一株高產l-亮氨酸工程菌及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一株高產L-亮氨酸工程菌及其應用。本發明提供了制備重組菌的方法，包括如下步驟：將α-異丙基蘋果酸合成酶突變體編碼基因導入目的菌中，得到重組菌；所述α-異丙基蘋果酸合成酶突變體為將α-異丙基蘋果酸合成酶第494位精氨酸突變為組氨酸、第497位甘氨酸突變為天冬氨酸和第499位亮氨酸突變為纈氨酸得到的酶。本發明的高產L-亮氨酸的工程菌，特別是谷氨酸棒桿菌Corynebacterium glutamicum MD0032具有比目前國內生產菌株更高的L-亮氨酸產酸率，具有獨特的鑒定標簽，是一株極具生產應用價值的L-亮氨酸的生產菌株。CCTCC NO: M 20146202014.12.04
【專利說明】一株高產L-亮氨酸工程菌及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物【技術領域】，尤其涉及一株高產L-亮氨酸工程菌及其應用。
【背景技術】
[0002] L-亮氨酸與L-異亮氨酸（L-isoleucine)、L-繳氨酸（L-valine)的分子結構中 含有一個甲基側鏈，而被稱為支鏈氨基酸（branched chain amino acids，BCAA)。L-亮氨 酸作為人體必需的八種氨基酸之一，是合成人體激素、酶類的原料，具有促進蛋白質合成和 抑制分解的效果，但體內無法自身合成。因此，L-亮氨酸在食品、醫藥、飼料和運動保健領 域具有廣泛的應用及商業價值，而且隨著對L-亮氨酸功能的不斷開發，其應用領域正逐漸 擴大，市場也在持續攀升。
[0003] 目前，L-亮氨酸的生產方法主要以發酵法生產為主導，其中，發酵法生產L-亮氨 酸以日本企業占主導地位，其中尤以日本味之素公司為主，其在L-亮氨酸產量和品質均具 有明顯優勢，大罐產酸能力達30-35g/L，糖酸轉化率為22-28%，并可達70%以上的提取 率，合計年產量400-500噸。迄今為止，工業化L-亮氨酸生產菌主要通過傳統誘變篩選獲 得的，這種經典育種方法雖可獲得L-亮氨酸相對高產的優良菌株，但是該法也會引入有害 突變，使目標菌株生長緩慢，雜酸增多。另外，這種方式工作量大，周期長，很難在短期內進 一步提高目標物產量。為了克服這些問題，理性化代謝工程育種正成為L-亮氨酸高產菌株 獲得的主要方式，也是L-亮氨酸高產菌株的育種趨勢。
【發明內容】
[0004] 本發明的一個目的是提供一種制備重組菌的方法。
[0005] 本發明提供的方法，包括如下步驟：將α -異丙基蘋果酸合成酶 (2-isopropylmalate synthase，IPMS)突變體編碼基因導入目的菌中，得到重組菌；
[0006] 所述α -異丙基蘋果酸合成酶突變體為僅將α -異丙基蘋果酸合成酶氨基酸序列 第494位精氨酸突變為組氨酸、第497位甘氨酸突變為天冬氨酸、第499位亮氨酸突變為 纈氨酸，且不改變其他氨基酸殘基得到的蛋白質；其與α-異丙基蘋果酸合成酶比，僅是第 494、497、499這3個位置的氨基酸不同，其他氨基酸殘基均相同。
[0007] 所述α -異丙基蘋果酸合成酶氨基酸序列為序列表中序列7 ;
[0008] 所述目的菌為失活蘇氨酸脫水酶編碼基因、丙氨酸轉氨酶編碼基因、乳酸脫氫酶 編碼基因、D-泛酸合成酶編碼基因和亮氨酸合成調節子編碼基因活性的谷氨酸棒桿菌突變 菌。
[0009] 上述方法中，所述α -異丙基蘋果酸合成酶突變體的編碼基因的核苷酸序列為序 列表中序列1。
[0010] 上述方法中，所述目的菌按照包括如下步驟的方法制備：將谷氨酸棒桿菌基因組 中的蘇氨酸脫水酶編碼基因替換為蘇氨酸脫水酶編碼基因突變基因 Δ ilvA、丙氨酸轉氨酶 編碼基因替換為丙氨酸轉氨酶編碼基因突變基因 Δ alaT、乳酸脫氫酶編碼基因替換為乳酸 脫氫酶編碼基因突變基因 AldKD-泛酸合成酶編碼基因替換為D-泛酸合成酶編碼基因突 變基因 ApanBC和亮氨酸合成調節子編碼基因替換為亮氨酸合成調節子編碼基因突變基 因 Λ ltbR，得到的谷氨酸棒桿菌突變菌；
[0011] 所述Δ ilvA的核苷酸序列為序列表中序列2 ;
[0012] 所述AalaT的核苷酸序列為序列表中序列3 ;
[0013] 所述Λ Idh的核苷酸序列為序列表中序列4 ;
[0014] 所述ApanBC的核苷酸序列為序列表中序列5 ;
[0015] 所述Δ ItbR的核苷酸序列為序列表中序列6。
[0016] 上述方法中，所述谷氨酸棒桿菌為谷氨酸棒桿菌ATCC13032。
[0017] 由上述的方法制備的重組菌也是本發明保護的范圍。
[0018] 上述重組菌為谷氨酸棒桿菌 Corynebacterium glutamicum MD0032CCTCC NO:CCTCCM 2014620。
[0019] 上述重組菌在制備L-亮氨酸中的應用也是本發明保護的范圍。
[0020] 本發明的另一個目的是提供一種制備L-亮氨酸的方法。
[0021] 本發明提供的方法，包括如下步驟：發酵上述重組菌，收集發酵產物上清液，即得 到L-亮氨酸。
[0022] 上述方法中，所述發酵條件為在發酵培養基中28-31°C、200-230r/min振蕩培養 15-55小時；
[0023] 或所述發酵條件為在發酵培養基中28-31°C、培養45-55小時，其使所述發酵過程 中發酵體系中的溶氧量為25-45%，葡萄糖含量為0. 3-0. 7g/100mL。
[0024] 谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum)MD0032簡稱谷氨酸棒桿菌 MD0032,已于2014年12月4日保藏于中國典型培養物保藏中心（簡稱CCTCC ;地址： 中國武漢，武漢大學；郵編：430072)，保藏編號為CCTCC Ν0:Μ 2014620,分類命名為 Corynebacterium glutamicum MD0032〇
[0025] 本發明的實驗證明，本發明的高產L-亮氨酸的工程菌，特別是谷氨酸棒桿菌 Corynebacterium glutamicum MD0032具有比目前國內生產菌株更高的L-亮氨酸產酸率， 具有獨特的鑒定標簽，是一株極具生產應用價值的L-亮氨酸的生產菌株。試驗證明，本發 明的L-亮氨酸工程菌株，30L發酵罐發酵40h，產酸率達40. 5g/L，處于國內領先水平。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0026] 圖1為重組質粒pZ8-l_leuAl^結構示意圖。
【具體實施方式】
[0027] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0028] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0029] 以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規生化試劑廠家購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平 均值。
[0030] 谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum)獲自美國模式培養物集存庫 (http://www.atcc. org/，簡稱 ATCC)，ATCC 編號為 13032,簡稱谷氨酸棒桿菌 13032。
[0031] 實施例1、工程菌的構建
[0032] 一、外源高效表達161^#重組載體的構建
[0033] UleuA基因的克隆及定點突變
[0034] 1)、以谷氨酸棒桿菌13032的基因組DNA為模板，用Fl和Rl組成的引物進行PCR 擴增，得到PCR擴增產物（IeuA基因片段）。
[0035] Fl: 5 ' -GAATTCATGCCAGTTAACCGCTACATGCCT-3' ；
[0036] Rl: 5 ' -GTCGACTTAAACGCCGCCAGCCAGGAC-3'。
[0037] 其中，Fl帶有EcoR I酶切位點，Rl帶有Sal I酶切位點（上述引物的劃線部分序 列）。
[0038] PCR擴增條件：95°C預變性5分鐘；94°C變性40秒、59°C退火1分鐘、72°C延伸2 分鐘，30個循環；72°C反應10分鐘，4°C保溫。
[0039] 2)、回收步驟1)的PCR擴增產物T-A克隆連接至Simple pMD-18T克隆載體（購 自于寶生物工程（大連）有限公司），得到克隆質粒pMDleuA。
[0040] 3)、以步驟1)的重組質粒pMDleuA為模板，用F2和R2引物進行PCR擴增（將IeuA 基因片段進行定點突變，將定點突變后的基因命名為IeuAi基因），得到PCR擴增產物（模 板與突變后的環狀質粒的混合物）。
[0041] F2:5 ' -ACGTCACCGTCGATGGCC Q( CGGCAACG Qi CCCA Q TG-3?；
[0042] R2:5 ' -GGCCATCGACGGTGACGTCCTTGCCGTTGT-3'。
[0043] 其中引物中的劃線部分為互補序列，方框中的序列為突變選擇點。
[0044] 4)、將步驟3)的PCR擴增產物用DPN I酶處理1小時（去除模板），得到重組質粒 pMDleuA*〇
[0045] leuA#基因與野生型IeuA基因的差異僅在于第1481位的堿基由G突變為A，其對 應編碼的第494位精氨酸突變為組氨酸；第1490位的堿基上由G突變為A，其對應編碼的 氨基酸第497位甘氨酸突變為天冬氨酸；第1495位的堿基由C突變為G，其對應編碼的第 499位亮氨酸突變為纈氨酸。
[0046] 2、pZ8-l-leuA#高效表達質粒的構建
[0047] 1)、用限制性內切酶EcoR I和Sal I雙酶切pMDleuA*載體，回收約1750bp的片 段。
[0048] 2)、用限制性內切酶EcoR I和Sal I雙酶切載體pZ8-l (記載在如下文 獻中：Expression of the Corynebacterium glutamicum panD Gene Encoding L-Aspartate-a-DecarboxyIase Leads to Pantothenate Overproduction in Escherichia coli? APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Vol. 65, No. 4 ； 1530 -1539,1999.公眾可從福建師范大學和福建省麥丹生物集團有限公司獲得），回收約7000bp 的載體骨架片段。
[0049] 3)、將步驟1)的基因片段和步驟2)的載體骨架片段連接，得到重組載體 pZ8-l_leuA*〇
[0050] 經過測序，重組載體pZ8-l-leuA#為將序列表的序列1自5'末端第1至1746位 核苷酸所示的IeuAi基因（編碼IPMS蛋白）插入載體pZ8-l的EcoR I和Sal I酶切位點 之間中得到的載體，重組載體PZS-I-IeuAi的結構示意圖見圖1。
[0051] 二、目的菌的構建
[0052] 1、自殺載體敲除重組載體的構建
[0053] I)、pkl8 Δ ilvA重組載體的構建
[0054] (1)根據公布的谷氨酸棒桿菌的基因組信息，設計融合PCR引物，采用重疊延伸 PCR的方法，獲得部分基因缺失的Λ ilvA基因。首先通過ilvA-Ι與ilvA-2引物擴增ilvA 基因的上游序列，ilvA-3與ilvA-4引物擴增ilvA基因的下游序列。PCR擴增條件為：95°C 預變性5分鐘；94°C變性40秒、55°C退火40秒、72°C延伸40秒，30個循環；72°C反應10分 鐘，4 C保溫。
[0055] iIvA-I :5' -GAATTC AGGAGAAGATTACACTAGTCAACC-3'
[0056] iIvA-2 :5 ' -AACTACAGACCTAGAACCTA TGCAGCCGATGCTTCGTCGAAG-3 '
[0057] iIvA-3 :5 ' -TAGGTTCTAGGTCTGTAGTTATGATGAGCGCGACCGAGGGCGC-3 '
[0058] iIvA-4 :5 ' -GTCGAC TTAGGTCAAGTATTCGTACTCAG-3 '
[0059] PCR反應結束后采用PCR產物回收試劑盒（購自于生工生物工程（上海）股份有 限公司）分別回收ilvA基因的上游片段（約為480bp)和下游片段（約為480bp)。
[0060] (2)、以步驟⑴獲得的ilvA基因的上游片段和下游片段互為模板，同時加入引物 ilvA-Ι與ilvA-4,進行重疊延伸PCR，擴增截短的ilvA基因（AilvA基因）。PCR反應條件 為：95 °C預變性5分鐘；94°C變性40秒、57 °C退火1分鐘、72 °C延伸1分鐘，30個循環；72 °C 反應10分鐘，4°C保溫。
[0061 ] PCR反應結束后采用PCR產物回收試劑盒回收約為960bp大小的產物片段，并進行 T-A克隆，連接至Simple pMD-18T克隆載體（購自于寶生物工程（大連）有限公司），得到 克隆質粒pMD Δ ilvA。
[0062] (3)、用限制性內切酶EcoR I和Sal I雙酶切pMDA ilvA載體，回收約960bp的片 段。另外，用限制性內切酶EcoR I和Sal I雙酶切載體pkl8mobsacB，回收約5600bp的載 體骨架片段。
[0063] (4)、用T4DNA Iigase對步驟（3)回收的酶切片段進行連接，獲得重組自殺載體 pkl8 Δ ilvA〇
[0064] 經過測序，重組自殺載體pkl8 Λ ilvA為將序列表中序列2所示的Λ ilvA(內部基 因缺失378bp片段的ilvA基因，導致其無法編碼正常功能的蘇氨酸脫水酶基因（TD，完整 ilvA基因編碼）基因插入表達載體pkl8mobsacB (購自于中國質粒載體菌株細胞株基因保 藏中心）的EcoR I和Sal I酶切位點之間得到的載體。
[0065] 2)、pkl8AalaT重組載體的構建
[0066] 根據公布的谷氨酸棒桿菌的基因組信息，設計融合PCR引物，采用重疊延伸PCR的 方法，獲得部分基因缺失的AalaT基因。
[0067] alaT-l :5' -GAATTC GTGACTACAGACAAGCGCAAAACCTC-3'
[0068] alaT-2 :5' -AACTACAGACCTAGAACCTATTGAGGAGTGCTTGGGTGGTCATG-3'
[0069] alaT-3 :5' -TAGGTTCTAGGTCTGTAGTTACTGGACCAAAGCAATACGCACGTGG-3' alaT-4 ： 5' -GTCGAC CTACTGCTTGTAAGTGGACAGGAAG-3'
[0070] 其余步驟，pkl8 Δ alaT載體的構建方法與pkl8 Δ ilvA載體的構建方法相同。
[0071] pkl8 Λ alaT載體為將序列表中序列3所示的Λ alaT (內部基因缺失412bp片段的 alaT)基因插入表達載體pkl8mobsacB的EcoR I和Sal I酶切位點之間得到的載體。
[0072] 3)、pkl8 Δ Idh重組載體的構建
[0073] 根據公布的谷氨酸棒桿菌的基因組信息，設計融合PCR引物，采用重疊延伸PCR的 方法，獲得部分基因缺失的Δ Idh基因。
[0074] Idh-I :5' -GAATTC CTGCAGGGCATAGATTGGTTTTG-3
[0075] ldh-2 :5, -AACTACAGACCTAGAACCTA ATGACATCGCCAACGATGGACTTC-3'
[0076] ldh-3 :5' -TAGGTTCTAGGTCTGTAGTT ATCGGCATGGGTCTTGCTCGCATC-3'
[0077] ldh-4 :5' -GTCGAC TTGGTGCGAAGATGCGCGTAATG-3'
[0078] 其余步驟，pkl8 Δ Idh組件的構建方法與pkl8 Δ ilvA組件構建方法相同。
[0079] pklSAldh載體為將序列表中序列4所示的Aldh(內部基因缺失373bp片段的 Idh)基因插入表達載體pkl8mobsacB的EcoR I和Sal I酶切位點之間得到的載體。
[0080] 4)、pkl8 Δ panBC重組組件的構建
[0081] 根據公布的谷氨酸棒桿菌的基因組信息，設計融合PCR引物，采用重疊延伸PCR的 方法，獲得部分基因缺失的ApanBC基因。
[0082] panBC-Ι: 5 ' -GAATTC CATGTCAGGCATTGATGCAAAG-3 '
[0083] panBC-2:5 ' -AACTACAGACCTAGAACCTAAGCATCAACAATGCGTCGAATC-3，
[0084] panBC-3:5 ' -TAGGTTCTAGGTCTGTAGTTGCTTATCGACGCCCTCCTCC-3 '
[0085] panBC-4:5'-GTCGAC CGATCAGGGCGCACCAAATTGAAC-3'
[0086] 其余步驟，pkl8 ApanBC組件的構建方法與pkl8 Δ ilvA組件構建方法相同。
[0087] pkl8 Λ panBC載體為將序列表中序列5所示的Λ panBC (內部基因缺失427bp片段 的panBC)基因插入表達載體pkl8mobsacB的EcoR I和Sal I酶切位點之間得到的載體。
[0088] 5)、pkl8AltbR重組組件的構建
[0089] 根據公布的谷氨酸棒桿菌的基因組信息，設計融合PCR引物，采用重疊延伸PCR的 方法，獲得部分基因缺失的AltbR基因。
[0090] LtbR-I :5' -GAATTC atgaccttgaaatacacggtgaag-3
[0091] LtbR-2 :5' -AACTACAGACCTAGAACCTA ATGCAGGGTCAGCAGCGCGC-3'
[0092] LtbR-3 :5， -TAGGTTCTAGGTCTGTAGTT agcgccgcgtgcacccaatg-3，
[0093] LtbR-4 :5' -GTCGAC ATATCGTTTCATGGGACAGTATAGC-3'
[0094] 其余步驟，pkl8 Δ ItbR組件的構建方法與pkl8 Δ ilvA組件構建方法相同。
[0095] pkl8AltbR載體為將序列表中序列6所示的AltbR(內部基因缺失169bp片段的 ItbR)基因插入表達載體pkl8mobsacB的EcoR I和Sal I酶切位點之間得到的載體。
[0096] 2、菌株的代謝修飾改造
[0097] 1)、出發菌株ilvA基因的修飾
[0098] (1)、將獲得的pkl8 Δ ilvA重組載體通過電擊轉化的方法轉入出發菌株感受態細 胞ATCC13032,采用艾本德（Eppendorf)電轉儀，電擊條件為：1800V，電擊時間4-5ms，電擊 結束后，馬上加入30°C預熱的電擊復蘇SOC培養基中，30°C，120-150rpm，震蕩復蘇1-2小 時。
[0099] (2)、重組載體電擊轉入宿主之后，首先進行第一次重組，即通過單交換的方式整 體插入線性插入染色體中，此步可通過含25 μ g/mL卡那霉素的LBG平板進行篩選，復蘇培 養液涂布含有抗性選擇的LBG培養基平板中（硫酸卡那霉素抗性，抗生素終濃度25 μ g/ mL)，30°C，倒置培養24-30小時。平板上生長的克隆既為成功進行一次重組的克隆，
[0100] (3)、挑選在抗性平板上生長的單克隆接入含有3mL LB液體培養基的18X 180mm 試管中30°C，200-250rpm培養18小時，培養結束后，取IOOyL培養液涂布于含10%蔗糖 的LB平板，30°C，倒置培養16-20小時，待長出單克隆之后再分別點植LBG及LBG+卡那霉 素（終濃度25 μ g/mL)平板，進行二次重組篩選，獲得能夠再LBG平板生長，不能在LBG+卡 那霉素（25 μ g/mL)平板生長的克隆。
[0101] (4)、對獲得的二次重組的平板陽性克隆進行菌落PCR篩選及驗證，采用引物 ilvA-Ι與ilvA-4進行菌落PCR驗證（得到約為960bp，為ilvA基因缺失后的片段），并進 行測序驗證染色體ilvA基因確被AilvA基因替換，從而獲得出發菌株染色體ilvA基因修 飾后的菌株，即為谷氨酸棒桿菌ATCC13032-A ilvA，其為將谷氨酸棒桿菌ATCC13032基因 組中的ilvA基因替換為AilvA基因。
[0102] 2、ilvA基因修飾菌株基礎上的alaT基因的修飾
[0103] 在上述步驟獲得谷氨酸棒桿菌ATCC13032-A ilvA菌株的基礎上，進一步進行 alaT基因的修飾。將獲得的pkl8 Δ alaT重組組件通過電擊轉化的方式導入谷氨酸棒桿菌 ATCC13032-A ilvA菌株，其它具體方法同ilvA基因的修飾。
[0104] 最終，獲得ilvA基因修飾（AilvA)基礎上alaT修飾的菌株（AilvA/AalaT)，即 為谷氨酸棒桿菌ATCC13032-Δ ilvA/Δ alaT，經過測序，其為將谷氨酸棒桿菌ATCC13032基 因組中的ilvA基因替換為AilvA基因，且將alaT基因替換為AalaT基因。
[0105] 3、ilvA基因與alaT基因修飾基礎上Idh基因的修飾
[0106] 在上述獲得AilvA/AalaT修飾菌株的基礎上，進一步進行Idh基因的修飾。將獲 得的pkl8 Δ Idh重組載體通過電擊轉化的方式導入修飾菌株ATCC13032- Δ ilvA/ Δ alaT。 具體方法同ilvA基因的修飾。
[0107] 最終，獲得ilvA基因、alaT基因及Idh基因修飾的菌株（Δ ilvA/ Δ alaT/ Δ Idh)， 即為谷氨酸棒桿菌ATCC13032-AilvA/AalaT/Aldh，經過測序，其為將谷氨酸棒桿菌 ATCC13032基因組中的ilvA基因替換為AilvA基因，且將alaT基因替換為AalaT基因， 且將Idh基因替換為Aldh基因。
[0108] 4、ilvA基因、alaT基因、Idh基因修飾基礎上的panBC基因修飾
[0109] 在上述獲得Δ ilvA/Δ alaT/Δ Idh修飾菌株的基礎上，進一步進行panBC基因 的修飾。將獲得的pkl8 ApanBC重組載體通過電擊轉化的方式導入ATCC13032-AilvA/ AalaT/Aldh。具體方法同ilvA基因的修飾。
[0110] 最終，獲得ilvA基因、alaT基因、Idh基因及panBC基因修飾的菌株（AilvA/ Δ alaT/ Δ Idh/ Δ panBC)，即為谷氛酸棒桿菌 ATCC13032- Δ ilvA/ Δ alaT/ Δ Idh/ Δ panBC， 經過測序，其為將谷氨酸棒桿菌ATCC13032基因組中的ilvA基因替換為Λ ilvA基因，且 將alaT基因替換為AalaT基因，且將Idh基因替換為Aldh基因，且將panBC基因替換為 Δ panBC 基因。
[0111] 5、AilvA/AalaT/Aldh/ApanBC 修飾基礎上的 ItbR 基因修飾
[0112] 在上述獲得Δ ilvA/ Δ alaT/ Δ ldh/ Δ panBC修飾菌株的基礎上，進一步進行ItbR 基因的修飾。將獲得的pkl8 Δ ItbR重組組件通過電擊轉化的方式導入該修飾菌株。具體 方法同i IvA基因的修飾。
[0113] 最終，獲得ilvA基因、alaT基因、Idh基因、panBC基因及ItbR基因修飾的菌株 (Δ ilvA/ Δ alaT/ Δ ldh/ Δ panBC/ Δ ItbR)，即為谷氨酸棒桿菌 ATCC13032- Δ ilvA/ Δ alaT/ Δ ldh/ Δ panBC/ Δ ltbR，經過測序，其為將谷氨酸棒桿菌ATCC13032基因組中的ilvA基因 替換為Λ ilvA基因，且將alaT基因替換為AalaT基因，且將Idh基因替換為Aldh基因， 且將panBC基因替換為ApanBC基因，且將ItbR基因替換為AltbR基因。
[0114] 三、產L-亮氨酸工程菌MD0032的構建
[0115] 將上述一制備的高效表達質粒pZS-l-leuA"*電擊轉化上述二制備的谷氨酸棒桿菌 ATCC13032- Δ ilvA/ Δ alaT/ Δ ldh/ Δ panBC/ Δ ltbR，采用含卡那霉素抗性（終濃度 25 μ g/ mL)平板進行篩選，對陽性克隆進行質粒提取，并進行雙酶切驗證（EcoR I和Sal I酶切，得 到1750bp為陽性），確認導入？28-1-161^#高效表達質粒至菌株中，含pZ8-l-leuA #高效表 達質粒的谷氨酸棒桿菌 ATCC13032- Δ ilvA/ Δ alaT/ Δ ldh/ Δ panBC/ Δ ltbR-leuA*，即為產 L-亮氨酸的工程菌。
[0116] 將篩選獲得的產L-亮氨酸的工程菌ATCC13032- Δ ilvA/ Δ alaT/ Δ ldh/ Δ panBC/ AltbR-IeuA*命名為谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum)MD0032。
[0117] 谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum)MD0032簡稱谷氨酸棒桿菌 MD0032,已于2014年12月4日保藏于中國典型培養物保藏中心（簡稱CCTCC ;地址： 中國武漢，武漢大學；郵編：430072)，保藏編號為CCTCC Ν0:Μ 2014620,分類命名為 Corynebacterium glutamicum MD0032〇
[0118] 采用同樣的方法，將空載體pZ8_l轉入ATCC13032-AilvAMalaTMldh/ ApanBC/AltbR 中，得到重組菌 ATCC13032-Δ ilvA/Δ alaT/Δ ldh/Δ panBC/ ΔltbR_pZ8_l〇
[0119] 實施例2、谷氨酸棒桿菌MD0032生產L-亮氨酸
[0120] 一、培養基的制備
[0121] 種子培養基（pH = 6. 5-7.0):取IOOg葡萄糖、5g玉米漿、IOg赤砂糖，50g糖 蜜，IOOml豆柏水解液（購自于山東陽成生物科技有限公司，目錄號DP001)、3g酵母膏、 25g (NH4) 2S04、0. 2g MgSO4 · 7Η20、0· 05g FeSO4 · 7Η20、0· 3g KH2PO4 · 3Η20、0· 025g 單硫酸卡那 霉素和IOg碳酸鈣用去離子水溶解并定容至IL ;125°C滅菌25min。
[0122] 發酵培養基（pH = 6. 5-7. 5):取 120g 葡萄糖、150ml 豆柏水解液、27g(NH4)2S04、 5. 5g KH2PO4 · 3Η20、2· 5g K2HPO4 · 3H20、0· 2g MgSO4 · 7H20、0· 05g FeSO4 · 7H20、 0· 02gMnS04 ·Η20、200 μ g 維生素 H、200 μ g 維生素 Bl、100 μ g 維生素 B2、100 μ g 維生素 B6、 0. 025g單硫酸卡那霉素、30g CaCO3用去離子水溶解并定容至IL ;125°C滅菌25min。
[0123] 二、搖瓶發酵生產L-亮氨酸
[0124] 1、應用谷氨酸棒桿菌MD0032生產L-亮氨酸
[0125] (1)種子培養
[0126] 將一環谷氨酸棒桿菌MD0032斜面種子接種至裝有30mL種子培養基的250mL搖瓶 中，4層紗布封口，28-31°C振蕩培養（200-230r/min)至對數生長中后期（16-20小時），得 到種子液（種子液的AOD562nm= 15-25)。
[0127] (2)發酵培養
[0128] 將3mL種子液接種至裝有30mL發酵培養基的250mL三角瓶中，4層紗布封口， 28-31°C，振蕩培養（200-230r/min)45-55小時，具體為28°C，振蕩培養200r/min、55小時。
[0129] (3)將步驟（2)的發酵體系離心（4°〇、500(^、151^11)，收集上清液（發酵液）。
[0130] 2、對照液的制備
[0131] 將谷氨酸棒桿菌ATCC13032代替谷氨酸棒桿菌MD0032進行步驟1的實驗，收集上 清液（對照液1);
[0132] 將重組菌 ATCC13032- Δ ilvA/ Δ alaT/ Δ Idh/ Δ panBC/ Δ ItbR 代替谷氨酸棒桿菌 MD0032進行步驟1的實驗，收集上清液（對照液2);
[0133] 將谷氨酸棒桿菌ATCC13032-pZ8-l代替谷氨酸棒桿菌MD0032進行步驟1的實驗， 收集上清液（對照液空載體1);
[0134] 將重組菌 ATCC13032- Δ ilvA/ Δ alaT/ Δ Idh/ Δ panBC/ Δ ltbR-pZ8_l 代替谷氨酸 棒桿菌MD0032進行步驟1的實驗，收集上清液（對照液空載體2)。
[0135] 3、檢測L-亮氨酸含量
[0136] 檢測發酵液或對照液或對照液空載體上清液中的L-亮氨酸含量（采用日立 L-8800型氨基酸自動分析儀進行測定）。
[0137] 結果如下：發酵液中的L-亮氨酸濃度為12. 5g/L(上清液），對照液1中的L-亮 氨酸濃度為〇. lg/L，對照液2中L-亮氨酸濃度為3. 3g/L ;對照液空載體1中L-亮氨酸濃 度為0. lg/L，對照液空載體2中L-亮氨酸濃度為3. lg/L。
[0138] 可以看出，谷氨酸棒桿菌MD0032提高L-亮氨酸產量。
[0139] 三、工業發酵生產L-亮氨酸
[0140] 將谷氨酸棒桿菌MD0032和ATCC13032進行30L全自動發酵罐進行補料分批發酵， 具體步驟如下：
[0141] 1、第一階段培養
[0142] 采用30L發酵罐，種子培養基的裝液量為15L，培養時間為16-20小時，溶氧 (DO) 25-45 %，溫度 28-31 °C ;得到種子液（種子液的 AOD562nm= 25-35)。
[0143] 2、第二階段培養
[0144] 采用30L發酵罐，發酵培養基的裝液量為15L，培養時間為45-55小時（通過 控制流加75%的葡萄糖水溶液，維持發酵罐中的葡萄糖含量為0. 3-0. 7g/100mL)，溶氧 (DO) 25-45%，溫度28-31°C，具體為培養時間為45小時，溶氧（DO) 25-45%，維持發酵罐中 的葡萄糖含量為0. 3-0. 7g/100mL，溫度28°C。
[0145] 3、將步驟2的發酵體系（4°C、5000g、15min)，收集上清液（發酵液）。
[0146] 檢測L-亮氨酸濃度，結果如下：
[0147] 谷氨酸棒桿菌MD0032發酵液中的L-亮氨酸濃度可達40. 5g/L。
[0148] ATCC13032發酵液中的L-亮氨酸濃度為I. Og/L。
【權利要求】
1. 一種制備重組菌的方法，包括如下步驟：將a -異丙基蘋果酸合成酶突變體編碼基 因導入目的菌中，得到重組菌； 所述a-異丙基蘋果酸合成酶突變體為僅將a-異丙基蘋果酸合成酶氨基酸序列第 494位精氨酸突變為組氨酸、第497位甘氨酸突變為天冬氨酸、第499位亮氨酸突變為纈氨 酸，且不改變其他氨基酸殘基得到的蛋白質； 所述a-異丙基蘋果酸合成酶的氨基酸序列為序列表中序列7 ; 所述目的菌為失活蘇氨酸脫水酶編碼基因、丙氨酸轉氨酶編碼基因、乳酸脫氫酶編碼 基因、D-泛酸合成酶編碼基因和亮氨酸合成調節子編碼基因活性的谷氨酸棒桿菌突變菌。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述a _異丙基蘋果酸合成酶突變體的 編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列1。
3. 根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于： 所述目的菌按照包括如下步驟的方法制備：將谷氨酸棒桿菌基因組中的蘇氨酸脫水酶 編碼基因替換為蘇氨酸脫水酶編碼基因突變基因 A ilvA、丙氨酸轉氨酶編碼基因替換為丙 氨酸轉氨酶編碼基因突變基因 A alaT、乳酸脫氫酶編碼基因替換為乳酸脫氫酶編碼基因突 變基因 Aldh、D_泛酸合成酶編碼基因替換為D-泛酸合成酶編碼基因突變基因 ApanBC和 亮氨酸合成調節子編碼基因替換為亮氨酸合成調節子編碼基因突變基因△ ltbR，得到的谷 氨酸棒桿菌突變菌； 所述A ilvA的核苷酸序列為序列表中序列2 ; 所述A alaT的核苷酸序列為序列表中序列3 ; 所述A ldh的核苷酸序列為序列表中序列4 ; 所述ApanBC的核苷酸序列為序列表中序列5 ; 所述A ltbR的核苷酸序列為序列表中序列6。
4. 根據權利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于： 所述谷氨酸棒桿菌為谷氨酸棒桿菌ATCC13032。
5. 由權利要求1-4中任一所述的方法制備的重組菌。
6. 根據權利要求5所述的重組菌，其特征在于：所述重組菌為谷氨酸棒桿菌 Corynebacterium glutamicum MD0032CCTCC N0:M 2014620〇
7. 權利要求5或6所述重組菌在制備L-亮氨酸中的應用。
8. -種制備L-亮氨酸的方法，包括如下步驟：發酵權利要求5或6所述重組菌，收集 發酵產物上清液，即得到L-亮氨酸。
【文檔編號】C12N1/21GK104480058SQ201410841171
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年12月30日 優先權日:2014年12月30日
【發明者】黃欽耿, 黃建忠, 梁玲, 翁雪清, 吳偉斌, 黃祥峰, 施巧琴, 吳松剛 申請人:福建師范大學, 福建省麥丹生物集團有限公司