一種熒光原位雜交細胞計數的絕對定量方法

專利名稱：一種熒光原位雜交細胞計數的絕對定量方法
技術領域：
本發明屬于熒光原位雜交檢測技術領域，涉及熒光原位雜交技術在絕對定量上的改進，具體的說是一種對于懸浮液和生物膜泥樣都適用的絕對定量方法。
背景技術：
熒光定位雜交技術(FISH)是將DNA(或RNA)探針用特殊的熒光染料標記，然后將探針直接雜交到生物樣品的染色體或RNA上，以對某種基因或RNA進行定性、定量、定位等檢測。FISH技術具有特異性強，靈敏度高，分析時間短等特點，因此在污水處理領域也被廣泛應用。
熒光原位雜交法在定量中的研究主要集中在兩個方面，一是相對定量，主要采用混合探針，不同波長熒光同一視野下觀察相應的目標細菌數，后期再利用圖像分析軟件將不同細菌的照片合成一張圖片，用目標細菌和總菌的比例來定量目標細菌的數量。二是絕對定量，其應用對象主要為液體的泥樣，取一定量體積的樣品，雜交后的結果在計數軟件的幫助下，進行絕對定量。而這兩種方法都存在著相應的問題。FISH技術中廣泛應用的相對定量法，雖然可以分析反應器內部的生物群落的演替情況，但是卻存在著難以認定微生物變化量是否可以對系統處理效果產生影響的問題。特別是在不同環境下的樣品，作為參考點的總菌存在數量上的差異甚至相差懸殊，導致建立目標細菌數量與反應器運行效果的關系在邏輯上不成立。在常用的絕對定量方法中，定量測量的主要目標是懸浮液，因為生物膜作為一種半固體物質，難以采用適用于懸浮液的定額體積的方法來進行定量測量。對于兼有生物膜和懸浮液的處理工藝來說，無法在一個量化標準下對二者之間微生物群落結構的聯系和區別進行分析。

發明內容
基于這點，發明人開發了一種熒光原位雜交絕對定量方法，本發明所要解決的技術問題是不同形態下的泥樣的絕對定量問題，在同一量化標準下分析生物膜和懸浮液中目標細菌的數量變化，在大量實驗數據的支持下，建立一種標準化定量方法。本發明的技術方案是在常規熒光雜交方法的實施過程中，增加可進行重量定量的步驟，實現了同一反應器中不同形態的樣品在微生物群落數量上的比較，同時提出了一種可建立標準方法的絕對定量手段。本發明提到的絕對定量方法，是在熒光原位雜交過程中，在取樣，樣品預處理，實驗處理以及后期結果分析等各個階段增加或者改進原有實驗方案，建立起了整套方法。其特征在于，定量生物膜等固體樣品時，可取定量高速離心后的樣品，同時對同一樣品高溫烘干，最后得到一定重量干污泥的微生物濃度。本發明提出的對樣品中的細胞計數絕對定量方法，包括以下步驟如附圖I所示。I)用于FISH實驗的泥樣12000rmp高速離心3分鐘后取30mg，并取同一樣品在烘箱中120°C烘干2h。2)制備4%多聚甲醛-PBS溶液清洗30mg泥樣，采用I : I的PBS和無水乙醇混合液1500 μ L對微生物細胞進行固定和保存。超聲處理樣品，3 μ L樣品涂于載玻片上，370C干燥2h以將樣品固定在玻片上，最后在46°C對樣品進行熒光原位雜交2h。3)每一種試樣的載玻片進行10個(數值越大，結果越準確)視野的觀察，攝取10個畫面如附圖2所示，運用計數軟件對每一個視野進行熒光光點的計數，得到每個視野下的細菌數，對所得結果進行平均計算處理，以此可以推算得出試樣中一個視野下的平均細菌數。具體方法為(al+a2+......+al0)/10=A (I)因此干污泥樣品中的細菌濃度的計算公式如下；C = 1000 X Ax ―― X — M {cell / mg)(2 )
S , Vj
ΛΛA :視野下的平均細菌數；N-M品雜交液體積mL ；Va:每個雜交孔所滴雜交液體積mL ；S :玻片雜交孔面積mm2 ；SA :顯微鏡視野面積mm2 ；M 30mg泥樣120°C烘干2h后的重量mg。本發明在實驗過程中需注意的有，生物膜取樣過程中，須在膜厚度為1-3_左右處取樣；取30mg泥樣，如果泥樣過多則導致不能將泥樣超聲均勻，泥樣過少則會使結果誤差較大，取樣時可先多取出一部分用藥匙混合均勻，取樣后的部分稱重后烘干再記錄其重量，以此保證用烘干污泥的重量推算樣品泥樣的干污泥重量的正確性；對樣品進行超聲處理后，需得到視覺上無明顯顆粒的懸浮液，保證樣品中微生物細胞分散良好，但為防止樣品中細胞破裂，超聲時間不宜過長，宜取3min左右，頻率為20KHZ，強度40% ;由于絕對定量實驗在熒光下觀察的時間較長，因此需在雜交后的樣品中滴加抗熒光衰減劑，保證雜交信號的穩定性；在運用顯微鏡對雜交玻片進行觀察時，視野數需值越高，所得結果越準確，一般不小于10組，同時視野位置的選取要考慮到雜交孔的性狀，以保證所取視野涵蓋整個雜交孔。本發明的技術路線(I)為了分析不同形態下泥樣內部微生物數量的組成情況，將絕對定量的基礎放在質量定量上，創造了分析同一反應器中生物膜和懸浮液微生物數量上區別與聯系的技術
T D O(2)取樣時對所取樣品12000rmp高速離心3分鐘，主要兼顧到泥樣的保存方法為12000rmp高速離心3分鐘_20°C下保存，因此所取新泥可以與之前保存的泥樣一同進行分析。(3)取同一樣品在烘箱中120°C烘干2h，最終得到的是干污泥中的微生物細胞數量，相對的減少了外界環境對結果的影響，其與測量MLSS的方法相同，因此雜交計數后的結果可以與懸浮液中MLSS相聯系得出懸浮污泥中每毫升的細菌數濃度。(4)利用現有的FISH雜交技術完成所取樣品的雜交過程，雜交樣品滴加抗熒光衰減劑，滴加量以覆蓋雜交孔二分之一為準，過多可能造成蓋玻片的移動。(5)利用顯微鏡在熒光下對雜交樣品進行觀察并攝取圖像，視野數量保證涵蓋整個雜交孔，保證所取視野的全面性，取像方法如附圖2所示，每個雜交孔豎向分為五個等高的部分，根據實驗所取視野數，再對每部分的視野取數按照上下左右對稱的原則進行分配，本研究將這種方法命名為五線法。(6)利用FISH計數軟件對拍攝的照片進行計數，計算出各個雜交孔視野下的平均細菌數，按照視野面積與雜交孔面積的比例可計算雜交孔內的細菌數，由于滴加到雜交孔的雜交液體積為3 μ L，因此可推算出30mg離心后的泥樣配成I. 5mL雜交液后所含的細菌數，結合30mg離心泥樣烘干后的質量，最終可推算出干污泥的細菌濃度。本發明的有益效果本發明通過對原來熒光原位雜交技術手段的改進，既增加重量定量的步驟，實現了不同狀態下泥樣的絕對定量，建立了一套可實現標準化定量的方法。這種絕對定量方法，對不同工藝下的泥樣都具有很強的適用性。計算方法簡單準確，擴展了 FISH技術的應用深度，為運用FISH手段進行定量提供了技術上的支持。本發明可廣泛應用于工業微生物檢測、污水處理、衛生檢疫、食品和土壤等方面。


圖I為熒光原位雜交實驗絕對定量步驟圖。圖2為雜交孔視野選取方法。圖3a.生物膜與懸浮液中總菌FISH圖像。圖3b碳氮比分別為4，8，12，15時AOB菌FISH圖像。圖3c碳氮比分別為4，8，12，15時NOB菌FISH圖像。
具體實施例方式取樣及預處理用于FISH實驗的泥樣12000rmp高速離心3分鐘后取30mg，并取同一樣品在烘箱中120°C烘干2h。FISH法實驗過程I 4%多聚甲醛-PBS溶液的制備取約5ml超純水于燒杯，用微波爐強檔加熱20s，至手觸感熱而不燙，將事先稱好的O. 4g多聚甲醒(Paraformaldehyde, PFA)倒入燒杯中，加入幾滴ZmolI^1NaOH,直到PFA完全溶解之后，再加入3333 μ L3 X PBS，將燒杯置入冰浴中冷卻，用ZmolL-1HCl調pH至7. 2左右。將溶液倒入事先冰過的IOmL容量瓶中，加冰超純水定容，用O. 22 μ m的膜過濾，轉移到事先冰過的試劑瓶。冰箱4 V保存，24h內使用。II細胞固定和保存取30mg離心后的污泥，溶于IOOOmL超純水中，離心15000rppmX5min。棄去700 μ L上清液，殘300 μ L，振蕩重懸污泥。加4%PFA in PBS900 μ L,,既I體積污泥+3體積的 4%PFA in PBS。冰箱 4°C 4h。離心 IOOOOrpmX 5min,去上清,加 ImL 濾過(O. 22 μ m 膜)的1XPBS，重懸，可重復I一2次。離心IOOOOrpmX 5min，去上清，加濾過(0. 22 μ m膜)的IXPBS和無水乙醇各750 μ L (量可調整),重懸。_20°C保存,六個月之內使用。III樣品在玻片上的固定
對樣品進行超聲處理，將活性污泥絮體打散成單個細胞以便于顯微鏡計數，取3μ L樣品涂于帶有12個直徑為9mm凹槽(well)的載玻片上，在37°C干燥2h以上或者過夜。IV全細胞雜交玻片依次用50%、80%、98%乙醇各浸潰3min對細胞進行脫水，立放風干。將約2mLHB(雜交液)涂布于濾紙上，折卷起濾紙并放入圓柱形的雜交管中，讓濾紙貼在管壁上。按I :8的比例將I體積25ng/ μ L的探針儲備液溶于8體積的HB中，離心IOs混勻。將玻片放入裝有濾紙的雜交管并與配好的雜交液一起放入46°C分子雜交儀中預熱IOmin,注意無光預熱。預熱后，分別在含有樣品的凹槽中滴加9μ LI雜交液，再將玻片放于雜交管中，注意不要將玻片傾斜，以免雜交液流出凹槽。迅速把雜交管轉移到雜交儀中，46°C雜交90min。將雜交液和洗脫液放入48 °C下水浴，并將超純水在4°C冰浴待用。雜交后，迅速從雜交管中去除玻片，并用雜交液沖洗，再立刻浸入洗脫液中48°C水浴20min。取出玻片，用預先冰浴后的4°C超純水沖洗玻片，迅速甩干。在玻片上滴防褪色封片劑，蓋上蓋玻片，用指甲油將玻 片四周密封，避光常溫保存。結果分析與定量每一種試樣的載玻片進行10個(數值越大，結果越準確)視野的觀察，攝取10個畫面，運用計數軟件對每一個視野進行熒光光點的計數，得到每個視野下的細菌數，對所得結果進行平均計算處理，以此可以推算得出試樣中的細菌濃度。具體方法為(al+a2+......+al0)/10=A (I)因此干污泥樣品中的細菌濃度的計算公式如下；
C VC = 1000 X A X —■ X ——M(cel!/mg)(2)
Sa VaA :視野下的平均細菌數；V :樣品雜交液體積mL ；Va:每個雜交孔所滴雜交液體積mL ；S :玻片雜交孔面積mm2 ；SA :顯微鏡視野面積mm2 ；M 30mg泥樣120°C烘干2h后的重量mg。實例為了考察碳氮比對同步硝化反硝化的影響，實驗設置了四組附積床生物膜反應器，填料采用BX填料，DO為l_3mg/L，碳氮比分別為4、8、12、15。其他條件相同。I、當四組反應器達到穩定時，每個反應器分別在生物膜和懸浮液中取泥樣，12000rmp離心3分鐘后取30mg，并取同一樣品120°C烘干2h稱重。2、選取真細菌基因探針 EUB338(5' -GCTGCCTCCCGAGGAT-3' )(5'端 Cy3 修飾)，氨氧化菌基因探針NS0190 (5' -CGATCCCTGCTTTTCTCC-3' .) (5'端FITC標記)，亞硝酸氧化菌基因探針NIT3 (5' -CCTGTGCTCCATGCTCCG-3' .) (5.端HEX標記)分別作為總菌、氨氧化菌和亞硝酸鹽氧化菌的熒光原位雜交分析探針，經細胞固定，細胞在玻片上固定以及全細胞熒光原位雜交等步驟，完成整個FISH實驗。3、利用顯微鏡(Olympus)在三種探針對應的濾光片下對雜交結果進行觀察記錄，每一雜交孔內攝取10個畫面，如附圖3所示。4、利用計數軟件對所取的10畫面進行計數。5、根據計數結果得到視野下細菌數平均值，利用上述絕對定量公式計算泥樣中干污泥細菌濃度，得到如下表數據，所得數據結果與其他研究人員通過傳統的培養皿培養的方法所得細胞數目的數量級相同，因此所得絕對值可信度較大。表I反應器內部微生物組成情況統計表
權利要求
1.一種熒光原位雜交細胞計數的絕對定量方法，其特征在于包括以下步驟 1)用于FISH實驗的泥樣12000rmp高速離心3分鐘后取30mg，并取同一樣品在烘箱中120°C烘干 2h ； 2)經細胞固定，超聲，細胞在玻片上固定，全細胞熒光原位雜交以及抗熒光衰減措施，完成整個FISH實驗； 3)運用計數軟件，并利用以下公式推算試樣中的細菌濃度； V YC = IOOOxd X X — -i- M {cell I mg) A :視野下的平均細菌數； V :樣品雜交液體積mL ； Va:每個雜交孔所滴雜交液體積mL ； S :玻片雜交孔面積mm2 ； SA:顯微鏡視野面積mm2; M 30mg泥樣120°C烘干2h后的重量mg。
2.如權利要求I所述的熒光原位雜交細胞計數的絕對定量方法，其特征在于 取樣位置在生物膜厚度為l_3mm處取樣； 對樣品進行超聲時間為3min，頻率為20KHZ，強度40% ； 在運用顯微鏡對雜交玻片進行觀察時，視野數值不小于10組，同時視野位置的選取要保證所取視野涵蓋整個雜交孔。
全文摘要
一種熒光原位雜交細胞計數的絕對定量方法屬于熒光原位雜交檢測技術領域，本發明中提到的絕對定量方法，是在熒光原位雜交過程中增加可進行重量定量的步驟，在取樣，樣品預處理，實驗處理以及后期結果分析等各個階段對原有實驗方案進行改進，建立起了整套方法。其特征在于，定量生物膜等固體樣品時，可取定量高速離心后的樣品，同時對同一樣品高溫烘干，經過熒光原位雜交后在顯微鏡下觀察計算，最后得到一定重量干污泥的微生物濃度。實現了同一反應器中不同形態的樣品在微生物群落數量上的比較，同時提出了一種可建立標準方法的絕對定量手段。
文檔編號G01N21/64GK102839208SQ20121025888
公開日2012年12月26日 申請日期2012年7月24日 優先權日2012年7月24日
發明者張巖, 楊正陽, 王麗麗, 劉煥光, 朱敏 申請人:北京工業大學