號為:
纖維寡糖轉運蛋白⑶T-1 (NCU00801)，FGSC 16575 (配型a);
纖維寡糖轉運蛋白⑶T-2 (NCU08114),FGSC 17868 (配型a)和FGSC 17869 (配型A);纖維寡糖轉運類似蛋白NCU05853，FGSC 13770 (配型a)和FGSC 13771 (配型A);β-葡萄糖苷酶單基因突變菌株BGl (NCU00130), FGSC11822 (配型a)和FGSCl 1823(配型A)；
β -葡萄糖苷酶單基因突變菌株BG2(NCU04952)，FGSC13731(配型a)和FGSC13732 (配型A)；
β -葡萄糖苷酶單基因突變菌株BG3(NCU08755)，FGSC18387(配型a)和FGSC18388(配型A)；
碳分解代謝物阻遏蛋白CRE-1 (NCU08807),FGSC 18633 (配型a);
野生型粗糙脈胞菌WT，FGSC 2489 ；
“NCU……”為粗糙脈孢菌的基因位點編號，“FGSC……”為FGSC的保藏編號。
[0019]實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，實施例將有助于理解本發明，但是本發明的保護范圍不限于下述的實施例。
[0020]
實施例1、構建用于生產纖維素酶的多基因突變菌株Δ3β G(Δ ncu00130 Δ ncu04952 Δ ncu08755), CPL2 ( Δ3β GΔcdtl),CPL3 ( Δ3β GΔcdt2), CPL4(Λ 3 β G Λ ncu05853)，CPL5 ( Δ3β GAcdtlA cdt2)，CPL6 ( Δ3β GAcdtlA ncu05853), CPL7(Λ 3 β G Λ cdt2 Δ ncu05853)和 CPL8 ( Δ3β GAcdtlA cdt2 Δ ncu05853)
構建方法包括以下步驟:
IA2PG ( Ancu00130Ancu08755)的構建 1.1雜交 I)作為父本的β-葡萄糖苷酶單突變體菌株BGl (NCU00130)，FGSC11822 (配型a)在MM斜面培養基【50 X Vogel’ s鹽20mL,鹿糖20g,瓊脂15g,組氨酸(50mg/mL) 20mL,定容體積到1L，高壓滅菌。50 X Voger s鹽(1L):檸檬酸三鈉(1/2H20) 150g，無水KH2PO4 250g，無水 NH4NO3 10g, MgSO4*7H20 10g, CaCl2CH2O 5g，微量元素鹽溶液 5mL，生物素(0.lmg/mL)2.5mL,定容體積到1L。】上28°C培養7天后待用。
[0021]2)作為母本的β -葡萄糖苷酶單突變體菌株BG3 (NCU08755), FGSC18388(配型A)在Westergaards平板培養基【4 X Westergaards鹽溶液250mL,鹿糖15g,瓊脂15g,調PH值 6.5,定容到 1L,高壓滅菌，倒平板。4XWestergaards 鹽溶液(1L):KN03 4g, KH2PO4 4g,MgSO4*7H20 2g，微量元素鹽溶液4mL，生物素(0.lmg/mL) 200 μ L，定容體積到1L。】上28°C培養10天，在體式顯微鏡下觀察子囊，若有子囊產生，則進行雜交試驗，若未產生子囊則繼續培養，直至看到大量子囊產生為止。
[0022]3)取ImL無菌水洗在MM斜面培養基上培養的BGl (NCUOO130)菌株孢子，制成孢子懸液，濃度為I X 17,均勻滴到Westergaards平板培養基上，用無菌槍頭均勻涂布，盡量涂成規則形狀，以便觀察是否污染。
[0023]3)雜交后的平板28°C培養大約2周后，在體式顯微鏡下觀察培養皿上蓋上是否有子囊孢子，若發現噴發出的子囊孢子，則取ImL無菌水沖洗培養皿上蓋，收集子囊孢子，4°C或常溫保存。
[0024]4)取收集的子囊孢子3 μ L加入30 μ L無菌水放于60°C水浴熱激半小時，殺死子囊孢子里混合的紅色分生孢子。
[0025]5)采用玻璃珠子法涂BDES (雜交篩選培養基)+hph (潮霉素)平板【配方:BDES平板培養基(IL):50XVogel’ s鹽20mL,瓊脂15g，定容到950mL,高壓滅菌，再加50mL20 XBDES鹽溶液，倒平板(潮霉素hph終濃度200 μ g/mL)】，28°C培養12小時后在顯微鏡下挑單菌落(挑單菌落過程中，挑取發生菌絲交叉的單菌落)，轉接到MM+hph斜面培養基【配方:50XVogel’ s鹽20mL,鹿糖20g,瓊脂15g,組氨酸(50mg/mL) 20mL,定容體積到1L,高壓滅菌。50 X Vogel’ s 鹽(IL):檸檬酸三鈉(1/2H20) 150g，無水 KH2PO4 250g，無水 NH4NO3100g,MgSO4*7H20 10g，CaCl2CH2O 5g，微量元素鹽溶液 5mL，生物素(0.lmg/mL) 2.5mL，定容體積到1L。】中28°C培養3天。
[0026]6) 3天后，將挑取的菌轉接到麗斜面培養基上28°C培養3天，然后放于室溫下培養7天，提孢子DNA進行PCR驗證。
[0027]1.2提基因組DNA
采用酚氯仿法從BGl (NCU00130)&BG3 (NCU08755)雜交菌產生的孢子中提取基因組DNA,具體包括以下操作:
1)2.0mL的無菌的DNA提取管中加入200mg的鋯珠，標號準備下一步用.2)加ImL 的裂解液(lysis buffer，配方:0.2M Tris.HCl (pH 7.5)，0.5Μ NaCl, 1mMEDTA，I % SDS (w/v))于每個斜面培養基試管中，用ImL槍頭將孢子輕輕刮下，將孢子溶解。
[0028]3)漩渦震蕩10s，取400 μ L孢子懸液預先準備好的DNA提取管中。
[0029]4)將所有DNA提取管置于助磨器上，最大轉速振蕩30s，重復兩次。
[0030]5) 65°C水浴30分，在水浴過程中每個幾分鐘取出漩渦振蕩。
[0031]6)水浴結束后取出，每管加入80 μ L pH 7.5的IM的Tris-HCl中和。
[0032]7)加入400 μ L的酚:氯仿(1:1)，13000rpm離心5分鐘。
[0033]8)取300 μ L上清液于新的1.5mL EP管中，加入600 μ L 95%的乙醇(DNA級)。
[0034]9)冰上孵育一小時，隨后4°C、13000rpm離心，可看到白色的DNA沉淀到EP管底部。
[0035]10)用75%的酒精(DNA級)400 μ L清洗，4度13000rpm離心，輕輕取出上清液。
[0036]11)將EP管置于真空濃縮儀中，真空干燥酒精。
[0037]12)加入50 μ L ddH20溶解DNA，用NanoDrop測DNA濃度，測完濃度后將提取的DNA置于-20°C冰箱保存，以備下一步進行PCR驗證。
[0038]1.3 PCR驗證突變體
BGl (NCU00130)&BG3 (NCU08755)雜交菌中提取基因組DNA (方法見1.2)，以提取的基因組DNA為模版進行基因BGl (NCUOO130) &BG3 (NCU08755)的PCR驗證。
[0039]I) 25 μ L RCR體系包括:12.5 μ L DreamTaq PCR Master Mix 12.5 μ L, 9.5 μ L 水(nuclease-free),上、下游引物各IyL (上游引物序列hph5f,為了驗證潮霉素hph基因，序列為5’ -TGCAATAGGTCAGGCTCT-3’，下游引物NCU00130r，為了驗證潮霉素hph基因處在NCUOO130 基因位點，序列為 5，-GTAGTGTACAAACCCCAAGC-3’和下游引物 NCU08755r，為了驗證潮霉素hph基因處在NCU08755基因位點，序列為5’- GACAGTGGAGGTGAGAAAGG-3’)，基因組 DNA IuL0
[0040]2) PCR擴增條件為:先95°C預變性5分鐘；然后94°C變性30秒，52°C退火45秒，72°C延伸2分鐘，共34個循環；最后72°C退火10分鐘。
[0041]3)對PCR擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳(IlOV電壓，30分鐘)，在凝膠成像系統下看基因擴增條帶，顯示在上游弓I物hph5f和下游引物NCUOO130r的引導下經PCR擴增獲得了 1780bp目的條帶，該條帶表明NCU00130基因已經被潮霉素hph基因替代；在上游引物hph5f和下游引物NCU08755r的引導下經PCR擴增獲得了 1850bp目的條帶，該條帶表明NCU08755基因已經被潮霉素hph基因替代。通過PCR方法擴增出同源重組的hph基因片段即表明已經成功敲除目的基因，只要兩個條帶同時電泳可見，則表明兩基因(核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.1和N0.5所示)敲除成功，。該結果確證已獲得了 β -葡萄糖苷酶雙基因突變菌株，命名為Δ2β6 ( Ancu00130Ancu08755)(配型a)。
[0042]
2Δ3β6 ( Λ IicuOOl3OAncuO4952 AncuO8755)的構建
2.1 雜交:以實施例1中Λ2β6 (Ancu00130Ancu08755)(配型a)作為母本，以BG2 (NCU04952), FGSC13732 (配型A)作為父本進行雜交，方法見實施例1步驟1.1。
[0043]2.2提基因組DNA:方法見實施例1步驟1.2。
[0044]2.3 PCR驗證篩選突變體
上游引物hph5f，為了驗證潮霉素hph基因，序列為5 ’ -TGCAATAGGTCAGGCTCT-3 ’ ；下游引物NCU00130r，為了驗證潮霉素hph基因處在NCU 00130基因位點，序列為5’ -GTAGTGTACAAACCCCAAGC-3’ ；下游引物 NCU04952r，為了 驗證潮霉素 hph 基因處在 NCU04952基因位點，序列為5’ -AACACACACACACACACTGG-3’ ；下游引物NCU08755r，為了驗證潮霉素hph基因處在NCU 08755基因位點，序列為5’ -GACAGTGGAGGTGAGAAAGG-3’。PCR反應體系及反應條件見實施例1步驟I。結果在上游引物hph5f和下游引物NCU00130r的引導下經PCR擴增獲得了 1780bp目的條帶，該條帶表明NCU00130基因已經被潮霉素hph基因替代；在上游引物hph5f和下游引物NCU04952r的引導下經PCR擴增獲得了 1910bp目的條帶，該條帶表明NCU04952基因已經被潮霉素hph基因替代；在上游引物hph5f和下游引物NCU08755r的引導下經PCR擴增獲得了 1850bp目的條帶，該條帶表明NCU08755基因已經被潮霉素hph基因替代。通過PCR方法擴增出同源重組的hph基因片段即表明已經成功敲除目的基因，所以只要三個條帶同時電泳可見，則表明三基因(核苷酸序列如序列表中SEQ IDN0.1、N0.3、N0.5所示)敲除成功，與預期結果相符，表明獲得了 β -葡萄糖苷酶三基因突變菌株，命名為 Δ3β6 ( Δ ncu00130 Δ ncu04952 Δ ncu08755)(配型 a)。
[0045]
3Δ cdtl Δ cdt2 ( Δ ncu00801 Δ ncu08114)的構建
3.1 雜交:以 Acdtl (NCU00801, FGSC 16575 配型 a)作為母本，以 Λ cdt2(NCU08114),FGSC 17869 (配型A)作為父本進行雜交，方法見實施例1步驟1.1。
[0046]3.2提基因組DNA:方法見實施例1步驟1.2。
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