專利名稱：對微量蛋白或多肽溶液同步富集、脫鹽并進行鑒定的方法
技術領域：
本發明屬于生化分析鑒定技術領域，具體涉及一種對微量蛋白或多肽溶液同步富集、脫鹽并直接進行鑒定的方法。
背景技術：
基質輔助激光解吸離子化/質譜(MALDI/MS)以其分析速度快、靈敏度高、易于操作等特點成為蛋白質組學研究中的有效工具。但是存在于分析樣品中的大量鹽或其它非蛋白質成分(樣品前期處理過程中加入)會使得質譜靈敏度大大降低，被稱為質譜研究中的壓制效應(suppression effect)。避免壓制效應的有效方法就是對樣品進行脫鹽處理。另外在蛋白質組學研究過程中，有大量承擔生物體重要生命活動的蛋白是低豐度蛋白，其極低的含量給后續的分析和檢測帶來困難。因此，實現低豐度蛋白的有效富集是實現其準確分析和鑒定的首要條件之一。目前最常用的溶劑蒸發法在樣品濃縮的同時也會使其中鹽等雜質得到富集，而傳統的脫鹽方法是采用Millipore公司推出的用于微量樣品制備帶有C18填料的ZipTipTM吸嘴脫鹽或采用去離子水對樣品進行靶上洗脫去鹽，但是這兩種方法脫鹽能力有限。
發明內容
本發明的目的是提供一種操作簡單、價格便宜、效果良好，能對微量多肽或蛋白同步富集、脫鹽，并進行鑒定的新方法。
本發明提出的對微量蛋白或多肽同步富集、脫鹽，并進行鑒定的方法，具體步驟如下(1)以氧化硅納米粒子作為納米吸附劑，加入多肽或蛋白質樣品的水溶液或鹽溶液中，通過靜電吸附、親/疏水作用富集樣品，樣品濃度為10-11M-10-6M之間，富集時間5-180分鐘之間，富集溫度4-90℃，氧化硅納米粒子用量為0.02-2000微克之間；(2)對經步驟(1)的溶液進行離心處理，棄除上清液，收集下層氧化硅沉淀，再用50％的乙腈稀釋；當溶液中含有高濃度的鹽時，富集和脫鹽可一步完成。
(3)上述被富集的樣品無需洗脫，直接與有機基質均勻混合，形成均勻細致的結晶，進行MALDI/MS分析；(4)根據質譜結果，鑒定多肽或蛋白質。
本發明中，氧化硅納米粒子3-200nm，范圍較為合適。該范圍的氧化硅納米粒子具有大的比表面積，豐富可調的表面性質。
本發明中，多肽或蛋白質樣品的鹽溶液可以是無機鹽(例如氯化鈉，氯化鈣，碳酸氫銨等)或者有機鹽(例如尿素)溶液。
本發明中，所用有機基質可以是2-氰基-4-羥基肉桂。
本發明利用氧化硅納米粒子對蛋白質和多肽良好的吸附作用，高效的脫鹽能力以及它與MALDI過程的高度相容性，建立了納米氧化硅富集同時脫鹽-MALDI/MS直接分析的方法分析痕量蛋白質和多肽。
本發明的氧化硅納米粒子對多肽或蛋白有富集和脫鹽作用，與傳統的溶劑蒸發濃縮方法相比，氧化硅納米粒子在富集樣品同時可以高效脫鹽，其脫鹽能力遠遠高于商品化ZipTipTM吸嘴。
本發明的氧化硅納米粒子可以與基質均勻混合形成均勻細致的結晶，納米粒子與基質的混晶體的形成有利于基質將吸收的激光能量轉移給氧化硅納米粒子吸附的樣品，實現樣品的基質輔助激光解析離子化過程；同時均勻細致的結晶體保證了分析的重現性和結果的可靠性。
本發明樣品富集后可直接進行MALDI質譜鑒定，無需樣品洗脫步驟，操作簡單，避免了洗脫過程帶來的樣品損失。本方法成本低廉，濃縮效率高，除鹽能力強，可以實現10-10M蛋白質酶解產物的成功鑒定。
圖1氧化硅納米粒子的掃描電鏡照片。由圖可看出納米氧化硅粒子尺寸分布均勻，其粒徑均小于100nm。
圖2為10-7M泛素樣品的MALDI/MS譜圖。
圖3為氧化硅納米粒子富集泛素樣品的MALDI/MS譜圖。樣品濃度，10-8M，實驗方法依照實例1-3。對比圖2和圖3可以看出，氧化硅納米粒子對泛素樣品有很強的富集能力。
圖4為含4M氯化鈉的細胞色素C樣品的MALDI/MS譜圖。細胞色素C濃度，10-7M。
圖5為氧化硅納米粒子富集細胞色素C同步除氯化鈉后的MALDI/MS譜圖。細胞色素C濃度，10-7M。氯化鈉濃度，4M。對比圖4和圖5可以看出，氧化硅納米粒子在富集細胞色素C的同時可以克服高濃度無機鹽對質譜信號的干擾。
圖6為含8M尿素的細胞色素C樣品的MALDI/MS譜圖。細胞色素C濃度，10-7M。
圖7為氧化硅納米粒子富集細胞色素C同步除尿素后的MALDI/MS譜圖。細胞色素C濃度，10-7M。尿素濃度8M。對比圖6和圖7可以看出，氧化硅納米粒子在富集細胞色素C的同時可以克服高濃度有機鹽對質譜信號的干擾。
圖8為含有1M氯化鈉的細胞色素C溶液使用靶上脫鹽后的MALDI/MS譜圖。細胞色素C濃度，10-7M。實驗方法依照實例6。對比圖5和圖8可以看出，當溶液中鹽濃度很高時，靶上脫鹽方法效果很差。
圖9為含有1M氯化鈉的細胞色素C溶液使用ZipTipTM吸嘴脫鹽后的MALDI TOF/MS譜圖。細胞色素C濃度，10-7M。實驗方法依照實例7。
圖10為含有400mM尿素的細胞色素C溶液使用ZipTipTM吸嘴脫鹽后的MALDITOF/MS譜圖。細胞色素C濃度，10-7M。對比圖5和圖9，圖7和圖10可以看出，本發明脫鹽方法遠遠優于傳統ZipTipTM吸嘴脫鹽。
圖11為含有100mM碳酸氫銨的10-10M馬心肌紅蛋白酶解樣品經氧化硅納米粒子同步富集并脫鹽后的的MALDI/MS譜圖。氧化硅納米粒子富集，實驗方法依照實例8，質譜數據的數據庫檢索結果列于表1。良好的數據結果表明該方法對于復雜的蛋白酶解樣品同樣適用。
具體實施例方式
下面的實例是對本發明所提供氧化硅納米粒子材料進行樣品富集同時脫鹽和MALDI/TOF MS直接分析過程的進一步說明。
實例1-3氧化硅納米粒子對蛋白溶液的富集和MALDI TOF/MS測定取1ml一定濃度的蛋白樣品溶液分別加入2μL的10mg/mL氧化硅納米懸浮液，在37℃下振蕩30min；17000g下離心20min，棄除上清，在氧化硅沉淀中加入5μL50％乙腈，振蕩使之懸浮。
取前述懸浮液0.5μL滴到MALDI耙板上，再加入等體積5mg/mLα-CHCA的飽和溶液(0.1％TFA，50％乙腈水溶液)，待結晶干燥后，進行質譜分析。所用質譜MALDITOF/TOF(4700Proteomics Analyzer，Applied Biosystems)；激光器為Nd-YAG激光，波長355nm，激光脈沖頻率200Hz；加速電壓20kV，正離子模式線性TOF檢測。
實例4-5氧化硅納米粒子對高鹽蛋白樣品的抗鹽富集以及MALDI TOF/MS測定取1ml一定濃度的含有8M氯化鈉或4M尿素的蛋白樣品溶液，按照實例1-3的方法加入氧化硅納米懸浮液，離心后點樣，正離子模式線性TOF檢測。
實例6傳統的板上脫鹽先將樣品和基質混合點在不銹鋼點樣板上，置于空氣中自然風干。用移液器取1.5μL含0.1％TFA的去離子水點在樣品點上，3-5秒后，將樣品點的溶液吸掉，如此反復三次。
實例7ZipTipTMC18柱脫鹽美國Millipore公司的10μL ZipTipTMC18柱脫鹽，按照說明書要求1)用50％乙腈溶液潤濕吸嘴三次；2)用0.1％TFA水溶液的平衡三次；3)將吸嘴伸入在樣品液中吸進壓出，5-10個循環；4)用0.1％TFA水溶液洗滌吸嘴三次；5)取一小Ep管吸入5μL基質液(用含0.1％TFA的50％ACN的溶液配制)，將帶有樣品的吸嘴在其中反復洗脫。
實例8氧化硅納米粒子對蛋白質酶解物的抗鹽富集及直接鑒定取5mg/ml馬心肌紅蛋白的NH4HCO3溶液(100mM)，沸水中加熱3分鐘，以促使蛋白質變性，室溫冷卻。以底物/酶質量比50∶1的比例加入胰蛋白酶的溶液，37℃下恒溫反應12小時以上。用100mM碳酸氫銨溶液將產物稀釋至10-10M，取0.8mL樣品加入2μL的10mg/mL的納米氧化硅懸濁液，依照實例1的方法進行樣品富集，正離子模式反射式TOF檢測的方法進行質譜分析。質譜結果通過Mascot進行數據庫檢索。
下表是實例8的馬心肌紅蛋白樣品數據庫檢索結果。“+”代表檢索到氨基酸肽段
權利要求
1.一種微量蛋白或多肽同步富集、脫鹽并進行鑒定的方法，其特征是具體步驟如下(1)以氧化硅納米粒子作為納米吸附劑，加入多肽或蛋白質樣品的水溶液或鹽溶液中，通過靜電吸附、親/疏水作用富集樣品，樣品濃度為10-11M-10-6M之間，富集時間5-180分鐘之間，富集溫度4-90℃，氧化硅納米粒子用量為0.02-2000微克之間；(2)對經步驟(1)的溶液進行離心處理，棄除上清液，收集下層氧化硅沉淀，再用50％的乙腈稀釋；(3)上述被富集的樣品，直接與有機基質均勻混合，形成均勻細致的結晶，進行MALDI/MS分析；(4)根據質譜結果，鑒定多肽或蛋白質。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征是所述氧化硅納米粒子粒徑是3-200nm。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征是多肽或蛋白質樣品的鹽溶液是無機鹽或者有機鹽。
全文摘要
本發明屬生化分析鑒定技術領域，具體為一種對微量蛋白或多肽溶液同步富集、脫鹽并直接進行鑒定的方法。該方法以氧化硅納米粒子作為吸附劑，對蛋白質以及蛋白質酶解多肽進行高效吸附，并能克服高濃度鹽的干擾。由于氧化硅納米粒子與MALDI－MS有很好的相容性，被吸附的樣品無需洗脫步驟可直接進行MALDI－TOF/MS分析，操作簡單，避免了洗脫過程帶來的樣品損失。本發明可克服4M氯化鈉或8M尿素對質譜的干擾，對蛋白的富集效率可達100倍。
文檔編號B01J20/281GK1821777SQ20061002527
公開日2006年8月23日 申請日期2006年3月30日 優先權日2006年3月30日
發明者于錫娟, 張亞紅, 王曉燕, 唐頤, 楊芃原 申請人:復旦大學