一株檸檬酸高產菌株及其篩選方法

專利名稱：一株檸檬酸高產菌株及其篩選方法
技術領域：
本發明涉及生物發酵領域，涉及一株采用航天誘變手段獲得的黑曲霉孢子，并通過耐受:聞糖聞酸的定向篩選獲得聞廣朽1fe酸菌株。
背景技術：
檸檬酸(Citric acid)又名枸櫞酸，為白色顆粒狀或白色結晶粉末，相對密度為
1.6550，無臭，具有令人愉快的強烈的酸味，入口爽快，無后酸味，安全無毒，被廣泛用作食品和飲料的酸味劑，全球范圍內檸檬酸的生產主要通過產檸檬酸的黑曲霉發酵，黑曲霉屬半知菌綱，一般只進行無性繁殖，由孢子發芽開始到新孢子形成，為一個生活周期。黑曲霉利用糖類發酵生成檸檬酸，其生物合成途徑現普遍認為是:葡萄糖經EMP、HMP途徑降解生成丙酮酸，丙酮酸一方面氧化脫羧生成乙酰CoA，另一方面經CO2固定化反應生成草酰乙酸，草酰乙酸與乙酰CoA縮合生成檸檬酸。檸檬酸 的工業生產通常采用黑曲霉進行的深層發酵法，原料以薯干和玉米為主。世界檸檬酸工業的集約化程度非常高，除中國外，國外主要的檸檬酸制造商只有5 6家(美國、奧地利、加拿大、巴西等)，到2011年我國檸檬酸產量達94萬噸，占世界總產量的70%左右，從產量來說是名副其實的生產大國。我國檸檬酸工業的集約化已經達到世界領先水平。隨著工業的發展人們對含檸檬酸產品的需求增加，而黑曲霉菌株的產酸能力是制約檸檬酸生產能力的一個瓶頸。因此篩選獲得高產檸檬酸的黑曲霉菌株具有重大意義。國內外有很多關于檸檬酸生產菌黑曲霉育種的研究報道，主要是采用物理和化學手段進行誘變育種。各種誘變劑有其作用的特殊性，人們還無法針對某一目的選擇最適宜的誘變劑，在實際工作中一般都是根據經驗來證明誘變效果較好的因素。自從上世紀初開始用微生物生產檸檬酸以來，人們對生產檸檬酸的菌種進行了幾十年的誘變研究。我國在檸檬酸生產菌黑曲霉的育種方面積累了豐富的經驗，認為用復合誘變的方法比用單一的物理方法或化學方法更為有效。目前來看對黑曲霉育種較為有效的誘變因子有:Y-射線、X-射線、紫外線、激光、亞硝基胍(NTG)、亞硝基脲、乙基胺等，此外還有高能電子流、電磁場等。利用這些誘變因子在黑曲霉育種工作中已取得了不少成果。20世紀50年代末和60年代初，金其榮等人進行了檸檬酸發酵的菌種研究。上海工業微生物研究所，從土壤中經酸性平板分離獲得的野生黑曲霉628作為出發菌株，經多次60CO-Y射線和硫酸二乙脂等復合誘變，獲得了高產檸檬酸菌株Co827。它可直接利用薯干粉發酵，產酸達12 13%，平均轉化率為95%，發酵周期54 64h。無錫工業大學以黑曲霉H-142為出發菌株，通過Y射線、硫酸二乙脂、高溫單獨或復合誘變處理，通過高溫、高酸及高滲培養條件的定向篩選獲得HQL-601菌種。它的發酵溫度為40 41°C，周期60 64h，20%薯干粉搖瓶產酸13%，其檸檬酸純度明顯優于現有發酵菌。郝捷應用低能離子注入誘變育種技術，對現有檸檬酸發酵菌進行改良，并改進了產檸檬酸高產菌的初篩方法。經過多次N+注入，在實驗室選育獲得了 2株遺傳穩定的玉米原料發酵生產檸檬酸的高產菌株，其中HN-2004搖瓶發酵96h，平均產酸13.8%。盡管HN-2004的產酸比原始出發菌株提高了 50%，但仍存在發酵周期長、糖酸轉化率低的問題。由此可見，使用單一的誘變因子往往很難達到預期的目的。王軍等在黑曲霉的育種中，首次嘗試了應用兩種核技術手段同時對黑曲霉進行誘變，并證實了采用60Co-Y輻照并復合N+注入方法的可行性，獲得了 I株發酵周期72h、產酸13.68%、轉化率達103.45%的M3代菌株CN05。離子注入是材料表面處理的通用技術，目前，運用離子注入進行作物品種改良已獲得了成功，目前可大致將離子注入分為能量沉積、動量傳遞、粒子注入和電荷交換等四個反應過程。其作用機制較為復雜，很難用單一模式解釋清楚。荷能離子注入除具有能量沉積引起機體損傷的特征外，還具有動能交換產生的級聯損傷，表現為遺傳物質原子轉移、重排或基因的缺失，還有慢化離子、移位原子和本底元素復合反應造成的化學損傷以及電荷交換引起的生物分子電子轉移造成的損傷。從離子注入的致死率曲線等可以看出，這種誘變手段在機理上有別于傳統方法。低能離子注入具有生理損傷小、突變率高等特點，能取得較高的正突變率。因此可將其用于動物和微生物的品種改良目前，檸檬酸發酵菌黑曲霉已經歷了半個多世紀的誘變篩選，用于工業化生產檸檬酸的黑曲霉菌種大都經過物理和化學誘變劑的處理，不同程度地增加了黑曲霉對一些誘變劑的抗性，若再使用同樣的方法則很難對現有菌種進行改良。對常用的物理和化學誘變劑產生了一定的抗性，因此如何采用更為先進的技術手段實現對檸檬酸產生菌黑曲霉的誘變育種成為現在亟待解決的問題。

發明內容
本發明針對現有檸檬酸產生菌黑曲霉的誘變育種遇到的技術瓶頸，提供了一種采用航天誘變手段獲得的黑曲霉孢子，通過耐受高糖高酸的定向篩選，設計出高效的科學篩選方案從而實現誘變選育獲得高產菌株，該菌株命名為TN-A09，發明人對其進行了生物保藏，其保藏號為CGMCC N0.5751，該菌株是耐高糖高酸、產酸高、轉化率高的檸檬酸生產菌株，利用其發酵生產檸檬酸，平均產酸達到18%，發酵周期60小時，轉化率99%，遠高于現有黑曲霉液體發酵檸檬酸技術水平。

本發明所采用的生產菌株，是將黑曲霉孢子搭載返回式航天器進行太空誘變后，經過耐高糖高酸的定向篩選獲得的，發明人對其進行了生物保藏，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏號為CGMCCN0.5751，其狀態為存活。本發明首次以搭載返回式航天器進行太空誘變的方法用于檸檬酸產生菌黑曲霉的誘變育種。不但可以避免黑曲霉對一些誘變劑的抗性，而且有較大的選擇空間，更容易得到較為優良的菌種。在獲得上述菌種后，菌株的篩選是菌種誘變后的關聯步驟，也是決定優良菌株選育效率的關鍵步驟。微生物細胞群體經過誘變處理后，突變發生的頻率雖比自發突變的頻率高的多，但是在整個細胞的群體中，其頻率仍很低，即發生變異的細胞絕對數很低。DNA鏈上突變的發生是隨機的，所需要的突變株出現的頻率就更低，尋找所需的突變型猶如大海撈針。因此合理的篩選程序與方法在黑曲霉菌種的選育上非常重要。誘變是隨機的，但選擇是定向的。誘變后需通過正確、靈敏、快速的篩選檢測方法，從大量未變和負變的群體中把仍然是很少量的正向突變挑選出來。
現有黑曲霉的誘變選育中，人們常以溴甲酚綠指示性平皿培養基上黃色指示圈的大小作為初篩依據，進行大規模淘汰，以提高篩選效率，但在實際應用中發現，溴甲酚綠明顯影響黑曲霉的生長和產酸，不能客觀的反映菌株的產酸性能。因此，為了以最少的工作量，在最短的時間內取得最大的篩選效果，本發明的發明人設計高效的科學篩選方案從而實現誘變選育獲得聞廣菌株的目標。最終獲得耐聞糖聞酸且廣酸聞、轉化率聞、能耗低、生產成本低的檸檬酸菌種，具有重要的實際生產價值。本發明的具體技術方案是:一、航天誘變黑曲霉干孢子的準備1、將黑曲霉Co827接種于PDA(馬鈴薯培養基)斜面，在35°C條件下靜止培養4天，斜面長滿孢子后用無菌水沖洗孢子至帶玻璃珠的無菌三角瓶中，每支斜面洗到一只三角瓶中，用紗布包扎；2、將盛有孢子懸液的三角瓶放搖床上振蕩2小時，轉速270r/min，溫度25°C，充分打散孢子；3、將滅過菌的真空抽濾瓶放超凈工作臺內，打開電源真空泵開始工作，將孢子懸液倒入抽濾瓶上的漏斗中，抽濾過程應在漏斗上覆蓋四層無菌紗布，抽濾過程持續3分鐘；4、抽濾完畢，用無菌鑷子取下抽濾膜，放入無菌的空培養皿中，移入滅菌后的常溫干燥器中干燥24h ;所述的干燥器事先經70wt%乙醇擦洗兩遍達到表面消毒，并在超凈工作臺內經紫外燈照射30分鐘，使干燥器內部空間完全滅菌；5、在超 凈工作臺中將干燥好的孢子用接種鏟刮進無菌的樣品瓶內，將樣品瓶裝滿，蓋好蓋子，樣品準備完畢；6、留存部分干燥好的孢子樣品置于干燥且無菌密封管中放在干燥器內，于室溫放置與航天誘變相同時間，作為對照樣；其中本發明所述的PDA培養基的配制方法為馬鈴薯去皮，200克切成塊煮沸30min,然后用紗布過濾后補足水至IOOOmL,然后加入葡萄糖20克，瓊脂粉15克，113°C滅菌15min，倒平板。上述步驟5獲得的樣品通過搭載返回式航天器進行太空誘變，誘變獲得的干孢子經過耐高糖高酸的定向篩選獲得的菌株即為目標菌株，具體的篩選方法是:1、高糖高酸培養基的配制高糖高酸培養基:A液制作:馬鈴薯去皮，200克切成塊煮沸30min，然后用紗布過濾后補足水至lOOOmL，121°C 滅菌 15min，備用；B液制作:葡萄糖200-220克，無水檸檬酸170-190克，MgSO4.7H201.5克，K2HP043.6，硫酸銨2克，瓊脂粉22克，溶于500ml蒸餾水，113°C滅菌15min，備用；將A液和B液分別加熱至50°C，使B液充分融化后，分別取A液、B液各500毫升混合均勻，倒入培養皿中，冷卻備用即為高糖高酸培養基。2、耐高糖高酸的定向篩選取航天誘變后干孢子100 μ g到IOOml無菌水中搖勻成孢子懸液，然后10倍梯度稀釋到10_4，從10_3、10_4稀釋度各取100 μ I均勻涂布于上述高糖高酸培養基上，35°C靜止培養96h，觀察培養基表面生長出白色小菌落，即為具有耐高糖高酸性能的菌株。
由于B液中含有瓊脂粉成分，使得整個的培養基在低于40度后成為固體，故此可以將孢子直接涂布在其表面。在上述獲得的耐高糖高酸性能的菌株的基礎上，發明人進一步進行了篩選以獲得其中最為適用的菌株，其具體步驟如下:進行產檸檬酸性能的初步篩選:玉米粉液化清液培養基制作:取玉米粉液化清液制作:取100克粉碎過60目篩的玉米粉，加入300毫升水，攪拌均勻并加熱到60°C，加入高溫淀粉酶，如高溫α-淀粉酶，以10-15酶活力單位每克玉米粉計算，升溫至90°C，保持溫度攪拌液化持續4h，用濾布擠壓過濾，測定總糖濃度。取該玉米粉液化清液1000毫升，加入葡萄糖使其總糖濃度達到15%_18%，同時加Λ MgSO4.7Η201.5 克，Κ2ΗΡ043.6，硫酸銨 2 克，瓊脂粉 22 克，113°C滅菌 15min，備用。產酸性能的篩選:挖取在高糖高酸培養基中生長的菌落將其轉移至玉米粉液化清液培養基中35°C靜止培養72h，觀察培養基表面透明圈與菌落直徑比值大于5的菌落，將這樣的菌落轉移至PDA培養基的斜面中35°C靜止培養96h，待表面長滿孢子備用。之所以選擇培養基表面透明圈與菌落直徑比值大于5的菌落，是由于這種菌落中的菌株生產性能較其他的菌株更好，更適合于生產中的應用。搖瓶玉米粉液化清液培養基制作:取玉米粉液化清液制作:取100克粉碎過60目篩的玉米粉，加入300毫升水，攪拌均勻并加熱到60°C，加入高溫淀粉酶，以10-15酶活力單位每克玉米粉計算，升溫至90°C，保持溫度攪拌液化持續4h，用濾布擠壓過濾，測定總糖濃度。取該玉米粉液化清液1000毫升，加入葡萄糖使其總糖濃度達到15%_16%，MgSO4.7H201.5克，K2HP0 43.6，硫酸銨2克。每50毫升裝入500毫升三角瓶中113°C滅菌15min,備用。取上述備用孢子，接種到上述500毫升三角瓶內的50毫升玉米粉清液培養基內，350C，每分鐘300轉，振蕩培養72h后測定培養基中總酸的濃度，與誘變起始菌株比較，將與起始菌株比較產酸濃度高的菌株進行PDA斜面傳代，傳10代后，分別取2、4、6、8、10代斜面，再次進行搖瓶產酸測試，產酸水平穩定且產酸最高的菌株作為備選。發明人利用上述獲得的備選菌株進行了連續30批500噸發酵檸檬酸試驗，結果表明平均產酸達到18%，發酵周期60小時，轉化率99%，遠高于現有黑曲霉液體發酵檸檬酸技術水平。發明人對上述篩選出的菌株進行了生物保藏，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏號為CGMCC N0.5751，其狀態為存活。綜上所述，本發明所提供的檸檬酸高產菌株，該菌株命名為TN-A09，發明人對其進行了生物保藏，該菌株是耐高糖高酸、產酸高、轉化率高的檸檬酸生產菌株，利用其發酵生產檸檬酸，平均產酸達到18%，發酵周期60小時，轉化率99%，遠高于現有黑曲霉液體發酵檸檬酸技術水平。保藏信息保藏時間:2012年2月10日保藏單位名稱:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏編號:CGMCCN0.5751
保藏單位地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所分類命名:黑曲霉Aspergillus niger
具體實施例方式下面結合實施例來進一步說明本發明，可以使本領域技術人員更全面的理解本發明，但不以任何方式限制本發明。實施例1:航天誘變黑曲霉干孢子的準備1、將黑曲霉Co827接種于PDA(馬鈴薯培養基)斜面，在35°C條件下靜止培養4天，斜面長滿孢子后用無菌水沖洗孢子至帶玻璃珠的無菌三角瓶中，每支斜面洗到一只三角瓶中，用紗布包扎；2、將盛有孢子懸液的三角瓶放搖床上振蕩2小時，轉速270r/min，溫度25°C，充分打散孢子；3、將滅過菌的真空抽濾瓶放超凈工作臺內，打開電源真空泵開始工作，將孢子懸液倒入抽濾瓶上的漏斗中，抽濾過程應在漏斗上覆蓋四層無菌紗布，抽濾過程持續3分鐘；4、抽濾完畢，用無菌鑷子取下抽濾膜，放入無菌的空培養皿中，移入滅菌后的常溫干燥器中干燥24h ;所述的干燥器事先經70wt%乙醇擦洗兩遍達到表面消毒，并在超凈工作臺內經紫外燈照射30分鐘，使干燥器內部空間完全滅菌；5、在超凈工作臺中將干燥好的孢子用接種鏟刮進無菌的樣品瓶內，將樣品瓶裝滿，蓋好蓋子，樣品準備完畢；6、留存部分干燥好的孢子樣品置于干燥且無菌密封管中放在干燥器內，于室溫放置與航天誘變相同時間，作為對照樣；其中PDA培養基的配制方法為馬鈴薯去皮，200克切成塊煮沸30min，然后用紗布過濾后補足水至IOOOmL,然后加入葡萄糖20克，瓊脂粉15克，113°C滅菌15min，倒平板。實施例2:上述實施例中步驟5獲得的樣品通過搭載返回式航天器進行太空誘變。實施例3:耐高糖高酸的定向篩選高糖高酸培養基:A液制作:馬鈴薯去皮，200克切成塊煮沸30min，然后用紗布過濾后補足水至lOOOmL，121°C 滅菌 15min，備用；B液制作:葡萄糖200-220克，無水檸檬酸170-190克，MgSO4.7H201.5克，K2HP043.6，硫酸銨2克，瓊脂粉22克，溶于500ml蒸餾水，113°C滅菌15min，備用；將A液和B液分別加熱至50°C，使B液充分融化后，分別取A液、B液各500毫升混合均勻，倒入培養皿中，冷卻備用即為高糖高酸培養基。2、耐高糖高酸的定向篩選取航天誘變后干孢子100 μ g到100ml無菌水中搖勻成孢子懸液，然后10倍梯度稀釋到10_4，從10_3、10_4稀釋度各取100 μ I均勻涂布于上述固化后的高糖高酸培養基上，35°C靜止培養96h，觀察培養基表面生長出白色小菌落，即為具有耐高糖高酸性能的菌株。
實施例4:產酸性能的初篩玉米粉液化清液培養基制作:取玉米粉液化清液制作:取100克粉碎過60目篩的玉米粉，加入300毫升水，攪拌均勻并加熱到60°C，加入高溫α-淀粉酶以10-15酶活力單位每克玉米粉計算，升溫至90°C，保持溫度攪拌液化持續4h，用濾布擠壓過濾，測定總糖濃度。取該玉米粉液化清液1000毫升，加入葡萄糖使其總糖濃度達到15_18wt%，同時加Λ MgSO4.7Η201.5克，Κ2ΗΡ043.6，硫酸銨2克，瓊脂粉22克，113°C滅菌15min，即得玉米粉
液化清液培養基，備用。廣酸性能的篩選:挖取實施例3中獲得的在聞糖聞酸培養基中生長的具有耐聞糖高酸性能的菌株，將其轉移至上述玉米粉液化清液培養基中35°C靜止培養72h，觀察培養基表面透明圈與菌落直徑比值大于5的菌落，將這樣的菌落轉移至PDA培養基的斜面中35 °C靜止培養96h,待表面長滿孢子備用。實施例5:搖瓶產酸性能的復篩搖瓶玉米粉液化清液培養基制作:取玉米粉液化清液制作:取100克粉碎過60目篩的玉米粉，加入300毫升水，攪拌均勻并加熱到60°C，加入高溫α-淀粉酶，以10-15酶活力單位每克玉米粉計算，升溫至900C，保持溫度攪拌液化持續4h，用濾布擠壓過濾，測定總糖濃度。取該玉米粉液化清液1000毫升，加入葡萄糖使其總糖濃度達到15%_16%，同時加AMgSO4.7Η201.5克，Κ2ΗΡ043.6，硫酸銨2克，每50毫升裝入500毫升三角瓶中113°C滅菌15min,備用。`取實施例4中產酸圈與菌落比值大于5的菌株，在PDA斜面上的孢子，接種到上述500毫升三角瓶內的50毫升玉米粉清液培養基內，350C，每分鐘300轉，振蕩培養72h后測定培養基中總酸的濃度，與誘變起始菌株比較，將與起始菌株比較產酸濃度高的菌株進行PDA斜面傳代，傳10代后，分別取2、4、6、8、10代斜面，再次進行搖瓶產酸測試，結果與初始O代時產檸檬酸水平相同，且產酸水平最高的菌種作為備選。發明人對上述篩選出的菌株進行了生物保藏，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏號為CGMCC N0.5751，其狀態為存活，利用其發酵生產檸檬酸，平均產酸達到18%，發酵周期60小時，轉化率99%，遠高于現有黑曲霉液體發酵檸檬酸技術水平。
權利要求
1.一株檸檬酸高產菌株，其特征在于:該菌株命名為TN-A09，其保藏號為CGMCCN0.5751。
2.根據權利要求1所述的高產菌株，其特征在于:該菌株由代號Co827的黑曲霉誘變而來。
3.權利要求1所述的高產菌株的制備方法，其特征在于:具體步驟如下: (I )、將黑曲霉Co827接種于PDA斜面，在35°C條件下靜止培養4天，斜面長滿孢子后用無菌水沖洗孢子至帶玻璃珠的無菌三角瓶中，每支斜面洗到一只三角瓶中，用紗布包扎； (2)、將盛有孢子懸液的三角瓶放搖床上振蕩2小時，轉速270r/min，溫度25°C，充分打散孢子； (3)、將滅過菌的真空抽濾瓶放超凈工作臺內，打開電源真空泵開始工作，將孢子懸液倒入抽濾瓶上的漏斗中，抽濾過程應在漏斗上覆蓋四層無菌紗布，抽濾過程持續3分鐘； (4)、抽濾完畢，用無菌鑷子取下抽濾膜，放入無菌的空培養皿中，移入滅菌后的常溫干燥器中干燥24h ;所述的干燥器事先經70wt%乙醇擦洗兩遍達到表面消毒，并在超凈工作臺內經紫外燈照射30分鐘，使干燥器內部空間完全滅菌； (5)、在超凈工作臺中將干燥好的孢子用接種鏟刮進無菌的樣品瓶內，將樣品瓶裝滿，蓋好蓋子，樣品準備完畢； 上述步驟(5)獲得的樣品通過搭載返回式航天器進行太空誘變，誘變獲得的干孢子經過耐高糖高酸的定向篩選獲得的菌株即為目標菌株，其保藏號為CGMCC N0.5751。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于: 所述的耐高糖高酸的定向篩選采用高糖高酸培養基培養定向篩選，具體步驟為: 取航天誘變后干孢子100 μ g到IOOml無菌水中搖勻成孢子懸液，然后10倍梯度稀釋到10_4，從10_3、10_4稀釋度各取100 μ I均勻涂布于上述高糖高酸培養基上，35°C靜止培養96h，觀察培養基表面生長出白色小菌落，即為具有耐高糖高酸性能的菌株。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于:所述的高糖高酸培養基制備方法如下: A液制作:馬鈴薯去皮，200克切成塊煮沸30min，然后用紗布過濾后補足水至IOOOmL,121°C滅菌15min，備用； B液制作:葡萄糖200-220克，無水檸檬酸170-190克，MgSO4.7H201.5克，Κ2ΗΡ043.6，硫酸銨2克，瓊脂粉22克，溶于500ml蒸餾水，113°C滅菌15min，備用； 將A液和B液分別加熱至50°C，使B液充分融化后，分別取A液、B液各500毫升混合均勻，倒入培養皿中，冷卻備用即為高糖高酸培養基。
全文摘要
本發明涉及生物發酵領域，涉及了一株采用航天誘變手段獲得的黑曲霉孢子，通過耐受高糖高酸的定向篩選，設計出高效的科學篩選方案從而實現誘變選育獲得高產菌株，該菌株命名為TN-A09，發明人對其進行了生物保藏，其保藏號為CGMCCNo.5751，該菌株是耐高糖高酸、產酸高、轉化率高的檸檬酸生產菌株，利用其發酵生產檸檬酸，平均產酸達到18%，發酵周期60小時，轉化率99%，遠高于黑曲霉液體發酵檸檬酸現有技術水平。
文檔編號C12Q1/04GK103194398SQ20131012216
公開日2013年7月10日 申請日期2013年4月10日 優先權日2013年2月27日
發明者王德培, 寇光智, 李昌濤, 周一江, 劉劍雄, 高曉彤 申請人:日照魯信金禾生化有限公司, 天津科技大學