聚合物親和基質及其生產方法和用途的制作方法

專利名稱：聚合物親和基質及其生產方法和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于結合液體中一種或多種物質以從該液體除去所述物質和/或減少其在所述液體中的量或濃度，意在防止、去除或降低在所述液體中組分或過程所不希望有的活化的聚合物親和基質，涉及從該液體去除物質和/或減少其在所述液體中的量或濃度的方法，涉及產生所述基質的方法，涉及所述基質的用途和包含所述基質的試劑盒。
本發明還涉及聚合物基質的用途，用于產生從液體除去一種或多種物質或減少該物質在所述液體中的量或濃度的聚合物親和基質。
背景技術：
體外處理液體如血液或任何其他體液的體外處理，要求該液體接觸如管、線、珠或膜形式的材料。此類材料的采用意味著外來的從而潛在生物不相容的(例如免疫活性的或促凝血的)材料的使用。外來物質的使用與宿主免疫系統的活化有關，例如與血液中組分如淋巴細胞、血小板或不同類型的血漿蛋白質級聯有關，例如在補體或凝血級聯中的蛋白質。同時，對細胞的破壞如對例如紅血球的機械的或脅迫-誘導的破壞可導致溶血和隨后的對患者的威脅生命的并發癥。液體，比如血液或任何體液的處理，因此要求通過利用高度生物相容的材料以避免組分在所述液體例如血液中所不希望有的活化。
細菌毒素細菌內毒素和外毒素促進由于宿主中血細胞和可溶性蛋白質與所述內毒素的多重相互作用導致的活化而引起宿主中產生壓倒性的炎性免疫反應。該免疫反應被描述為臨床綜合征SIRS(全身炎性應答綜合征)、敗血癥或膿毒性休克的基本特征。該發病機理是嚴重的并且該狀況導致組織損傷、多器官衰竭和敗血癥誘導的死亡。尋找治療患有敗血病患者的新治療藥物和方法是重要的，因為最近的治療性干預研究(Dinarello等，EuropeanCytokine Network 1997；8294)不能保護患有嚴重敗血癥或膿毒性休克的患者。并且，當產生治療性物質或液體時，必須注意產品是非致熱原的，即無內毒素或內毒素濃度低于其發揮作為的允許極限。
內毒素來自革蘭氏陰性細菌例如大腸桿菌、傷寒沙門氏菌、綠膿桿菌或普通變形桿菌細胞膜外層的內毒素或“致熱原”在敗血癥、膿毒性休克和全身炎性應答綜合征(SIRS)的發病機理中起重要作用。內毒素，例如來自大腸桿菌的脂多糖(LPS)，由脂質A和多糖鏈組成(Zhringer等，Adv.Carb.Chem.Biochem.，1994)。LPS的分子結構在

圖1中顯示。脂質A組分是生物學上最活躍的部分并且介導細胞上內毒素的毒性作用。脂質A在革蘭氏陰性細菌的不同菌株內高度保守，而多糖部分更易變。
來自大腸桿菌的脂質A由兩個葡糖胺部分(在2個葡糖胺的相反末端含有2個帶負電的磷酸基)和六個連接到兩個葡糖胺環的長鏈高度疏水性脂肪酸殘基組成。內毒素的可變多糖鏈也連接到葡糖胺之一。
內毒素的去除內毒素的去除是困難的并且經常存在包括對有價值的蛋白質，即不想除去的蛋白質的回收或破壞的問題，或者是與體液或血液以及去除內毒素所用的手段的生物相容性問題。這種生物相容性問題僅僅起因于宿主防御機制的活化并且包括多重細胞活化和可溶性蛋白質如補體級聯中的細胞因子和蛋白質的釋放。所述細胞活化和蛋白質釋放可導致嚴重炎癥，即全身性敗血癥或膿毒性休克，以致組織損傷和器官衰竭為結果。凝結導致的血液凝固是生物不相容性導致的另一個問題。此外，該致熱原不能完全地被除去。
除去內毒素的公知方法包括使用加熱、酸或堿失活(美國專利號3,644,175，3,659,027和4,070,289)。此類方法經常損害最終產品的質量，即失活解毒的液體，因為此類方法的使用使該液體和其有價值的蛋白質可能被變性或失活。欲使用的其他方法包括活性炭吸附，或使用氧化劑例如高錳酸鉀、水性過氧化氫和次氯酸鈉氧化分解。
除去內毒素的常規方法從敗血病患者的血漿或全血體外除去內毒素被討論為敗血癥、膿毒性休克和SIRS的潛在治療策略。在人血漿中有幾種在介導和抑制內毒素對細胞的影響中起作用的結合蛋白，例如脂多糖結合蛋白(LBP)、殺菌的滲透性增加蛋白(BPI)、sCD14、CAP18和乳鐵蛋白。肽抗生素多粘菌素B(通過多粘芽胞桿菌產生)抑制內毒素對細胞的作用。馬蹄蟹(美洲鱟)也含有內毒素結合蛋白并且該物種的細胞裂解物被用于內毒素的檢測(鱟變形細胞溶解物試驗，LAL，或鱟試驗)。此類內毒素結合蛋白的結合基元可被用于敗血病患者的血漿或全血的體外處理。
許多內毒素結合序列的共同特征是在其結合部分存在備選的帶正電荷的和疏水的氨基酸。對于來源于馬蹄蟹的一種內毒素結合蛋白已經表明該內毒素結合序列形成一種兩親性二級結構，其中帶正電荷的殘基和疏水殘基位于環狀結構的對立面(Hoess等，EMBO J，1993)。已經提出其他的內毒素結合部位具有類似模式。
帶正電荷的聚合物如聚乙烯亞胺(mizner等，Artif.Organs，1993；Weber等，ASAIO J，1995；Petsch等，J Chromatogr.Biomed.Sci.Appl.，1998)或者二乙氨基乙基(DEAE)改性纖維素(Weber等，A.S.A.I.O.J.，1995)對內毒素具有一定吸附能力(可能基于正電荷與脂質A的帶負電的磷酸鹽殘基的相互作用)。聚乙烯亞胺的一個缺點是對肝素的高吸附和已清楚描述的與血小板的相互作用，后者導致生物不相容性問題如體內或體外應用中的凝結。
類似地，帶正電荷的膜濾器用于灌輸液體的純化。由于吸附取決于吸引的電荷并且具有較少特異性并因此也可以除去所想要的有價值的蛋白質。
已經提出用固定于瓊脂糖凝膠的精氨酸從血漿、血液和藥物溶液除去內毒素(EP0 494 848和EP0 333 474)。
WO 92/11847描述了使用一種化合物制備經口地、靜脈內地、肌內地、皮內或腹膜內使用以治療內毒素誘導的效應以及治療內毒素誘導的效應的方法。在WO 92/11847中描述的化合物沒有固定于固體支持物上。
疏水聚合物(例如聚苯乙烯，聚酰胺，聚砜和聚醚砜)也可以吸附含水溶液中的內毒素。這個性質被用于超濾膜以純化水和透析/灌輸液體，即具有低的或沒有蛋白質含量的溶液(Weber等，Int.J.Artific.Org.，1997)。然而，從血液或血漿除去內毒素引起循環血漿蛋白(LBP、BPI、sCD14)和細胞受體(例如CD14)對吸附基質的競爭問題，因為簡單的疏水吸附具有低的特異性。
利用帶正電荷的或疏水聚合物以除去內毒素顯示血漿中內毒素的結合特異性低并因此對血漿中內毒素去除的選擇性是低的。實際上，開發具有高特異性和高選擇性以及高生物相容性的內毒素吸附劑已經成為一個挑戰。
已經提出通過利用例如殺細菌/滲透性增加(BPI)蛋白質產品將來自內毒素結合蛋白的肽序列用于治療性應用(美國專利號5,639,727和5,643,875)。固定肽的一個缺點是合成的成本和需要肽被固定而不干擾結合結構。
親和性配體如組胺、組氨酸和多粘菌素B對于除去內毒素是有效的，盡管它們的有效性依賴于液體中其他的蛋白質并且存在血清蛋白像血清白蛋白或其他帶負電的蛋白質時急劇降低(Anspach和Hilbeck，J.Chromatogr.，1995，Petsch等，J.Chromatogr.，1997，EP 0 129 786)。然而，多粘菌素B對中樞神經系統有毒并且可導致腎損害，其由于有危險滲漏到患者的血液中而不利于獲得市場化批準。US 4,771,104描述了含有纖維載體的內毒素解毒材料，多粘菌素B被固定到該纖維載體。
Hirayama等(Journal of Chromatography B，271(1999)，187-195)描述了通過利用不溶于水的多聚(ε-賴氨酸)(PL)顆粒從藥物和液體除去內毒素，尤其是LPS。
局限性和遠景從蛋白質液體有效去除內毒素取決于想要的有價值蛋白質的凈電荷，內毒素將從其中除去。內毒素和其配體之間的相互作用具有疏水的和離子的特性，盡管它們中每一個的貢獻取決于液體的離子強度和pH。有效的內毒素去除也依賴于除去所述內毒素以防止例如細胞活化或血液凝固的手段的高灌注和生物相容性。
然而，雖然已經開發或提出了從液體，例如血液、其他的體液或治療性液體除去物質如內毒素的許多方法，所描述的方法沒有一個是高度生物相容的，對將要除去的物質如內毒素也沒有高度特異性和選擇性，并且沒有一個同時易于灌注，例如易于通過全血或血漿。從而期望開發高度有效的生物相容的和有效的從液體除去物質例如內毒素的方法學和方法，從而使得可能避免與現有技術設備相關的問題。在這方面，本發明闡述了該需要和利益。
為了防止、除去或減少液體中組分或過程所不希望有的活化，對于減少液體中一種或多種物質的濃度或除去該物質的新的和有效的方法和手段的需求根據上述理由，尤其是在生物醫學領域中是明顯的。這種方法和手段在敗血癥、膿毒性休克和SIRS的治療(通過體外從敗血病患者的血漿除去致熱原或其他的活性物質)中也將特別有價值。
此外，熟知將生物特異性配體例如抗體或肽結合到基質或底物并通過其從體循環或血液循環除去病理生理性的關鍵性物質。
所使用的公知材料是例如珠子或顆粒形式的瓊脂糖凝膠(sephadex，pharmacia)、聚丙烯酸酯或環氧樹脂。
公知的珠子為例如聚甲基-異丁烯酸酯制造的珠子，例如，用于LDL吸附的DALI-系統(Fresenius)；瓊脂糖凝膠例如Plasmaselect的用于纖維蛋白原吸附的Rheosorb系統，其使用了固定肽；使用結合人免疫球蛋白的經固定綿羊抗體以除去自身抗體的Therasorb-免疫吸附系統；Excorim-蛋白質A柱(和其他廠商的類似系統)，其使用經固定的細菌蛋白質結合免疫球蛋白。
公知的膜為例如聚酰胺(MAT/Merck)和通常被描述為親和性膜的其他膜。
公知的織物為例如具有用于LPS結合的具有多粘菌素B配體的Toray聚苯乙烯/聚乙烯網孔。
在使用生物學配體(如肽或抗體)的情況下，所有這些基質都被通過濕化學法的常規方法修飾，即首先相應的特異性配體形成或被分離(例如通過肽合成，通過生物技術方法)，然后被純化并且然后被固定到固體基質。
這些基質通常不允許直接在該基質上進行配體的固相合成，是因為針對固相合成中所用的化學品(用于保護基團的切割的溶劑、酸和堿等)的化學不相容性。
由于缺乏生物相容性，所以適宜固相合成的基質(例如聚苯乙烯)不適于治療的目的。
因此，允許固相合成和與血液組分(例如血漿或全血)接觸的固相基質將是有利的，因為下列理由(1)發現適當的配體(例如優化的肽結構)的開發步驟可以在相同的固體基質上進行，該固體基質以后可以用于治療性應用。這意味著必要的生物學試驗步驟(例如親合性、特異性和結合能力的測定)可以在非常類似于后面的治療應用條件下進行。根據此來自生物檢驗步驟的信息對于后面的治療或臨床應用是非常可靠的和有預言性。這節省時間和錢并且降低失敗或副作用的危險。
(2)可以以精確定義的方式(以序列和幾何學)通過固相合成形成(肽)配體。這也意味著(肽)配體與固體基質的連接(即共價連接的位置)被精確地定義。
這種基質在膨脹或濕潤行為方面有一些多少相抵觸的需求對于固相合成通常使用無水有機的(極性的如二甲基甲酰胺，或非極性的如二氯甲烷)溶劑或溶劑的混合物。另一方面，治療應用必須發生在水相環境(例如血漿，血液，治療溶液等)中。在這兩種環境(即水性和有機溶劑)中，聚合物基質必須可被容易地濕化和膨脹(1)為了能有效地除去或沖洗掉非結合的(過多)配體或結構單元(例如受保護的氨基酸)或化學品(例如偶合劑如碳二亞胺，去保護劑如有機酸或堿)，和(2)為了允許分別的毒素被從水相環境除掉，基質必須在該環境中也是可濕的和可膨脹的。
因此，公知聚合物基質的問題是你被限制于使用再生液體類型，以便不洗脫結合的活性配體而僅僅材料中被捕捉的物質被從該液體除掉，并且配體以限定的肽/分子或隨機聚合的多肽/寡聚物裝配并且然后必須同樣地結合到支持材料--你不知道你最后以什么結束。
按照本發明使用的益處是你可以直接在固體支持物上用接枝的聚乙二醇建造配體并且具有已建造的配體的固體支持物可以直接使用。這提供了使用現有技術的基質不能得到的可靠性。此外，它提供了技術上的益處，因為生物學活性/特異性配體是醫學設備的一部分并且顯影時間被縮短了(這可以允許或促進一種個性化處理)。
在開發過程中，本發明的材料不是公知的或者不可預見其突出的結果。預期的缺點是例如聚合物基質將膨脹并且堵塞穿過設備的流體。此外，當應用像全血的液體時，預計壓力降將太高。最后，作為上面事情的結果，預計液體經過固相材料的灌注是不充分的。
根據優選實施方案之一的聚合物基質已經被證明對于蒸汽滅菌和其后的干燥是杰出的。干燥后，殘留的空氣可以通過加入鹽水溶液用于聚合物基質再次膨脹而容易地除去并且備用。這導致臨床上短的準備時間，其在例如緊急事件中和高工作量時是重要的。
此外，該材料顯示出瞬間濕潤，而用于不同類型配體的最常用固體支持物不能瞬間濕潤。這是作為活性配體的固相材料的一個非常重要的特征。甚至該材料能在一定范圍內被壓縮和解壓，并且該材料在補體激活、接觸活化、細胞毒性和粒細胞活化方面是生物相容的。
發明概述因此，本發明的主要目的是通過提供用于除去和/或減少液體中以上所不希望有的物質例如內毒素的量或濃度的一種高度生物相容的、特異性、可選擇的和容易灌注的聚合物親合性基質，即具有現有技術的全部益處并且沒有不利之處的聚合物親和基質，從而消除與現有技術相關的問題。
根據本發明的第一方面完成了該目的，即用聚合物親和基質結合液體中一種或多種物質用于從該液體除去所述一種或多種物質和/或減少所述液體中所述物質的量或濃度，意在防止、消除或減少所述液體中組分或過程所不希望有的活化，其中所述基質含有a)固體支持物b)至少一種結合該固體支持物的間隔臂，并且，其偶聯至每一間隔臂c)含有至少一個具有至少一個官能團的結合單元的配體，所述配體具有定義的三維結構，其在電荷和/或疏水性/親水性方面與所述物質的結合基元的三維結構互補，其中聚合物親和基質能夠有選擇地結合所述一種或多種物質。
在一個優選的實施方案中，本發明涉及用于除去內毒素以減少液體中組分或過程所不希望有的活化的聚合物親和基質，其中該基質提供了具有與所述內毒素的結合基元的三維結構具有互補性的三維結構配體，由此允許該內毒素的結合。
在本發明聚合物親和基質的優選實施方案中，固體支持物為交聯的聚苯乙烯，間隔臂為聚乙二醇，配體的至少一個結合單元為氨基酸，并且每一官能團為氨基或胍基。
在用于除去內毒素以減少液體活化的優選實施方案中，聚合物親和基質中每個結合單元含有一個在或者接近血液生理pH的、帶正電荷的氨基酸，最優選地精氨酸、賴氨酸、半胱氨酸或組氨酸，或另一個具有至少一個在或者接近血液生理pH的、帶正電荷的官能團的二-或三-官能分子。這種聚合物親和基質產生約1×102-1×106道爾頓的截流并且能用于結合疏水和/或親水物質。
另一方面，本發明涉及用于從液體除去一種或多種物質和/或減少其在所述液體中的量或濃度以防止、消除或減少所述液體中組分或過程所不希望有的活化的方法，該方法包括將該液體與本發明的聚合物親和基質接觸，接觸時間為足夠減少所述目標物質的量或濃度和/或除去所述目標物質的時間，優選不超過24小時，最優選1秒到2小時。然而，該期間取決于流速、柱大小和應用模式，即該處置是否在直接體內、間接體內或體外進行。優選地，經除去或減少后所述物質的量或濃度低于血液中活化組分或過程的能力或者可防止血液中組分或過程的活化。
另一方面本發明涉及產生本發明聚合物親和基質的方法，該方法包括下面的步驟a)將間隔臂連接至固體支持物以得到第一復合體和b)將配體連接至所述第一復合體，其中所述配體含有至少一個具有至少一個官能團的結合單元，或c)將間隔臂連接至含有至少一個具有至少一個官能團的結合單元的配體，以得到第二復合體，和d)將固體支持物連接至所述第二復合體，或e)將間隔臂連接至固體支持物以得到第一復合體，和f)在結合至固體支持物的間隔臂上固相合成配體，或g)在固體支持物上通過接枝直接由單體合成間隔臂，和h)將含有至少一個具有至少一個官能團的結合單元的配體連接至所述第一復合體，或i)在固體支持物上通過接枝直接從單體合成間隔臂，和k)在結合至固體支持物的間隔臂上固相合成配體，其中關于所要結合的物質中結合基元的三維結構、電荷和疏水/親水區的存在的信息收集自X射線晶體學、蛋白質測序、蛋白質建模或疏水性和親水性計算，并且使得含有結合單元的配體在電荷和/或親水性/疏水性方面與所述物質的結合基元互補。
另一方面，本發明涉及聚合物親和基質的用途，用于從液體除去一種或多種物質，優選地內毒素，或者減少所述液體優選體液或治療性液體最優選血液中該物質的量或濃度。
在另一方面，本發明涉及用于從液體除去一種或多種物質和/或減少所述液體中該物質的量或濃度，意在防止、消除或減少所述液體中組分或過程所不希望有的活化，所述試劑盒含有聚合物親和基質，采樣管，和用于所述液體，優選地血液或血清的體外和/或體內處理的設備。
本發明聚合物親和基質的使用將優化對液體如血液、任何其他體液或治療性液體的處理，用于除去一種或多種物質如內毒素，和/或減少該物質的量或濃度，以防止、消除或減少所述液體中組分或過程所不希望有的活化。
特別地，本發明的高度生物相容的和可灌注材料的使用對于聚合物親和基質使用中防止液體的活化是重要的。這對于從敗血病患者的血漿或血液體外除去內毒素尤其重要并且被公開為敗血癥、膿毒性休克和SIRS的潛在治療策略。作為另一益處，本發明聚合物親和基質的使用將減少患者的治療時間。
當與附圖和所附權利要求一起考慮時，從下面的詳細描述可以使得本發明的其他益處和特點更加明顯。
附圖簡述圖1是LPS分子的脂質A部分與其結構成分的示意圖。
圖2A和2B是本發明聚合物親和基質的屬于樹狀結構(2A)和梳狀結構(2B)的配體的實例示意圖。
圖2C顯示了具有環狀配體結構的聚合物親和基質的實例。
圖3A-3B顯示怎樣通過使用結合基元中的結構要求和正電荷、疏水區和最佳距離產生內毒素的互補構造的。
圖4描述了產生本發明聚合物親和基質的不同方式。
圖5顯示與PS-PEG-珠子孵育不同時間點(1、10和120分鐘)后人血漿中內毒素的水平。
圖6A-6G顯示與沒有基質的珠子，即參照物(PS-PEG參照物)相比，將摻有LPS的血液用PS-PEG-Arg8珠子處理后對單核細胞中內毒素誘導的胞內IL6產生的抑制。
圖7A-7D顯示測量白細胞(WBC)和紅細胞(RBC)數、血小板(THR)數和血細胞比容(HCT)而顯示的PS-PEG Arg8珠子的生物相容性曲線。
圖8顯示在全血中使用PS-PEG-Arg8珠子后缺乏TCC(最終補體復合體)形成。
圖9顯示在全血中使用PS-PEG-Arg8珠子后沒有彈性蛋白酶釋放。
圖10顯示在全血中使用PS-PEG-Arg8珠子后沒有TAT(凝血酶-抗凝血酶III復合體)的形成。
圖11A-11B顯示含有經優化用于LPS結合的-Arg8和-Arg4結合單元的配體的三維結構。
圖12a顯示PS-PEG-Arg8和PS-PEG-Arg4相對珠子質量(克)的曲線擬合朗繆爾等溫線。
圖12B顯示PS-PEG-Arg8和PS-PEG-Arg4相對于精氨酸摩爾數的曲線擬合朗繆爾等溫線。
發明詳述如上所指出，本發明涉及用于從液體如血液、任何其他的體液或治療液體除去物質以降低液體中組分或過程的活性，同時具有充分特異性以避免其他有價值的物質例如血液的生理學組分被吸附的聚合物親和基質。所述基質提供了具有某一結構的配體，該結構與要去除或減少其量或濃度的物質例如內毒素的結合基元的結構互補。
定義在本發明上下文中，術語”除去...物質”旨在表示防止、減少、降低、中和、失活、分解、修飾、清除、結合或掩蔽一種物質，而不總是指該物質的零量或零濃度。此外，術語“減少物質的量或濃度”旨在指減少或降低液體中物質的量或濃度足以防止或抑制液體中組分和/或液體中細胞和/或非細胞生物學的機制的活化。
術語“防止、消除或減少組分或過程的所不希望有的活化”指以直接或間接方法失活、抑制、降低、減少、縮小、減緩或防止液體中例如血液或組織細胞中某一化學物質、生物學或生化過程，例如血漿蛋白質級聯如信號轉導途徑、補體或凝血過程和/或這些過程中所涉及組分的活化。物質的“直接”除去反映該方法沒有任何中間步驟，而”間接”除去意味著除去長鏈反應或級聯反應一部分的物質，而除去較早期的某一物質將防止、減慢或抑制下游目標事件。這意味著從例如血液除去一種物質可得到失活的或者較少活化的血液。而且，此處意味著液體如血液活化的防止。
術語“液體”旨在包括任何液體，如任何氣體或液體，如懸浮液或溶液，包括常規的溶液，例如水性或有機溶液，或血液，任何體液或治療液體，用于生命科學應用的液體如生物學的、診斷的或生物技術應用中的液體，例如緩沖液、輸注液、或透析液，用于營養的液體和用于工業用途的液體。
該術語“體液”旨在包括血液、血漿、腦脊髓液、腹水和再輸注液體(例如血濃縮以后)、從健康供體得到的用于輸液的血液制品，如血漿、血小板濃縮物、紅血球濃縮物。
術語“治療液體”旨在包括手術環境中的腹膜透析液、血液透析濃縮物和透析用水、替換液/在線制備的液體、輸注液體、靜脈營養液體、灌洗液體和用于血液組分制備、血液代用品(例如氧氣載體，改性的血紅蛋白溶液，人工的血紅蛋白溶液)的液體。
術語“用于生命科學應用的液體”旨在包括用于細胞培養組織工程、分子生物學(例如用于PCR技術的蛋白質和酶溶液)、細菌學、分析學和藥物制劑的液體和/或介質。
術語“用于營養的液體”旨在包括飲用水、戶外使用的液體和用于飲食濃縮物或粉末重構的液體。
術語“固體支持物”旨在指固相或支持物或不溶基質，在其上面可以用或不用銜接物或間隔臂合成或者偶聯分子，所述分子例如多肽形式的配體。
術語“官能團”旨在指特定原子，或原子團，其給予分子即本發明基質中的結合單元例如氨基酸、脂肪酸、糖類、凝集素、核苷酸和它們的衍生物或它們的組合一種特定化學特性或結構，例如正電荷或負電荷、疏水性或親水性、和/或其他的理化力，例如范德華力和芳基間的π-π-相互作用或形成其他鍵，如氫鍵或共價鍵的能力。氨基酸上官能團的實例為-COOH，OH，-SH，胍基和-NH2，但是也可以是被取代的氨基或者帶正電荷的基團或其混合物。
術語“結合單元”旨在指術語“官能團”定義中如上所述的分子，其中所述分子負責結合將要除去和/或減少的物質，含有至少一個官能團并且被包括在本發明聚合物親和基質中結合間隔臂的配體中。
術語“結合基元”旨在指將要除去的物質上單一的或重復的三維結構的和化學的基元。
術語“配體”指通過間隔臂結合到基質的完整三維分子，即含有至少一個具有一個官能團的結合單元。配體與將要除去的物質上的結合基元形成三維互補結構并結合到該結合基元。這里，“互補”旨在指三維和幾何上限定義的結構，其特征是能夠與將要除去的物質的結合基元以三維互補結構精確配對。
與某一化合物相關的術語“其衍生物”指一種或多種這樣的化合物，它們被以這種方式衍生使得它們具有和原來的化合物具有相同的或基本相同的功能。
此外，構成配體的化合物的異構體也旨在包括在本發明的范圍內，只要它們顯示出和原來的化合物相同或基本相同的功能。在結構式中，α和ε，根據用于氨基酸的命名法，定義用于共價偶聯其他分子的氨基。
術語“物質”旨在指至少一種可溶或不可溶的組分或目標分子，其旨在結合結合單元。物質的實例為可活化血細胞的有毒物質，如來自病毒和細菌的物質，例如內毒素、血細胞群體，如淋巴細胞、血小板、粒細胞、樹突狀細胞、單核細胞、內皮細胞、干細胞、腫瘤細胞；或者來自代謝活動的血液組分或產物，如葡萄糖衍生的分子或其降解產物、血液凝固蛋白質、促凝血蛋白質、炎性或促炎性蛋白質、細胞因子、生長因素、激素、細胞因子、尿毒癥毒素，和巨噬細胞移行抑制因子。血液組分的實例為導致例如傳染性疾病的傳染性物質，包括病毒顆粒、朊病毒，或寄生蟲、真菌、含有病原的血細胞，以及超過劑量的藥物、病原性食品添加劑或不是來自身體的其他組分。還包括致熱原，尤其是細菌性致熱原、細菌外毒素、革蘭氏陽性細菌產物，如脂胞壁酸(lipoteichonic acid)、來自慢性的急性的代謝障礙，作為例如糖尿病、肝病、尿毒癥或腎疾病或炎癥，以及粘連級聯(例如可溶性粘連分子)的產物。將要除去的優選物質為例如來自革蘭氏陰性細菌的內毒素，如LPS，以及細菌的DNA或片段或其降解產物，和寡核苷酸、肝素、磷酸鹽、血細胞、可溶的或細胞表面結合蛋白質。
術語“間隔臂”旨在指形成鏈的分子，例如聚合物，其通過成為固體支持物的一部分并使具有至少一個含有至少一個官能團的結合單元的配體遠離固體支持物并使得其較少受到來自固體支持物的位阻并且更容易被物質，例如內毒素、細胞群體或血液組分結合而修飾固體支持物。間隔臂分子可以是線性的和/或分支的和/或環狀形式。間隔臂長度在此處需要根據從將要除去的物質的結構而預先確定。
術語“距離分子”旨在指配體內的雙官能分子，其具有(如果想要)在結合單元和下面的通式I和II中定義的三官能分支分子之間和/或間隔臂和所述三官能分支分子之間產生結構距離的功能。該距離分子也可以是環狀形式。
術語“致熱原”和尤其是“細菌性致熱原”定義了產生發燒，更通常為細菌來源的物質，例如內毒素。
這里，術語“生物相容性”旨在指缺乏或沒有活化例如細胞、凝結、補體級聯或類似的過程的活化能力，意思是基質的使用不導致患者免疫系統的活化，或者至少如果這種活化發生，其也僅僅是微小的程度。這意味著生物相容化合物或物質的使用不會導致例如血液或其他體液中組分或過程的任何不需要的或所不希望有的活化以及機械或脅迫誘導的細胞死亡或細胞裂解。
聚合物親和基質為了在足夠結合和吸附各種物質的本發明聚合物親和基質中產生多樣性，配體可含有1-100個官能團，優選1-32個官能團。
本發明的聚合物親和基質可以是珠子、凝膠狀結構、膜或膜的部分、薄膜或網或它們的組合形式。
特別地，當基質根據本發明組成時，其將產生約1×102到1×106道爾頓的限定截留并且沒有任何限制地結合疏水和親水物質。
在一個優選實施方案，聚合物親和基質為PS-PEG珠子(例如TentaGel，可從Rapp Polymere Tubingen得到)的形式，使用PEG作為間隔臂。用作間隔臂的PEG的優點為在有機和水性溶劑中珠子的良好膨脹性，并由于其半流體性質，其允許如在液體中類似的擴散過程，所述液體優選地擴散系數接近于水，即40％。
生物相容性根據本發明，聚合物親和基質當被用于專門應用，如全血的體外處理時顯示出高生物相容性的優選形式。高生物相容性意味著某些特征將比其他的特征更重要。例如，無補體激活是重要的，補體激活通過測定早期復合體形成和根據Deppisch等(Kidney Int.37696-706)進行終末補體復合體定量。此外，患者期望低的血栓形成。血栓形成的程度根據Deppisch等(Neuphrol.Dial.Transplant Suppl.317-23，1994)通過凝血酶-抗凝血酶III復合體(TAT)的定量來測量，并且在血液或血漿處理中不應該增加。此外，還包括處理前后白細胞和紅細胞穩定的血細胞數以及沒有由于接觸而引起的細胞活化。穩定的血細胞數指低程度的或基本上沒有由于脅迫、活化或機械損傷導致的對血細胞的傷害。
蛋白酶如通過例如粒細胞或嗜中性粒細胞活化時產生的彈性蛋白酶在患有細菌性敗血癥和膿毒性休克的患者中不斷增加((Heiden等，Thromb.Hemost.1996)。嗜中性彈性蛋白酶也被建議作為感染的早期和有效的標志物(Jensen等，Scand.J Clin.Lab.Invest，1996；Groenenveld等，Cytokine，1995)。彈性蛋白酶的測量可給出關于生物相容性的額外信息，并且因此其水平不應該在血液處理過程中變化。
配體為了能夠產生與所要除去的物質如內毒素的結合基元互補的配體，必須形成三維結構。這可通過使用例如彈性的或剛性多肽結構實現，該結構可以以最佳方法容易地合成所要求的三維結構。這種聚合物可以是線性的或分支的，例如為樹-或梳狀結構或環狀結構。對這種三維結構的形成有益的是使用氨基酸，因為它們提供了本性上的彈性。偶聯這種聚合物例如多肽的化學過程是本領域中熟知的。在本發明一個優選實施方案中，這種聚合物指含有一個以上，通常多達約一百個氨基酸的聚合物，即通過肽鍵相互連接的寡聚體。線性聚合物的實例為通過相鄰殘基的α-羧基和α-氨基之間的酰胺鍵形成的多肽或寡肽，分支聚合物的實例為通過包括一種或多種非α氨基的酰胺鍵形成的多肽或寡肽。
如上所述，該配體分子可以是環狀形式。通過配體結構內兩個適當的官能團之間的共價偶聯，例如通過氧化在兩個SH基團之間的二硫鍵(-SS-)(也在天然的蛋白質結構中發生的環化反應)形成環狀結構。
圖2A和2B顯示與結合到固體支持物的間隔臂相偶聯的配體的分別為不同分支的、樹狀的和梳狀結構的實例。在這些結構中，配體基本上由賴氨酸殘基建成，并且每個配體中結合單元為精氨酸殘基。本發明的聚合物親和基質中包括的配體可以兩個下面的式子代表通式I-X1n-Ym[X2i-Z1；X3j-Z2]1/2(m+1)在代表樹狀結構的通式I中，不同符號具有下面的意義n＝0或1；m＝2k-1；k＝0到10，其中如果k＝0，那么X2＝X3并且Z1＝Z2；i＝0或1；并且j＝0或1，通式II-(X1n-Y1[Y2m[X2i-Z1；X3j-Z2]1/2(m+1))r-X4p-Z3]在代表梳狀結構的通式II中，不同的符號具有下面的意義
n＝0或1；m＝2k-1；k＝0到10，其中如果k＝0那么X2＝X3并且Z1＝Z2；r＝1-100；i＝0或1；j＝0或1；且p＝0或1。
Z1，Z2和Z3每一代表結合單元，并且每一為有機分子，所述有機分子選自氨基酸、肽、脂肪酸、糖類、凝集素、核苷酸及它們的衍生物或它們的組合，其中Y，Y1和Y2每一代表三官能分支分子，其中含有的官能團選自氨基、羥基、醛、異氰酸根、異硫氰酸根、硫醇、馬來酰亞胺、環氧及它們的衍生物或它們的組合，并且其中X1，X2和X3每一為任選的雙官能距離分子，其含有的兩個官能團選自氨基、羧基、羥基、醛、異氰酸根、異硫氰酸根、硫醇、馬來酰亞胺、環氧及它們的衍生物或它們的組合。
圖2C中顯示了具有環狀配體結構的聚合物親和基質的實例。在該結構式中R指-Lysm[Arg](m+1)，其中m＝2k-1，并且顯示了其中k＝0，1，和2的實例。
從而，本發明聚合物親和基質中配體的至少一個結合單元含有至少一個官能團，優選地氨基或胍基或取代的氨基或至少一個所述官能團。
優選地，選擇的氨基酸所具特征是在或接近生理pH特別是血液pH≥7.2時帶正電荷的，即pK約≥6.0的氨基酸。這些優選的氨基酸的實例為精氨酸(Arg)、賴氨酸(Lys)和組氨酸(His)。所述氨基酸的混合物也可用于基質的配體以產生進一步的可變性。
最優選地，配體含有作為結合單元的精氨酸并且組成≤3毫摩爾/g基質。通常，氨基酸的量至少約為0.01-5毫摩爾/g基質。
在實施方案中，當分支配體的結合單元含有精氨酸時，每個配體的精氨酸數目為2-100個精氨酸分子，優選地4-8個分子，稱為Arg4-8。此外，通過使用三官能即含有三個官能團(這里為兩個氨基和一個羧基)的氨基酸，如賴氨酸，可以產生分支結構。這種使用所謂的多重抗原性肽MAP的方法已經被Tam等介紹并且在美國專利號5,229,490中描述。通過改變分支的數目，可以改變末端基團例如含有末端正電荷官能團的帶正電荷精氨酸的簇和距離，如以上及圖2中所討論的。
在本發明的一個特定實施方案中，其中內毒素為將要通過聚合物親和基質除去的物質，氨基酸官能團的正電荷保持一定距離，該距離通過如圖3中所示的內毒素中單個帶負電的磷酸基之間的距離定義。
如上面所討論的，氨基酸的量和構型產生聚合物親和基質中互補配體的可變性，并因此可變以產生足夠的可變性用于吸附多種物質。在本發明的另一個實施方案中，氨基酸的量為至少約0.01、0.1、1、2、3、4或5毫摩爾/g基質。
設計含有結合單元的配體為了獲得物質的互補結構，從本領域公知的方法收集信息用于研究關于結構、保持一定距離的正電荷的存在以及與帶電基團接近的疏水區存在的關系，例如通過如在實施例1中所描述的及圖3和11中所示的X射線晶體學、蛋白質測序、蛋白質建模或疏水性和親水性計算。
在優選實施方案中，所要除去的物質為內毒素，如含有脂質A的LPS，并且本領域技術人員熟知的關于例如分子內帶電磷酸基之間的結構和距離的信息被用于形成聚合物親和基質中具有至少一個結合單元的配體。該實施方案中形成配體的聚合物通過氨基酸例如精氨酸和/或賴氨酸合成。然而，也可使用其他的氨基酸，如組氨酸或半胱氨酸。
在作為與將要除去的物質例如內毒素的結合基元互補部分的本發明Arg4-8實施方案中，作為結合單元的所述精氨酸具有下列性質以除去內毒素，如圖3所示a)存在保持一定距離的正電荷，該距離最佳地符合脂質A中帶負電的磷酸基的距離，b)接近帶電基團的疏水區允許與脂質A的脂肪酸部分進行疏水性相互作用，和
c)a)和b)中所述性質的組合產生允許最佳結合的脂質A的互補結構。
間隔臂本發明的聚合物親和基質含有間隔臂，其基本上為疏水的或親水的，通過成為固體支持物的一部分而修飾固體支持物，并且具有配體的錨定部分的功能，所述配體含有至少一個具有至少一個官能團的結合單元。
優選地，聚乙二醇(PEG)被用作間隔臂分子，其為線性的或分支構型，優選的平均分子量為400-10 000道爾頓并且通過式H-(OCH2CH2)n-OH代表，其中n為約2-250。PEG鏈的靈活性使得毒素分子容易接近配體聚合物的三維結構中。
此外，在本發明的另一個實施方案中，可以為固體支持物提供相同或不同種類的兩個或更多間隔臂，例如聚乙二醇、聚環氧丙烷、聚乙烯醇、聚乙烯胺、聚縮水甘油(polyglycidoles)或聚乙烯亞胺和其衍生物。
備選地，例如當所要結合的物質的互補結合基元的三維結構允許沒有間隔臂而發生結合時，不要求在聚合物親和基質中存在間隔臂。從而，根據本發明的實施方案，結合單元直接結合固體支持物。
固體支持物固體支持物應該在多孔性和大小排阻特征中提供可變性。并且，它應該提供固相合成中的支持用于優選實施方案中的多肽合成。可用于本發明的不同固體支持物即聚合物在EP 0 187 391，WO 99/17120和美國專利號4,908,405中描述。這里，固體支持物為線性的和/或分支的生物相容的具有0.05-10％交聯度的接枝共聚物，并且選自聚乙烯醇、聚羥基苯乙烯、從氯甲基化聚苯乙烯和乙二醇產生的聚合物；式H-(OCH2CH2)nOH的聚-或寡乙二醇，其中n代表2到250，用羥基官能化的聚丙烯酸酯或聚甲基丙烯酸酯；和其衍生物。本發明中，上面提到的交聯度可以高達50％。
固體支持物材料除上面提到的之外還選自聚苯乙烯，羥基烷基-聚苯乙烯，羥基芳基-聚苯乙烯，羥基烷基芳基聚苯乙烯，多羥基烷基化聚苯乙烯，多羥基芳基化聚苯乙烯，異氰酸根合烷基-聚苯乙烯，異氰酸根合芳基-聚苯乙烯，羧基烷基-聚苯乙烯，羧基芳基-聚苯乙烯，氨基烷基-聚苯乙烯，氨基芳基-聚苯乙烯，交聯的聚乙二醇，聚丙烯酸酯，聚甲基丙烯酸酯，纖維素，硅石，糖類，乳膠，環烯共聚物，玻璃，其他適宜的聚合物或它們的組合。固體支持物的形式可以是珠子，膜，顆粒，例如納顆粒，網，織造織物和非織造織物，纖維簇，管，薄膜，薄片或它們的組合，或交聯的互穿網絡。在一個優選實施方案中，如上所述的親和基質由交聯的聚苯乙烯組成，PEG作為間隔臂接枝到交聯的聚苯乙烯上。
本發明中優選的固體支持物材料為珠子，其大小足夠提供高度可灌注和生物相容的支持體，例如聚苯乙烯，優選地與作為間隔臂的PEG組合，賴氨酸和/或精氨酸連接于間隔臂上，該珠子應該對親水或疏水物質沒有限制。適宜的可通過商業途徑得到的珠子的列表如表1所示。
表1商業途徑可得到的活化的珠子aToyo Pearl HW70EC(TosoHaas)Toyo Pearl HW65EC(TosoHaas)Toyo Pearl AF650M(TosoHaas)TentaGel(Rapp Polymer)Eupergit C250L(Rohm)Eupergit 250(Rhm)Fractogel EMD Epoxy(M)(Merck)Fractogel EMD Azlactone(S)(Merck)Poros EP(Perkin Elmer-Biosystems)a可調節上面商業途徑可得到的活化的珠子用于配體的固定聚合物親和基質的可灌注性當聚合物親和基質被水合，并且由于水合膨脹時形成水凝膠樣結構。膨脹量定義為由于聚合物的水合從干燥狀態形成水合和膠狀基質的膨脹。這種膨脹可被定義為當水合時每體積單位重量增加，并且當比較干燥和水合形式的聚合物親和基質時，其可根據本發明為約1.5-10倍，優選3-5倍。該溶脹度允許全血完全地灌注穿過基質，仍然保持血細胞和數目完整。
如上所述，在優選實施方案中，這種聚合物親和基質產生具有允許血細胞灌注的約1×102-1×106道爾頓的限定的截留并且對親水和/或疏水物質幾乎沒有限制的基質。
除去物質的方法本發明還涉及從液體除去一種或多種物質和/或減少所述液體中該物質的量或濃度以防止、消除或減少所述液體中組分或過程所不希望有的活化的方法，其包括將液體與本發明的聚合物親和基質接觸足以減少所述物質的量或濃度和/或除去所述物質的時間。在使用該方法的一個優選實施方案中，從血液或任何其他的體液除去物質例如內毒素，將因此直接或間接地防止例如血細胞通過結合上面對“物質”定義下所列的所不希望有的物質的活化。優選地，這可通過將液體與上面定義的聚合物親和基質接觸不超過24小時，最優選1秒到2小時的時期，得到較少活化的血液和組分或防止它們的活化。
在一個優選實施方案中，根據本發明中公開的方法除去的物質為內毒素。本發明還涉及定義的血細胞類型或群體的除去，這些血細胞類型或群體選自白細胞例如T細胞和B細胞單核細胞、血小板、粒細胞和/或嗜中性粒細胞。通過提供含有至少一個結合單元和具有與物質的結合基元的結構互補的結構的配體，還打算通過上述聚合物基質除去的為胞外或胞內信號轉導途徑中的組分，它們選自葡萄糖和其降解產物、羰基化合物、炎性和促炎性蛋白質和/或參與血栓形成或補體級聯中的蛋白質、來自細菌的成分、內毒素、細胞、血細胞、細菌和病毒、或含有病原的血細胞、或其至少部分或降解產物、DNA或其片段、或磷酸鹽。
在優選實施方案中，內毒素，例如LPS，在例如靜態孵育或固相柱灌注期間在兩個小時內被除去而小于50％。
在該優選實施方案中，內毒素約1秒到約且包括2小時的限定時間期間被除去至使血液失活或防止血液的活化的量，如根據LAL測定法所測量的，該測定法如下所述。使用LAL測定法是本領域中公知的并且將提供關于內毒素水平的信息。根據本發明的方法(該方法是快速且有效的)在1秒-2小時的上述時間期限內將產生根據LAL測定法的內毒素水平，該內毒素水平低于活化血液的能力，或者僅僅輕微地活化血細胞和組分。
產生聚合物親和基質的方法產生本發明的聚合物親和基質的方法包括以下步驟a)將間隔臂連接至固體支持物以得到第一復合體和b)將配體連接至所述第一復合體，其中所述配體含有至少一個具有至少一個官能團的結合單元，或c)將間隔臂連接至含有至少一個具有至少一個官能團的結合單元的配體，以得到第二復合體，和d)將固體支持物連接至所述第二復合體，或e)將間隔臂連接至固體支持物以得到第一復合體，和f)在結合至固體支持物的間隔臂上固相合成配體，或g)在固體支持物上通過接枝直接由單體合成間隔臂，和h)將含有至少一個具有至少一個官能團的結合單元的配體連接至所述第一復合體，或i)在固體支持物上通過接枝直接從單體合成間隔臂，和k)在結合至固體支持物的間隔臂上固相合成配體，其中關于所要結合的物質中結合基元的三維結構、電荷和疏水/親水區的存在的信息收集自X射線晶體學、蛋白質測序、蛋白質建模或疏水性和親水性計算，并且使得含有結合單元的配體在電荷和/或親水性/疏水性方面與所述物質的結合基元互補。
在一個實施方案中，上述方法還包括根據下面的方法產生含有具有固定于固體支持物上的配體的間隔臂分子的基質，如在圖4中詳細顯示的那樣；對于上面的a)和b)活化固體支持物，將間隔臂分子偶聯至固體支持物，合成含有結合單元的配體，和將配體定點偶聯至間隔臂分子，或對于上面的c)和d)合成含有結合單元的配體，將間隔臂分子偶聯至配體，活化固體支持物，和將間隔臂配體復合體定點偶聯至活化的固體支持物，或，對于上面的e和f)活化固體支持物，將間隔臂分子偶聯至活化的固體支持物，和在該支持體上固相合成含有結合單元的配體。
上述含有步驟a)-f)的方法還在第二個實施方案中包括以下特定步驟，對于a)和b)，活化間隔臂，將活化的間隔臂偶聯至固體支持物，和將配體偶聯至所述活化的間隔臂，或，對于c)和d)，合成配體，活化間隔臂，將配體定點偶聯至活化的間隔臂分子，和將間隔臂-配體復合體偶聯至固體支持物，或者，對于e)和f)，活化間隔臂，將活化的間隔臂偶聯至固體支持物，和在結合至固體支持物的間隔臂上固相合成配體。
如上所述，通過本發明優選的為上面的方法，其中通過活化固體支持物、偶聯間隔臂分子和在固體支持物上直接固相合成含有結合單元的配體來固定固體支持物、間隔臂和配體。
聚合物親和基質的用途本發明還涉及使用本發明的聚合物親和基質，優選地用于從液體除去一種或多種物質，優選地內毒素，或減少所述液體中的量或濃度，優選地體液或治療性液體，最優選地血液，尤其用于產生較少活化的血液或防止血液中組分或過程的所不希望有的活化。聚合物親和基質優選地用作體外血液凈化過程或與血液或血流接觸的部分，例如作為接觸血液或體液，例如血管系統，血管或腹膜腔的身體植入物。
含有聚合物親和基質的試劑盒在一個實施方案中，本發明涉及從液體除去一種或多種物質和/或減少所述液體中該物質的量或濃度意在防止、消除或減少所述液體中組分的所不希望有的活化的試劑盒，所述試劑盒含有根據本發明的聚合物親和基質采樣管和用于所述液體，優選地血液或血漿的體外和/或體內處理的設備。
結論本發明提供了以高效且省時的方法從液體除去物質的方法。這通過利用高度生物相容的且由于好的溶脹度而允許全血流過本發明的聚合物親和基質而實現。該有效方法也歸因于產生含有與所要除去的物質的結合基元互補的結合單元的配體。因此，本發明可應用于例如體外血液處理如治療性應用的透析和輸液醫學，干細胞治療和/或治療性細胞療法，診斷應用以及用于生物技術，生物工程，基因技術，食品化學和水制備和/或純化。
本發明還涉及聚合物基質的用途，用于產生從液體除去一種或多種物質或者減少所述液體中該物質的量或濃度的聚合物親和基質，其中特異親和性取決于應用于聚合物基質上的配體，其中聚合物基質包括固體支持物和間隔臂，其中固體支持物由選自聚苯乙烯，聚乙烯醇，聚羥基苯乙烯，由氯甲基化聚苯乙烯或聚丙烯酸酯產生的聚合物，用羥基官能化的聚甲基丙烯酸酯，羥烷基聚苯乙烯，羥基芳基-聚苯乙烯，羥烷基-芳基-聚苯乙烯，多羥基烷基化聚苯乙烯，多羥基芳基化聚苯乙烯，異氰酸根合烷基-聚苯乙烯，異氰酸根合芳基-聚苯乙烯，羧基烷基-聚苯乙烯，羧基芳基-聚苯乙烯，氨基烷基-聚苯乙烯，氨基芳基-聚苯乙烯，聚甲基丙烯酸酯，交聯的聚乙二醇，纖維素，硅石，糖類，乳膠，環烯共聚物，玻璃或它們的組合，優選交聯的聚苯乙烯，并且其中間隔臂選自式H-(OCH2CH2)n-OH的聚-或寡乙二醇，其中n代表2-250。
在本發明的一個優選的實施方案中，固體支持物具有珠子，凝膠，膜，顆粒，網，織造的和非織造織物，纖維簇，管，薄膜，薄片或它們的組合，或交聯的互穿網絡的形式。
在本發明的另一個優選的實施方案中，間隔臂是線性和/或分支構型的聚乙二醇(PEG)并且具有400-10 000道爾頓的平均分子量或其衍生物。
在本發明的另一個優選實施方案中，聚合物基質具有充足的溶脹度以允許血漿或全血的灌注。
在本發明的另一個優選實施方案中，聚合物基質的溶脹度約1.5-20倍，優選地2-6倍，從干燥狀態到水合形式。
在本發明的另一個優選實施方案中，聚合物基質具有凝膠類型珠子的形式。
在本發明的另一個優選實施方案中，所述液體為水性或有機溶液、體液優選血液、治療性液體、用于生命科學應用的液體優選為生物學的、診斷的或生物技術應用中的緩沖液、輸注液或透析液、從健康供體得到的血液制品比如用于輸注的血漿、血小板濃縮物、紅血球濃縮物、血液替代物優選地載氧體、經修飾的血紅蛋白溶液和人造血紅蛋白溶液、用于營養的液體和工業用途的液體。
在本發明的另一個優選實施方案中，聚合物基質約1×102到約1×106道爾頓的截留值(cut off value)并且結合疏水和/或親水物質。
在本發明的另一個優選實施方案中，固體支持物為交聯的聚苯乙烯，間隔臂為聚乙二醇。
體外血液處理中可適用的特異性結合結構的合理開發需要(i)合成配體的靈活技術和(ii)對生物相容性、毒理學和加工性能的基本要求。應用固相肽合成得到在生物相容的聚合物物質上裝配的充分定義的配體結構，其根據一個優選實施方案為對生物學物質特異的聚苯乙烯-聚乙二醇的接枝共聚物。
通過系統地改變配體基元的幾何結構，我們可以證明相對于結構單元的摩爾濃度，配體親和性增加10到100倍。這些研究在人血清中即存在競爭性蛋白質時進行。
通過在人血漿和/或全血中體外測定法進行血液相容性的評定。有或者沒有配體的PS-PEG基材在補體激活、接觸活化、細胞毒性和粒細胞活化方面是生物相容的。
基礎聚合物結構尤其對于體外應用顯示出有利的生物相容性特征。用于配體合成的技術允許處理特異性聚合物材料而不產生有毒殘留物。
實施例實施例1 含有LPS結合單元的配體的設計該實施例描述了(不限制本發明)用于除去LPS的含有結合單元的配體的設計。
原理毒素(例如LPS)的有效除去需要具有與所要除去的物質的結合基元互補的結合單元的配體。這包括所要除去的物質的三維方面和分子的精確安排以優化對特征像互補電荷、疏水性和親水性的生物特定識別。這與前面提到的特征的適當距離一起，將完成配體及其結合單元。而且，聚合物基質內這種配體的總的三維展示應該對于高灌注、配體展示和配體的柔韌性在空間上是最佳的。高生物相容性仍然是患者體內和體外血液純化的先決條件。在所描述的基質中，可及性比得上乃至和非固相水性溶液相同。LPS的結構在圖1中顯示。所提出的與LPS的互補結合在圖3A-D顯示，其中認為LPS的磷酸基和疏水尾部形成互補的結合基元。建議的結構顯示的是圖2中的Arg4和Arg8并在圖11中以三維形式顯示。Arg8在圖11B的左邊圖中顯示了一半的精氨酸位置并在右邊圖中顯示了另一半的位置。此外，顯示了間隔臂(這里為PEG)的連接。
分子模擬進一步應用分子模擬以檢驗該描述的結合部位的三維幾何和化學結構。在Silicon Graphics Octane2工作站上進行模擬，使用InsightII-Package Molecular Simulations Inc.(MSI)，圣地亞哥，CA)和其中包括的優化算法，例如AMBER-力場。分別在圖11A和B中顯示關于Arg4和Arg8的樹狀空間排列的結果。這里，插圖顯示基質的三維終末部分的原理，該基質沒有PEG間隔臂或固體支持物。
配體的合成根據圖4合成配體及其結合單元，其中圖解了三個不同路線。三種方法中優選的方法是直接在連接至固體支持物的PEG間隔臂上固相合成。在其他實施例中使用此處的結合單元。
實施例2 分支和線性配體的比較該實施例描述對來自人血漿的內毒素的吸附。該實施例還顯示用于吸附內毒素的線性的和分支配體之間的比較。
原理將珠子與肝素化人血漿孵育兩個小時。孵育兩個小時后使用LAL測定法確定內毒素水平。
材料使用下面的珠子

步驟在37℃于肝素化血漿中進行珠子的孵育。緩慢攪拌樣品并在孵育2小時后通過離心除去珠子。
分析進行LAL測定法以測定用珠子孵育后內毒素水平。通過LAL誘導的生色物質反應進行測定(Chromogenics，Mlndal，瑞典)。根據在肝素化人血漿中用指定濃度的內毒素得到的標準曲線計算水平。
結果使用LAL測定法在2小時的孵育后發現下面的內毒素濃度。
內毒素(IU)/mlPS-PEG-LBP 94-108 10PS-PEG-BPI 85-99 9PS-PEG-Arg82PS-PEG-NH-Ac 10無珠子8起始值10討論該實驗表明通過在PS-PEG-珠子上使用分支的三維基質，內毒素水平可以減少5倍。具有線性配體的珠子沒有那么有效并且在這些樣品中內毒素水平仍然在或接近內毒素的起始水平。
實施例3 內毒素結合的動力學該實施例顯示當具有三維基質，優選用于LPS結合的珠子與血漿孵育并在不同時間點分析時內毒素結合的動力學。
原理吸附動力學取決于聚合物基質的結構和交聯程度。珠子與肝素化人血漿孵育。1、10和120分鐘后取出樣品。使用LAL測定法確定內毒素水平。
材料使用下面的珠子

步驟在37℃于肝素化血漿中進行珠子的孵育。緩慢攪拌樣品并在孵育1，10，120分鐘后去除樣品。通過離心去除珠子。
分析如實施例2中進行LAL測定法以定量內毒素水平。
結果圖5顯示在不同時間點測量的內毒素水平的結果。該圖顯示需要2小時以有效除去，即產生樣品起始水平的20-30％內毒素剩余。含有精氨酸(PS-PEG-Arg)的線性配體僅僅除去內毒素量的一半，即120分鐘后處于60％剩余水平上。類似地，當加入參考珠子(PS-PEG-NH-Ac)時，與珠子孵育120分鐘后內毒素的量仍然未變，即處于起始值。
實施例4 聚合物的末端氨基酸和分支的影響該實驗顯示配體的末端氨基酸和(精氨酸與賴氨酸相比較)的影響和分支、非分支的與4-倍對8-倍分支相比較的影響。
原理珠子與有或者沒有內毒素的肝素化人血漿孵育。兩個小時后使用LAL測定法確定內毒素水平。
材料使用下面的珠子

分析如實施例2中所示進行LAL測定法。
結果內毒素(IU/ml)PS-PEG-Arg80.4PS-PEG-Lys81.8PS-PEG-Arg40.01PS-PEG-Lys42.7PS-PEG-NH-Ac 7.8PS-PEG-Arg 3.5無珠子 11孵育前，即起始值 13討論該結果表明分支配體比線性配體更有效，并且在內毒素的去除中精氨酸比賴氨酸有效幾倍(對于Arg8和Arg4分別為4倍和200倍)。而且，在孵育2小時后除去內毒素方面PS-PEG-Arg4最有效。
實施例5 在CD14+單核細胞中內毒素依賴的IL6誘生的減少該實施例描述通過使用PS-PE-Arg8減少人單核細胞中依賴內毒素進行的IL6誘導。
原理單核細胞應答LPS導致開始轉錄和表達IL6。上調的IL6水平可以在4小時后通過胞內流式細胞計數法分析(FACS)測量。
材料使用來自全血的人單核細胞。PS-PEG-Arg8用于除去內毒素并且PS-PEG-NH-Ac被包括作為對照物。脂多糖(大腸桿菌菌株055B5，來自Biowittaker Co.)用于體外刺激MNC。使用FACSCAN Calibur(BecktonDickinson)進行FACS分析。
步驟用10或30 IU/ml LPS在37℃(5％CO2)孵育全血30分鐘。樣品平行地用和不用PS-PEG-Arg8珠子以及對照珠子PS-PEG-NH-Ac進行孵育。細胞在PermFix(Beckton Dickinson)中固定并用抗-CD14-FITC和抗-IL6-PE進行復染色。每個細胞樣品計數20 000個細胞，用于FACS分析。單核細胞定義為正常地組成總細胞群體的約5％的CD14+細胞。
分析單核細胞定義為細胞懸浮液中的CD14+細胞。胞內IL6(icIL6)根據內標校正，并在細胞與10或30IU/ml LPS孵育30分鐘后使用FACS分析在CD14+細胞群體中定量。使用CellQuest軟件包(Beckton Dickinson)進行計算。
結果使用FACS數據和對其進行的計算，由本領域技術人員對CD14+單核細胞群體的分析產生下面在圖6中顯示的數據。該圖所示為當使用PS-PEG-Arg8珠子時與對照珠子(PS-PEG-NH-Ac)和不包含珠子的樣品相比，內毒素水平減少70％。IL6的胞內水平在直方圖中顯示。在右手側，可以看到用PS-PEG-Arg8珠子孵育后IL6水平降低。左下排顯示新鮮細胞中缺乏胞內IL6。
討論該實驗顯示在人CD14+單核細胞群體中對LPS刺激的快速和完全的抑制，該抑制通過單核細胞中依賴LPS的IL6上調的抑制來測量的。
實施例6 全血灌注后細胞計數該實施例描述了(不限制本發明)穿過珠子上聚合物親和基質灌注后血細胞的可滲透性。
原理血液純化需要不對細胞產生破壞或引起細胞活化。機械損傷，尤其是紅血球的機械損傷，可以導致溶血和隨后的威脅生命的并發癥。根據本發明的水凝膠樣聚合物基質可以令人驚奇地通過全血細胞灌注。
材料使用高度可膨脹的聚合物基質-PS-PEG-Arg8珠子。將柱子(ID20mm)裝滿1g基質，吸收4-5ml水，隨后用生理鹽水溶液預漂洗備用。然后柱子用于全血的灌注。
步驟使用層流中無菌設備穿過柱子灌注新鮮的具有檸檬酸鹽和LPS(30IU/ml)的全血。以5ml/分鐘在37℃灌注摻有LPS的全血。灌注前后取出血樣并分析。所分析的細胞為紅細胞(RBC)，血細胞比容(HTC)和游離血紅蛋白，白細胞(WBC)，血小板，和血小板數目(TRC)。
通過庫爾特計數器(Becton Dickinson)在珠子灌注之前和之后計數細胞數。
游離血紅蛋白被測量為紅血球全溶解后通過在405納米處用光度計定量總的血紅蛋白水平。通過在405納米處用光度計定量測量血漿中游離血紅蛋白顯示全血灌注后紅血球的完整性。
結果和討論測定細胞數和HCT并且結果在圖7A(血小板)，7B(HCT)，7C(RBC)和7D(WBC)中顯示。另外，沒有發現游離血紅蛋白增加，即沒有誘導溶血(數據未顯示)。來自該實驗的數據顯示，由于最初的稀釋效應，在最初的短暫停留時間后，細胞數目穩定到柱前值。數據表明基材具有約100％的可滲透性，因為柱前細胞計數和柱后細胞計數相同。而且，細胞保持完整，如通過活細胞計數和紅細胞裂解所測量的。
實施例7 生物相容性特征該實施例描述了PS-PEG-Arg8基質的部分生物相容性特征。
原理生物相容性或非相容性在這里通過補體激活、彈性蛋白酶釋放和凝血酶抗凝血酶III復合體形成血栓而測定。
材料如實施例6，纖維素材料被用作參照物。
方法使用特異性酶聯免疫吸附測定(ELISA；Diagnostic Product Co.)測量來自全血灌注的血漿中的彈性蛋白酶。
根據Deppisch等(Kidney Int.37696-706)通過終末補體復合體(TCC蛋白質)的定量測量補體激活。根據Deppisch等(Neuphrol.Dial.TransplantSuppl.317-23，1994)測量TAT-血栓形成的程度。
結果在圖8中，隨時間顯示TCC的形成。
參照珠子PS-PEG-NH-Ac(TG基材或參照材料)顯示TCC形成增加4-5倍。對于PS-PEG-Arg8，在10-15分鐘的最初上升后，TCC形成穩定在灌注前水平。
在圖9中，隨時間測量彈性蛋白酶的水平。與柱前值相比水平沒有變化。顯示了35分鐘內的測量。對于參考材料，彈性蛋白酶水平在35分鐘內增加8-9倍。
在圖10中，隨時間顯示TAT的形成。沒有檢測到TAT形成的增加。
討論生物相容性特征在體外和體內血液處理，例如透析中是重要的。所描述的基質與所包括的參考材料相比沒有顯示補體系統的活化，沒有凝血體系的活化并且沒有彈性蛋白酶釋放，即高的生物相容性。這以及如在實施例6中所示全血的高灌注能力，表明本發明的聚合物親和基質高度適合于血液，包括全血的體外治療。
實施例8 其他內毒素吸附實驗已經進行了內毒素吸附實驗以便表明發現裝配用于內毒素結合的配體的官能團(即精氨酸殘基)的特異性幾何學定義的排列的重要性。可以表明內毒素結合不僅僅取決于精氨酸的量(即正電荷)而且定義的幾何排列更重要。
步驟將人血清(作為人體液如血液、血漿等的代表)摻入限定量(即3IU/ml和10EU/ml)的內毒素并與含有作為配體的Arg8排列或者Arg4排列的40mg PS-PEG-珠子孵育。兩種珠子/配體排列含有不同量的精氨酸Arg4含有0.72mmol/g，Arg8含有1.89mmol/g。Arg8珠子較高的精氨酸含量是賴氨酸分叉導致的額外分支的結果。孵育30分鐘后，測量上清液血清中內毒素的游離(即未結合表面或基質)濃度。
分析表2 使用人血清進行孵育實驗的結果

這些數據通過使用描述配體-受體相互作用和在固體表面平衡(例如蛋白質吸附)(參考JD Andrade蛋白質吸附原理JD Andrade(編輯)生物醫學聚合物的表面和界面.卷2，蛋白質吸附，Plenum Press，紐約1985，1-80頁)的朗繆爾法分析。通過結合到配體-基質的毒素(即內毒素)量(從加入的量和孵育后上清液中剩余的量的差計算)除以基質中存在的配體總數目對上清液中毒素的平衡濃度(即孵育后內毒素濃度)作圖進行分析。然后將圖與朗繆爾等溫線的數學表達式擬合，朗繆爾等溫線給出不同基質結合配體對毒素的親和性或結合常數。在圖12A和12B中顯示了朗繆爾法的實例。
進行了兩種朗繆爾作圖，它們在定義基質中存在的配體總數的方法不同(1)忽視珠子的不同精氨酸含量，即通過僅僅用珠子的質量(克)測量配體總數(圖12A)；在配體-聚合物-基質的實際應用中，例如在將要用人體液如體外循環中的血液或血漿灌注的吸附設備中，使用該方法證明是合理的，配體-聚合物-基質在一定程度上受到將要裝入設備中以實現患者毒素濃度治療性地有效減少的珠子的總質量或體積的限制。該限制例如涉及設備內的壓降、對血液組分(蛋白質和細胞)的非特異性作用或甚至對該設備的存儲空間。
(2)考慮珠子的不同精氨酸含量，將珠子的質量(g)除以精氨酸負荷(mmol/克)作為對配體總數目的量度(圖12B)；由于精氨酸含量是產生配體-聚合物基質中主要的成本因素，該方法被證明是有道理的。結果描述了從經濟觀點的配體效率。
在表3中顯示了不同朗繆爾繪圖的平衡參數。
表3從擬合曲線得到的平衡參數

結果和討論親和常數描述并表征了配體能夠多強烈地結合毒素，而與所存在的配體的量無關。令人驚奇地，Arg8配體的親和常數比Arg4配體的親和常數大10倍以上(即為12.3倍)。
飽和濃度描述各自的配體-基質可以結合毒素的最大量，假定可以得到無限量的毒素。令人驚奇地，Arg8配體-基質的飽和濃度比Arg4配體-基質的飽和濃度大2倍以上(即為2.8倍)。因為根據朗繆爾吸附模型，飽和濃度完全與親和常數無關，這可以一種方式解釋為Arg8配體的特異性幾何排列影響配體-基質對毒素的可接近性(例如，通過影響配體-基質的PEG-部分的形態學(例如晶體樣相對于液體))。
下面的例子闡明基質的量對提高Arg8配體-基質內毒素的親和性的重要性和相關性，該基質的量是實現毒素濃度的治療性相應減少所必需的。在敗血病患者中發現內毒素濃度為0.1到1EU/ml(例如Nakamura等，Renal Failure 2000；22225-234)。假定處理開始時血漿濃度為0.3EU/ml，處理后血漿濃度為0.03EU/ml并且血漿體積為4000ml，這表示處理過程中1080EU內毒素必須結合到配體-基質。使用各自配體的親合常數和飽和濃度從朗繆爾表達式計算需要結合該內毒素量的基質量。處理末的濃度為平衡濃度。使用表3的平衡數據，該計算表明對于Arg8配體-基質，僅僅需要83g，而對于Arg4配體-基質，需要1201g以實現治療目標。因為兩種配體-基質具有類似的密度(質量/體積)，這意味著吸附設備的體積和大小對于Arg8配體將小得多，其有利于血漿或血液的灌注。
權利要求
1.聚合物親和基質，其用于結合液體中一種或多種物質以從該液體除去所述物質和/或減少所述液體中所述物質的量或濃度，意在防止、除去或減少所述液體中組分或過程所不希望有的活化，其中所述基質包含a)固體支持物；b)至少一種結合該固體支持物的間隔臂，并且，其偶聯至每一間隔臂；c)含有至少一個具有至少一個官能團的結合單元的配體，其中聚合物親和基質能夠有選擇地結合所述物質。
2.根據權利要求1的聚合物親和基質，其中所述配體具有定義的三維結構，該結構在電荷和/或疏水性/親水性方面與所述物質的結合基元的三維結構互補。
3.根據權利要求1或2的聚合物親和基質，其中配體以下式表示-X1n-Ym[X2i-Z1；X3j-Z2]1/2(m+1)(通式I)，其中n＝0或1；m＝2k-1；k＝0到10，其中如果k＝0，那么X2＝X3并且Z1＝Z2；i＝0或1；并且j＝0或1，或-(X1n-Y1[Y2m[X2i-Z1；X3j-Z2]1/2(m+1)]r-X4p-Z3)(通式II)，其中n＝0或1；m＝2k-1；k＝0到10，其中如果k＝0那么X2＝X3并且Z1＝Z2；r＝1-100；i＝0或1；j＝0或1；且p＝0或1；其中Z1，Z2和Z3每一代表結合單元，并且每一為有機分子，所述有機分子選自氨基酸、肽、脂肪酸、糖類、凝集素、核苷酸及它們的衍生物或它們的組合，其中Y，Y1和Y2每一代表三官能分支分子，其中含有的官能團選自氨基、羥基、醛、異氰酸根、異硫氰酸根、硫醇、馬來酰亞胺、環氧及它們的衍生物或它們的組合，并且其中X1，X2和X3每一為任選的雙官能距離分子，其含有的兩個官能團選自氨基、羧基、羥基、醛、異氰酸根、異硫氰酸根、硫醇、馬來酰亞胺、環氧及它們的衍生物或它們的組合；和/或其中配體為環狀的。
4.根據前述權利要求中任一項所述的聚合物親和基質，其中配體包含1-100個官能團，優選1-32個官能團。
5.根據前述權利要求中任一項所述的聚合物親和基質，其中每一結合單元為氨基酸，其至少一部分在約血液的生理pH時帶正電荷。
6.根據權利要求5的聚合物親和基質，其中氨基酸的pKA≥6.0。
7.根據權利要求6的聚合物親和基質，其中氨基酸為精氨酸、賴氨酸、組氨酸或半胱氨酸，優選精氨酸。
8.根據權利要求7的聚合物親和基質，其中氨基酸的量或濃度為0.01-5mmol/g基質。
9.根據權利要求8的聚合物親和基質，其中氨基酸的量或濃度為約0.01、0.1、1、2、3、4或5mmol/g基質。
10.根據前述權利要求中任一項所述的聚合物親和基質，其中每一配體的氨基酸分子數目為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16，優選地為4-8。
11.根據前述權利要求中任一項所述的聚合物親和基質，其中氨基酸為精氨酸，并且精氨酸的量或濃度≤3mmol/g基質。
12.根據前述權利要求中任一項所述的聚合物親和基質，其中所述至少一種官能團為氨基或取代的氨基、羧基、羥基、硫醇基、胍基或它們的組合，優選地為氨基或胍基。
13.根據前述權利要求中任一項所述的聚合物親和基質，其中所述配體具有如下式所示的樹狀或梳狀結構具有通式I即-X1n-Ym[X2i-Z1；X3j-Z2]1/2(m+1)的配體的例子，其中其在此處為-Lysm[Arg](m+1)，即n＝i＝j＝0；m＝2k-1Z1＝Z2＝Arg；所有的Y＝Lys；且沒有X1、X2和X3 (k＝0) 具有通式II即-(X1n-Y1[Y2m[X2i-Z1；X3j-Z2]1/2(m+1)]r-X4p-Z3)的配體的例子，其中其在此處為-(Lys[Lysm[Arg](m+1)r-H，即n＝i＝j＝p＝0；m＝2k-1Z1＝Z2＝Arg；Z3＝H；所有的Y＝Lys；沒有X1、X2、X3和X4 (r＝2，k＝0) 和/或包括環狀結構，優選地如下式所示 (k＝1) (k＝2)
14.根據前述權利要求中任一項所述的聚合物親和基質，其中至少兩個官能團的正電荷以一定的距離相互分開，所述距離由所要結合的物質的結合基元中分別帶負電的基團之間的距離確定，所述帶負電的基團優選地為內毒素中的磷酸基團。
15.根據前述權利要求中任一項所述的聚合物親和基質，其中間隔臂實質上疏水或親水，并且具有用于配體的錨定部分的功能。
16.根據權利要求15的聚合物親和基質，其中間隔臂選自式H-(OCH2CH2)n-OH的聚乙二醇或寡乙二醇，其中n代表2到250，或聚乙烯醇、聚乙烯胺、聚縮水甘油、聚乙烯亞胺或聚環氧丙烷，或為它們的衍生物。
17.根據權利要求16的聚合物親和基質，其中間隔臂為線性和/或分支構型并且平均分子量為400-10000道爾頓的聚乙二醇(PEG)，或為其衍生物。
18.根據前述權利要求中任一項所述的聚合物親和基質，其中固體支持物由這樣的材料制造，所述材料選自聚苯乙烯、聚乙烯醇、聚羥基苯乙烯、從氯甲基化聚苯乙烯或聚丙烯酸酯產生的聚合物、用羥基官能化的聚甲基丙烯酸酯、羥基烷基-聚苯乙烯、羥基芳基-聚苯乙烯、羥基烷基-芳基-聚苯乙烯、多羥基烷基化聚苯乙烯、多羥基芳基化聚苯乙烯、異氰酸根合烷基-聚苯乙烯、異氰酸根合芳基-聚苯乙烯、羧基烷基-聚苯乙烯、羧基芳基-聚苯乙烯、氨基烷基-聚苯乙烯、氨基芳基-聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、交聯的聚乙烯醇、纖維素、硅土、糖類、乳膠、環烯共聚物、玻璃或它們的組合，優選交聯的聚苯乙烯。
19.根據權利要求18的聚合物親和基質，其中固體支持物具有珠子、凝膠、膜、顆粒、網、織造織物和非織造織物、纖維簇、管、薄膜、薄片或它們的組合、或交聯的互穿網絡的形式，優選地具有聚苯乙烯-PEG珠子的形式。
20.根據前述權利要求中任一項所述的聚合物基質，其中所述基質是生物相容的并且具有足以允許全血灌注的溶脹度。
21.根據權利要求20的聚合物親和基質，其中從干燥狀態到水合形式的溶脹度為約1.5-20倍，優選2-6倍。
22.根據前述權利要求中任一項所述的聚合物親和基質，其中所述基質提供了三維互補結構以結合至少一種這樣的物質，所述物質選自病毒和細菌來源的組分、內毒素、外毒素、細菌DNA或片段、寡核苷酸；細胞，尤其是內皮細胞、干細胞和腫瘤細胞；血細胞，尤其是淋巴細胞、血小板、粒細胞、樹突狀細胞和單核細胞；朊病毒、寄生蟲、真菌；超過劑量的藥物、致病的食品添加劑；糖尿病、肝病、尿毒癥或腎病或炎癥導致的急性或慢性代謝障礙的產物、肝素、細菌和病毒、載有病原的血細胞、或者至少其部分或降解產物、DNA、磷酸鹽、細胞因子、生長因素、激素、趨化因子、尿毒癥性毒素、血液凝固蛋白、促凝血蛋白、炎性蛋白或促炎性蛋白、巨噬細胞移動抑制因子、可溶的或細胞表面結合蛋白、可溶的粘附分子、以及葡萄糖或其降解產物、致熱原、細菌外毒素、革蘭氏陽性細菌產物，優選地脂胞壁酸，尤其是細菌性致熱原，優選內毒素，尤其是脂多糖(LPS)的脂質A組分。
23.根據前述權利要求中任一項所述的聚合物親和基質，其中所述基質具有約1×102到約1×106道爾頓的截留值并且結合疏水和/或親水物質。
24.根據前述權利要求中任一項所述的聚合物親和基質，其中一種或多種物質將要從中除去或減少的液體為水性或有機溶液、體液優選血液、治療性液體、用于生命科學應用的液體優選為生物學的、診斷的或生物技術應用中的緩沖液、輸注液或透析液、從健康供體得到的血液制品比如用于輸注的血漿、血小板濃縮物、紅血球濃縮物、血液替代物優選地載氧體、經修飾的血紅蛋白溶液和人造血紅蛋白溶液、用于營養的液體和工業用途的液體。
25.根據前述權利要求中任一項所述的聚合物親和基質，其中固體支持物為交聯的聚苯乙烯，間隔臂為聚乙二醇并且每一結合單元為精氨酸。
26.用于結合液體中一種或多種物質以從該液體除去所述物質和/或減少所述液體中所述物質的量或濃度意在防止、除去或減少所述液體中組分或過程所不希望有的活化的方法，該方法包括將液體與如權利要求1-24任一項所定義的聚合物親和基質接觸，接觸時間為足以減少所述物質的量或濃度和/或除去所述物質的時間期間，優選不超過24小時。
27.根據權利要求26的方法，其中時間期間為1秒到2小時。
28.根據權利要求26或27的方法，其中物質為內毒素并且液體為血液，其中內毒素被除去或減少后的量或濃度低于活化血液中組分的能力或者防止血液中組分或過程的活化。
29.產生如在權利要求1-25任一項所定義的聚合物親和基質的方法，其包括a)將間隔臂連接至固體支持物以得到第一復合體和b)將配體連接至所述第一復合體，其中所述配體含有至少一個具有至少一個官能團的結合單元，或c)將間隔臂連接至含有至少一個具有至少一個官能團的結合單元的配體，以得到第二復合體，和d)將固體支持物連接至所述第二復合體，或e)將間隔臂連接至固體支持物以得到第一復合體，和f)在結合至固體支持物的間隔臂上固相合成配體，或g)在固體支持物上通過接枝直接由單體合成間隔臂，和h)將含有至少一個具有至少一個官能團的結合單元的配體連接至所述第一復合體，或i)在固體支持物上通過接枝直接從單體合成間隔臂，和k)在結合至固體支持物的間隔臂上固相合成配體，其中關于所要結合的物質中結合基元的三維結構、電荷和疏水/親水區的存在的信息收集自X射線晶體學、蛋白質測序、蛋白質建模或疏水性和親水性計算，并且使得含有結合單元的配體在電荷和/或親水性/疏水性方面與所述物質的結合基元互補。
30.根據權利要求29的方法，其包括以下步驟對于a)和b)活化固體支持物，將間隔臂分子偶聯至固體支持物，合成含有結合單元的配體，和將配體定點偶聯至間隔臂分子，或對于c)和d)合成含有結合單元的配體，將間隔臂分子偶聯至配體，活化固體支持物，和將間隔臂配體復合體定點偶聯至固體支持物，或，對于e和f)活化固體支持物，將間隔臂分子偶聯至活化的固體支持物，和在該支持體的間隔臂上固相合成配體。
31.根據權利要求29的方法，其包括以下步驟對于a)和b)，活化間隔臂，將活化的間隔臂偶聯至固體支持物，和將配體偶聯至所述活化的間隔臂，或，對于c)和d)，合成配體，活化間隔臂，將配體定點偶聯至活化的間隔臂分子，和將間隔臂-配體復合體偶聯至固體支持物，或者，對于e)和f)，活化間隔臂，將活化的間隔臂偶聯至固體支持物，和在結合至固體支持物的間隔臂上固相合成配體。
32.如權利要求1-25任一項所定義的聚合物親和基質的用途，用于從液體，優選地從體液或治療性液體，最優選地從血液或血清中，除去一種或多種物質，優選地除去內毒素，或者減少所述液體中該物質的量或濃度。
33.根據權利要求32的用途，用于產生較輕活化的血液或防止血液中組分或過程所不希望有的活化。
34.根據權利要求33的用途，用作體外血液純化過程的一部分或作為體內植入物以接觸血液或任意體液，優選地為在血管系統、血管或腹膜腔中的血液或任意體液。
35.根據權利要求34的用途，用于產生較輕活化的血液或防止血液中組分或過程所不希望有的活化。
36.用于從液體除去一種或多種物質和/或減少所述液體中所述物質的量或濃度意在防止、除去或減少所述液體中組分或過程所不希望有的活化的試劑盒，所述試劑盒包含如權利要求1-25任一項所定義的聚合物親和基質。
37.根據權利要求36的試劑盒，其中還包含樣品管和對所述液體，優選地對血液或血清進行體外和/或體內處理的設備。
38.聚合物基質的用途，用于產生從液體除去一種或多種物質和/或減少所述液體中所述物質的量或濃度的聚合物親和基質，其中特異親和性取決于應用于聚合物基質的配體，其中聚合物基質包括固體支持物和間隔臂，其中固體支持物由這樣的材料制造，所述材料選自聚苯乙烯、聚乙烯醇、聚羥基苯乙烯、從氯甲基化聚苯乙烯或聚丙烯酸酯產生的聚合物、用羥基官能化的聚甲基丙烯酸酯、羥基烷基-聚苯乙烯、羥基芳基-聚苯乙烯、羥基烷基-芳基-聚苯乙烯、多羥基烷基化聚苯乙烯、多羥基芳基化聚苯乙烯、異氰酸根合烷基-聚苯乙烯、異氰酸根合芳基-聚苯乙烯、羧基烷基-聚苯乙烯、羧基芳基-聚苯乙烯、氨基烷基-聚苯乙烯、氨基芳基-聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、交聯的聚乙烯醇、纖維素、硅土、糖類、乳膠、環烯共聚物、玻璃或它們的組合，優選交聯的聚苯乙烯，并且其中間隔臂選自式H-(OCH2CH2)n-OH的聚乙二醇或寡乙二醇，其中n代表2到250。
39.根據權利要求38的用途，其中固體支持物具有珠子、凝膠、膜、顆粒、網、織造織物和非織造織物、纖維簇、管、薄膜、薄片或它們的組合、或交聯的互穿網絡的形式。
40.根據權利要求38或39的用途，其中間隔臂為線性和/或分支構型并且平均分子量為400-10000道爾頓的聚乙二醇(PEG)，或為其衍生物。
41.根據權利要求38-40任一項的用途，其中聚合物基質具有足以允許血漿或全血灌注的溶脹度。
42.根據權利要求41的用途，其中從干燥狀態到水合形式的溶脹度為約1.5-20倍，優選2-6倍。
43.根據權利要求38-42任一項的用途，其中聚合物基質具有凝膠型珠子的形式。
44.根據權利要求38-43任一項的用途，其中所述液體為水性或有機溶液、體液優選血液、治療性液體、用于生命科學應用的液體優選為生物學的、診斷的或生物技術應用中的緩沖液、輸注液或透析液、從健康供體得到的血液制品比如用于輸注的血漿、血小板濃縮物、紅血球濃縮物、血液替代物優選地載氧體、經修飾的血紅蛋白溶液和人造血紅蛋白溶液、用于營養的液體和工業用途。
45.根據權利要求38-44任一項的用途，其中所述聚合物基質具有約1×102到約1×106道爾頓的截留值并且結合疏水和/或親水物質。
46.根據權利要求38-45任一項的用途，其中固體支持物為交聯的聚苯乙烯，并且間隔臂為聚乙二醇。
全文摘要
本發明描述了用于結合液體中一種或多種物質以從該液體除去所述物質和/或減少所述液體中所述物質的量或濃度意在防止、除去或減少所述液體中組分或過程所不希望有的活化的聚合物親和基質，以及從該液體除去所述物質和/或減少其在所述液體中的量或濃度的方法，產生所述基質的方法，所述基質的用途和含有所述基質的試劑盒。該聚合物親和基質含有固體支持物、間隔臂和配體，其中所述配體包含作為結合單元的精氨酸。
文檔編號B01J20/26GK1665494SQ03816142
公開日2005年9月7日 申請日期2003年7月4日 優先權日2002年7月8日
發明者沃夫岡·拉普, R·德皮施, H·戈爾, B·維特納, W·貝克 申請人:甘布羅倫迪亞股份有限公司, 沃夫岡·拉普