DNA 傷害，蛋白質和酶活性的喪失，碳水化合物和光合色素合成的下降，但傷害程度和60C〇-y 射線的輻射劑量呈呈正相關，相對低的劑量用于菌株的誘變育種是一種新的育種手段。
【附圖說明】
[0011]以下結合附圖和本發明的實施方式來作進一步詳細說明 圖1是本發明提供的60CO- γ射線誘變致死率曲線； 圖2是本發明提供的60C〇- γ射線照射劑量對突變率的影響。
【具體實施方式】
[0012]本實施例中采用60CO- γ射線誘變的酸性蛋白酶高產菌株選育方法，包括以下步 驟： a) 孢子懸浮液制備:取恒溫培養箱內40°C下培養5 d的平板孢子，用無菌蒸餾水洗脫平 板孢子，置于無菌并盛有玻璃珠的三角瓶中，在250~300 r/min的震蕩裝置上震蕩2~5 h， 使孢子活化和分散，要求孢子分散率在90%以上，在光學顯微鏡下觀察孢子并計數，然后用 無菌蒸餾水稀釋孢子懸浮液至115個/mL，即得孢子懸浮液并備用； b) 60C〇-y射線誘變:洗脫麥芽汁瓊脂平板培養基上的孢子，制備稀釋成孢子濃度為 10$個/mL的孢子懸浮液，分裝2 mL注入無菌試管，根據劑量要求，置盛有菌體懸液的試管 于一定劑量(〇.5、1.0、1.5和2.0 KGy)的輻照臺面上，處理5-10min后取出馬上做分離培養， 吸取60C〇- γ射線照射后的樣品稀釋、涂布于0.4%的TOA培養基上，放置于30°C~50°C培養 箱內倒置培養36~72 h，計算每皿菌落數，繪制致死曲線;PDA培養基為分離培養基，其中加 入0.4%干酪素； c) 菌株篩選： cl)首先進行平板初篩:取菌懸液10 mL置于9 mL的培養皿中，置于磁力攪拌器 上，然后取0.2 mL直接涂布在干酪素篩選培養基上初篩，35°C避光恒溫培養2~4 d，挑選 出HC值大且生長較快的菌株，接入分離培養基斜面保存備用。（HC值=透明圈直徑/菌落 直徑）； c2)然后進行搖瓶復篩:取5 mL孢子洗脫液與一定濃度誘變劑混勻，處理一定時間， 加入1 mL 2 %的硫代硫酸鈉作為解毒劑，培養基中30°C培養2d，然后利用福林酚法檢測 中性蛋白酶酶活力，選育出酸性蛋白酶酶活力明顯提高的菌株； 本實施例所述的步驟a)中培養箱為DHP-9272型恒溫電熱培養箱，震蕩裝置為ZHWY-1112B恒溫培養搖床，震蕩速度為300r/min，震蕩時間為6h。
[0013] 如圖1所示，X軸為60C〇-y照射劑量(KGy)，Y軸為菌體致死率(％)，實驗結果表明， 隨著60C〇- γ照射劑量的增加，菌體致死率逐漸升高，在輻射劑量為0.5 KGy時致死率達到 了78.5%，1.0 KGy劑量照射時，致死率達到87.6%，按照誘變劑量選擇的一般原則，選取菌體 致死率大約在60 %~95 %之間的誘變劑量來觀察其正突變率，且正突變率在致死率為70% ~80%時最大，故60C〇-γ照射選取0.5 KGy的劑量為適宜劑量;如圖2所示，X軸為60C〇-γ照 射劑量(KGy)，Y軸為菌體突變率(％)，曲線Α為正突變率，曲線Β為負突變率;菌體在60C〇-y 不同劑量照射下，正負突變率均先逐漸升高，然后緩慢降低，正突變率在0.5 KGy下為最大 47%，且在此劑量下正負突變率差值也達到了最大，這也同樣證明0.5 KGy為最適合的誘變 劑量。
【主權項】
1. 一種采用60CO- γ射線誘變的酸性蛋白酶高產菌株選育方法，其特征在于:包括以下 步驟： a) 孢子懸浮液制備:取恒溫培養箱內40°C下培養5 d的平板孢子，用無菌蒸餾水洗脫平 板孢子，置于無菌并盛有玻璃珠的三角瓶中，在250~300 r/min的震蕩裝置上震蕩2~5 h， 使孢子活化和分散，孢子分散率在90%以上，在光學顯微鏡下觀察孢子并計數，然后用無菌 蒸餾水稀釋孢子懸浮液至115個/mL，即得孢子懸浮液并備用； b) 60C〇-y射線誘變:洗脫麥芽汁瓊脂平板培養基上的孢子，制備稀釋成孢子濃度為 個/mL的孢子懸浮液，分裝2 mL注入無菌試管，置于0.5~2.0 KGy的輻照臺面上，處理 5-10min后取出做分離培養，吸取60C〇-y射線照射后的樣品稀釋、涂布于0.4%的干酪素培 養基上，放置于30°C~50°C培養箱內倒置培養36~72 h，計算每皿菌落數； c) 菌株篩選： cl)以步驟b中得到的菌株為基礎，挑選其中HC值大于平均值的變異菌株作為初篩菌 株，以備復篩;HC值=透明圈直徑/菌落直徑； c2)取步驟cl)得到的菌株，加入1 mL 2 %的硫代硫酸鈉作為解毒劑，培養基中30°C 培養2d，然后利用福林酚法檢測中性蛋白酶酶活力，選育出酸性蛋白酶酶活力提高值最大 的為高產菌株。2. 如權利要求1所述的一種采用60C〇-y射線誘變的酸性蛋白酶高產菌株選育方法，其 特征在于:所述的步驟a)中的培養箱為恒溫電熱培養箱，震蕩裝置為恒溫培養搖床，震蕩速 度為300r/min，震蕩時間為6h。3. -種采用60C〇- γ射線誘變的酸性蛋白酶高產菌株選育方法，其特征在于:所述的步 驟b)中的干酪素培養基為分離培養基，在FOA培養基為內加入0.4%干酪素，放置于30 °C培養 箱內倒置培養72 h。4. 一種采用60C〇- γ射線誘變的酸性蛋白酶高產菌株選育方法，其特征在于:所述步驟 b)中的選取菌體致死率大約在60 %~95 %之間的誘變劑量來觀察其正突變率，且選擇正突 變率在致死率為70%~80%時最大的劑量。
【文檔編號】C12N1/02GK105950607SQ201610351279
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年5月25日
【發明人】何榮軍, 王茜, 孫培龍
【申請人】浙江工業大學