一種由銀杏葉提取物形成的中藥組合物及其在制備舒血寧注射液中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種中藥組合物，具體涉及一種由銀杏葉提取物形成的中藥組合物， 及該組合物在制備舒血寧注射液中的應用。
【背景技術】
[0002] 銀杏葉為銀杏科植物銀杏的干燥葉，銀杏葉提取物是經現代提取工藝從銀杏葉中 提取的活性物質的富集產品，可用于阿爾茨海默病、抑郁癥、糖尿病、神經疾病、陽痿、記憶 障礙、外周血管疾病、間歇性跛行、腦轉耳鳴等疾病的治療。其主要活性成分為黃酮類和萜 類。黃酮類成分包括單黃酮、黃酮醇苷、乙酰化黃酮醇苷、雙黃酮、黃烷-3-醇類以及原花色 素等。萜類銀杏內酯有銀杏內酯A、B、C、J、M及白果內酯。
[0003] 目前國家食品藥品監督管理總局(CFDA)批準了數十種銀杏葉提取物劑型，包括銀 杏葉片、膠囊、顆粒、軟膠囊、分散片、丸、酊、滴劑、口服液、銀杏葉提取物注射液等，其成藥 形式均是將銀杏葉提取物與其它輔料混合形成，例如，舒血寧注射液就是將銀杏葉提取物 與葡萄糖、乙醇等輸料混合形成的一種銀杏葉提取物注射液。眾所周知，銀杏葉提取物是一 個非常復雜的化合物富集產品，除上述主要的活性成分，其含有從無機物到有機物、從極性 到非極性、從小分子到生物大分子的各種成分，據不完全統計銀杏葉中含有240多個化學成 分。受技術發展的制約，目前銀杏葉提取物中各化學成分并沒有完全被確認，且有效成份、 作用機制、藥代動力學及不良反應也并沒有完全探究清楚。而具有本領域公知常識的技術 人員均知悉，上述提到的作用機制、藥代動力學及不良反應均與成藥中的化學成分有著必 然的聯系。因此，進一步明確銀杏葉提取物中的有效成分，并進一步精確有效成分的含量， 提高銀杏葉提取物的藥效，減少不良反應，對于提高患者健康及其用藥安全具有重要的意 義。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于提供一種有效成分及含量更加明確的銀杏葉提取物，并進一步 的提供該提取物的制備方法。
[0005] 為此，本申請采取的技術方案為，
[0006] -種由銀杏葉提取物形成的中藥組合物，以占所述中藥組合物的質量百分比計， 包括，24-40 %的銀杏總黃酮，6-16 %的銀杏內酯，銀杏酸小于5ppm。
[0007] 上述由銀杏葉提取物形成的中藥組合物中包括，1-1.68%的槲皮素-3-0-葡萄糖 苷，2.11-3.53%的槲皮素-3-0-2"，6" -二鼠李糖基葡萄糖苷。
[0008] 上述由銀杏葉提取物形成的中藥組合物中包括，1.4-3 %的銀杏內酯A，0.9-1.8 % 的銀杏內酯B和1.2-1.3%的銀杏內酯C。
[0009] 上述由銀杏葉提取物形成的中藥組合物中，還包括白果內酯和蘆丁。
[0010] 上述任一由銀杏葉提取物形成的中藥組合物的制備方法，包括，
[0011] SI所述槲皮素-3-0-葡萄糖苷的制備方法，
[0012] (1)將銀杏葉提取物溶于體積濃度為40-80%的乙醇-水溶液中，制備得到銀杏葉 提取物的濃度為10-1 〇〇〇mg/mL的提取物溶液；
[0013] (2)對所述步驟（1)得到的提取物溶液進行一維液相色譜分離，得到一維粗產品， 本步驟中一維液相色譜分離的條件為，色譜柱采用以硅膠為基質的親水型色譜填料;流動 相中的有機相為乙醇或甲醇，水相為水;洗脫條件以〇_15min有機相95%降至90%梯度進行 或等度進行;收集保留時間為15~20min的組分，去除溶劑干燥得到含有槲皮素-3-0-葡萄 糖苷的一維粗產品和第一剩余品；
[0014] (3)將步驟(2)得到的一維粗產品溶解在體積濃度為40-80%的甲醇-水溶液或乙 醇-水溶液中，得到所述一維粗產品的濃度為20-200mg/mL的粗產品溶液；
[0015] (4)對所述步驟(3)得到的粗產品溶液進行二維液相色譜制備，得到槲皮素-3-0-葡萄糖苷；
[0016] S2所述槲皮素-3-0-2"，6"_二鼠李糖基葡萄糖苷的制備方法，
[0017] (a)將銀杏葉提取物溶于體積濃度為40-80%的乙醇-水溶液中，制備得到銀杏葉 提取物的濃度為10-1 〇〇〇mg/mL的提取物溶液；
[0018] (b)對所述步驟(a)得到的提取物溶液進行一維液相色譜分離，得到一維粗產品； 本步驟中一維液相色譜分離的條件為，色譜柱采用以硅膠為基質的親水型色譜填料;流動 相中的有機相為乙醇或乙腈，水相為水;洗脫條件以〇_15min有機相95%降至90%梯度進行 或等度進行;收集保留時間為28-32min的組分，去除溶劑干燥得到含有槲皮素-3-0-2"，6"-二鼠李糖基葡萄糖苷的一維粗產品和第二剩余品；
[0019] (c)將步驟(b)得到的一維粗產品溶解在體積濃度為40-80%的甲醇-水溶液或乙 醇-水溶液中，得到所述一維粗產品的濃度為20-200mg/mL的粗產品溶液；
[0020] (d)對所述步驟(c)得到的粗產品溶液進行二維液相色譜制備，得到槲皮素-3-0-2"，6"_二鼠李糖基葡萄糖苷；
[0021 ] S3由銀杏葉提取物形成的中藥組合物的制備方法
[0022] 將所述第一剩余品和和所述第二剩余品去除容積后混合，并干燥得到輔助品，將 所述輔助品、所述槲皮素-3-0-葡萄糖苷和所述槲皮素-3-0-2"，6"_二鼠李糖基葡萄糖苷混 合得到所述由銀杏葉提取物形成的中藥組合物。
[0023] 上述由銀杏葉提取物形成的中藥組合物的制備方法中，所述步驟(4)中二維液相 色譜條件為，色譜柱采用以硅膠為基質鍵合C18反相填料;流動相中的有機相為乙醇或甲 醇，水相為水;洗脫條件以0-60min有機相15%增至80%梯度進行或等度進行;收集保留時 間為30-40min的組分，干燥得到槲皮素-3-0-葡萄糖苷。
[0024] 上述由銀杏葉提取物形成的中藥組合物的制備方法中，所述步驟(d)中二維液相 色譜條件為，色譜柱采用以硅膠為基質鍵合C18反相填料;流動相中的有機相為乙醇或乙 腈，水相為水;0_60min內等度洗脫，洗脫時有機相的體積濃度為15-25 % ;收集保留時間為 40-45min的組分，干燥得到槲皮素-3-0-2"，6" -二鼠李糖基葡萄糖苷。
[0025] 上述由銀杏葉提取物形成的中藥組合物的制備方法中，所述步驟(2)中一維液相 色譜分離，有機相還含有甲酸，甲酸體積濃度為0.1 %;水相中還含有甲酸，甲酸體積濃度為 0.1% ；
[0026] 所述步驟(4)二維液相色譜制備，流動相中還含有甲酸，甲酸體積濃度為0.1%;水 相中還含有甲酸，甲酸體積濃度為0.1 %。
[0027] 上述由銀杏葉提取物形成的中藥組合物的制備方法中，所述步驟(c)中一維液相 色譜分離，有機相還含有甲酸，甲酸體積濃度為0.1 %;水相中還含有甲酸，甲酸體積濃度為 0.1% ；
[0028] 所述步驟(d)二維液相色譜制備，流動相中還含有甲酸，甲酸體積濃度為0.1%;水 相中還含有甲酸，甲酸體積濃度為0.1 %。
[0029] 上述任一所述中藥組合物在制備舒血寧注射液中的應用。
[0030] 與現有技術相比，本發明具有如下優點，
[0031] (1)本發明的銀杏葉提取物，將所述銀杏總黃酮的含量明確到24-40%，銀杏內酯 的含量明確到6-16%，同時明確了兩種對其藥物具有重要影響的槲皮素-3-0-葡萄糖苷和 槲皮素-3-0-2"，6"_二鼠李糖基葡萄糖苷，并進一步的將其含量精確限定為1-1.68%和 2.11-3.53 %，進一步的，清楚的界定其銀杏內酯Al. 4-3 %，銀杏內酯BO. 9-1.8 %和銀杏內 酯Cl. 2-1.3%。通過對銀杏葉提取物中有效成分含量的進一步精確，及有效成分的進一步 認定，提高了銀杏葉提取物的藥效，通過實驗表明其在冠心病心絞痛及缺血性腦血管病等 方面具有顯著的效果。
[0032] (2)本發明中通過對銀杏葉提取物進行精制和提純，得到具有確切含量的組合物， 在提高銀杏葉提取物藥效的同時，通過上述操作過程減少了雜質，從而減少了不良反應。
[0033] (3)本申請從銀杏葉提取物中采用二維液相色譜法分離出明確的藥用化合物槲皮 素-3-0-葡萄糖苷和槲皮素-3-0-2"，6"-二鼠李糖基葡萄糖苷，其制備方法簡單，分離操作 方便，利于銀杏葉提取物藥品質量的提尚。
【附圖說明】
[0034] 為了使本發明的內容更容易被清楚的理解，下面根據本發明的具體實施例并結合 附圖，對本發明作進一步詳細的說明，其中
[0035] 圖1本發明實施例1中制備得到的槲皮素 K-葡萄糖苷的質譜；
[0036] 圖2本發明實施例1中制備得到的槲皮素-3-0-葡萄糖苷的H譜；
[0037] 圖3本發明實施例1中制備得到的槲皮素-3-0-葡萄糖苷的C譜；
[0038] 圖4本發明實施例1中制備得到的槲皮素-3-0-2"，6"_二鼠李糖基葡萄糖苷的質 譜；
[0039] 圖5本發明實施例1中制備得到的槲皮素-3-0-2"，6"_二鼠李糖基葡萄糖苷的H譜；
[0040] 圖6本發明實施例1中制備得到的槲皮素-3-0-2"，6"_二鼠李糖基葡萄糖苷的C譜。
【具體實施方式】
[0041] 本發明實施例中出現的百分數％，如無特殊說明表示的是體積百分數，例如， "40%的乙醇一水溶液"表示乙醇的水溶液其中乙醇的體積百分數為40%;
[0042] "40%的甲醇一水溶液"表示甲醇的水溶液其中甲醇的體積百分數為40% ;
[0043] "乙醇（含0.1 %甲酸）"表示乙醇與甲酸的混合溶液其中甲酸的體積百分數為 0.1 % ; "7K(含〇. 1 %甲酸)"表示水與甲酸的混合溶液其中甲酸的體積百分數為〇. 1 %。
[0044] 本申請的銀杏葉提取物適用于采用現有提取工藝從銀杏葉中提取得到的提取物， 為便于比較，本申請實施例中采用的銀杏葉提取物由北京雙鶴高科天然藥物有限責任公司 提供。
[0045] 實施例1
[0046] 槲皮素-3-0-葡萄糖苷的制備
[0047] 稱取銀杏葉提取物IOg，溶于50mL 40%的乙醇一水溶液，制得銀杏葉提取物溶液， 濃度為200mg/mL，過0.45μηι微孔濾膜，進行一維液相色譜分離。一維液相色譜采用以硅膠為 基質的親水型色譜填料50 X 250mm，ΙΟμπι(華譜新創科技有限公司），流動相采用含0.1 %體 積濃度甲酸的甲醇為有機相，含〇. 1%體積濃度甲酸的水為水相，梯度洗脫方式:〇-15min有 機相濃度從95%降至90%臺階梯度進行。采用DAD紫外檢測器360nm選擇吸收波長，制備溫 度為室溫，進樣量為500yL/針，流動相流速為90mL/min，收集15~20分鐘的組分和剩余組 分，將收集到的15~20分鐘的組分進行旋轉蒸發濃縮至干，為一維制備槲皮素-3-0-葡萄糖 苷粗品。用50 %的乙醇一水溶液溶解槲皮素-3-0-葡萄糖苷粗品，濃度為80mg/mL，經微孔濾 膜過濾，進行二維液相色譜制備，色譜柱為以硅膠為基質的親水型色譜填料(50 X 150mm，5μ m，華譜新創科技有限公司）流動相選擇含0.1 %體積濃度甲酸的甲醇為有機相，含0.1%體 積濃度甲酸的水為水相，采用0_60min的15-80 %有機相梯度洗脫。采用DAD紫外檢測器 360nm選擇吸收波長，制備溫度為室溫，進樣量為1000 yL/針，流動相流速為90mL/min，收集 保留時間在30-40min的組分，旋轉蒸發至干，得到槲皮素-3-0-葡萄糖苷化合物。
[0048]分別采用質譜、1H-NMR和13C-NMR(MeOD)對得到的終產物進行分析，其中質譜、 1H-NMR譜圖如圖1和2所示，
[0049] 13C-NMR (MeOD)解析如下，
[0050] 槲皮素母環：157.64(C2)，134.24(C3)，178· 10(C4)，161.64(C5)，98.49(C6)， 164.60(C7)，93.32(C8)，157.07(C9)，104.31(C10)，121.69(C1，），114.61(C2,），144·51 (C3'），148.45(C4'），116.18(C5'），121.81(C6'）
[0051] 3-0-葡萄糖：102.95(<：1)，74.34(〇2"），76.98(〇3"），69.83((：4"），76.72(〇5"），