0047]3.3 PCR驗證篩選突變體
上游引物hph5f，為了驗證潮霉素hph基因，序列為5 ’ -TGCAATAGGTCAGGCTCT-3 ’ ；下游引物801Vr,為了驗證潮霉素hph基因處在NCU00801基因位點，序列為5’ -TTAGGGTTGTAGACACCTGC-3’ ；下游引物 8114Vr，為了驗證潮霉素 hph 基因處在 NCU08114基因位點，序列為5’ - GACGACCAGAACTAGGTAGG-3’ ；PCR反應體系及反應條件見實施例1步驟I。結果在上游引物hph5f和下游引物801Vr的引導下經PCR擴增獲得了 1741bp目的條帶，該條帶表明NCU00801基因已經被潮霉素hph基因替代；在上游引物hph5f和下游引物8114Vr的引導下經PCR擴增獲得了 1857bp目的條帶，該條帶表明NCU08114基因已經被潮霉素hph基因替代。通過PCR方法擴增出同源重組的hph基因片段即表明已經成功敲除目的基因，所以只要三個條帶同時電泳可見，則表明三基因(核苷酸序列如序列表中SEQ IDN0.1、N0.3、N0.5所示)敲除成功，與預期結果相符，表明獲得了 β -葡萄糖苷酶三基因突變菌株，命名為 Δ cdtl Δ cdt2 ( Δ ncu00801 Δ ncu08114)(配型 a)。
[0048]
4Δ cdtl Δ cdt2 Δ ncu05853 ( Δ ncu00801 Δ ncu08114 Δ ncu05853)的構建
4.1 雜交:以 3 中獲得的 AcdtlAcdt2 ( Δ ncu00801 Δ ncu08114)(配型 a)作為母本，以Ancu05853 (NCU05853)，FGSC 13771 (配型A)作為父本進行雜交，方法見實施例1步驟1.1。
[0049]4.2提基因組DNA:方法見實施例1步驟1.2。
[0050]4.3 PCR驗證篩選突變體
上游引物hph5f，為了驗證潮霉素hph基因，序列為5 ’ -TGCAATAGGTCAGGCTCT-3 ’ ；下游引物801Vr,為了驗證潮霉素hph基因處在NCU00801基因位點，序列為5’ -TTAGGGTTGTAGACACCTGC-3’ ；下游引物 8114Vr，為了驗證潮霉素 hph 基因處在 NCU08114基因位點，序列為5’ - GACGACCAGAACTAGGTAGG-3’ ；下游引物5853Vr，為了驗證潮霉素hph基因處在NCU05853基因位點，序列為5’ -GAGCAAGGTTATAGGACTGC-3’ ；PCR反應體系及反應條件見實施例1步驟I。結果在上游引物hph5f和下游引物801Vr的引導下經PCR擴增獲得了 1741bp目的條帶，該條帶表明NCU00801基因已經被潮霉素hph基因替代；在上游引物hph5f和下游引物8114Vr的引導下經PCR擴增獲得了 1857bp目的條帶，該條帶表明NCU08114基因已經被潮霉素hph基因替代；在上游引物hph5f和下游引物5853Vr的引導下經PCR擴增獲得了 1677bp目的條帶，該條帶表明NCU05853基因已經被潮霉素hph基因替代。通過PCR方法擴增出同源重組的hph基因片段即表明已經成功敲除目的基因，所以只要三個條帶同時電泳可見，則表明三基因(核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.1、N0.3、N0.5所示)敲除成功，與預期結果相符，表明獲得了 β -葡萄糖苷酶三基因突變菌株，命名為 Acdtl Acdt2Ancu05853 ( Δ ncu00801 Δ ncu08114 Δ ncu05853)(配型 A)。
[0051]
5 CPL2 ( Δ 3 β GA cdtl), CPL3 ( A3^GAcdt2), CPL4 ( Δ 3 β G Δ ncu05853 ),CPL5 ( A3^GAcdtlAcdt2), CPL6 (A3^GAcdtlAncu05853), CPL7(A3PGAcdt2Ancu05853)和 CPL8 ( Δ 3 β G Δ cdtl Δ cdt2 Δ ncu05853)的構建
5.1 雜交:以 2 中獲得的 Λ3β6 ( Δ ncu00130 Δ ncu04952 Δ ncu08755)(配型 a)作為母本，以 4 中獲得的 Acdtl Acdt2Ancu05853 ( Δ ncu00801 Δ ncu08114 Δ ncu05853)(配型A)作為父本進行雜交，方法見實施例1步驟1.1。
[0052]5.2提基因組DNA:方法見實施例1步驟1.2。
[0053]5.3 PCR驗證篩選突變體
上游引物hph5f，為了驗證潮霉素hph基因，序列為5 ’ -TGCAATAGGTCAGGCTCT-3 ’ ；下游引物NCU00130r，為了驗證潮霉素hph基因處在NCU 00130基因位點，序列為5 ’ -GTAGTGTACAAACCCCAAGC-3，.’下游引物NCU04952r，為了驗證潮霉素hph基因處在NCU04952 基因位點，序列為 5’-AACACACACACACACACTGG-3’ ；下游引物 NCU08755r，為了驗證潮霉素hph基因處在NCU 08755基因位點，序列為5’ -GACAGTGGAGGTGAGAAAGG-3’ ；下游引物801Vr,為了驗證潮霉素hph基因處在NCU00801基因位點，序列為5’ -TTAGGGTTGTAGACACCTGC-3’ ；下游引物 8114Vr，為了驗證潮霉素 hph 基因處在 NCU08114基因位點，序列為5’ - GACGACCAGAACTAGGTAGG-3’ ；下游引物5853Vr，為了驗證潮霉素hph基因處在NCU05853基因位點，序列為5’ -GAGCAAGGTTATAGGACTGC-3’。PCR反應體系及反應條件見實施例1步驟I。結果在上游引物hph5f和下游引物NCU00130r的引導下經PCR擴增獲得了 1780bp目的條帶，該條帶表明NCU00130基因已經被潮霉素hph基因替代；在上游引物hph5f和下游引物NCU04952r的引導下經PCR擴增獲得了 1910bp目的條帶，該條帶表明NCU04952基因已經被潮霉素hph基因替代；在上游引物hph5f和下游引物NCU08755r的引導下經PCR擴增獲得了 1850bp目的條帶，該條帶表明NCU08755基因已經被潮霉素hph基因替代。結果在上游引物hph5f和下游引物SOlVr的引導下經PCR擴增獲得了 1741bp目的條帶，該條帶表明NCU00801基因已經被潮霉素hph基因替代；在上游引物hph5f和下游引物8114Vr的引導下經PCR擴增獲得了 1857bp目的條帶，該條帶表明NCU08114基因已經被潮霉素hph基因替代；在上游引物hph5f和下游引物5853Vr的引導下經PCR擴增獲得了 1677bp目的條帶，該條帶表明NCU05853基因已經被潮霉素hph基因替代。通過PCR方法擴增出同源重組的hph基因片段即表明已經成功敲除目的基因，所以只要六個條帶同時電泳可見，則表明三基因(核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.1、N0.3、N0.5所示)敲除成功，與預期結果相符，表明獲得了 CPL2 (Λ3β GAcdtl )，CPL3 ( Λ 3 β G Λ cdt2)，CPL4(Λ 3 β G Λ ncu05853)，CPL5 ( Λ 3 β G Λ cdtl Λ cdt2)，CPL6 ( Λ 3 β G Λ cdtl Λ ncu05853), CPL7(A3PGAcdt2Ancu05853)和 CPL8 ( Λ 3 β G Λ cdtl Λ cdt2 Λ ncu05853)。多基因突變體見圖1所示。
[0054]實施例2、多基因突變菌株 CPL2 ( Λ 3 β GΛ cdtl)，CPL3 ( Λ 3 β GΛ cdt2)，CPL4(A3^GAncu05853), CPL5 ( Δ 3 β G Δ cdtl Δ cdt2), CPL6 ( Δ 3 β G Δ cdtl Δ ncu05853),CPL7 ( A3PGAcdt2Ancu05853)和 CPL8 ( Δ 3 β G Δ cdtl Δ cdt2 Δ ncu05853)的纖維素產酶功能驗證實驗
2.1纖維二糖(Cellob1se)誘導產纖維素酶實驗
將以上構建得到的多基因突變菌株CPL2 ( A3^GAcdtl),CPL3 ( Δ 3 β G Δ cdt2), CPL4(Λ 3 β G Λ ncu05853)，CPL5 ( Λ 3 β G Λ cdtl Λ cdt2)，CPL6 ( Λ 3 β G Λ cdtl Λ ncu05853), CPL7(A3PGAcdt2Ancu05853)和 CPL8( Λ 3 β G Λ cdtl Λ cdt2 Λ ncu05853)以及 Λ 3 β G 和野生型菌株FGSC2489(WT)首先分別在2 % (2g/100mL)蔗糖培養基(配方:50 X Vogel ’ s鹽20mL，葡萄糖20g，定容體積到1L，高壓滅菌。)上25°C培養48小時后，然后轉入2% (2g/100mL)的纖維二糖(CB)培養基25°C繼續培養7d,樣品離心取上清液，測定蛋白濃度(Protein)，跑SDS-PAGE 和測定纖維素酶活(CMCase activity)。
[0055]2.1.1上清蛋白濃度測定
使用伯樂Bradford蛋白快速測試試劑盒檢測I到7d上清中的蛋白濃度,結果如圖2A所示。與野生型和Δ3β6相比，CPL2，CPL3，CPL6和CPL7的蛋白都有提高，其中CPL3和CPL7的蛋白濃度提高最為明顯，CPL3蛋白提高較緩，CPL7 ( Λ 3 β G Λ cdt2 Λ ncu05853)迅速提高蛋白濃度，在第一天就有大量蛋白分泌。
[0056]2.1.2 上清 SDS-PAGE 電泳檢測
根據蛋白濃度，選擇2d，3d和7d上清液進行4-12 % SDS-PAGE電泳檢測，結果如圖 4所示。上樣順序為 M:Maker，1: WT, 2: Δ 3 β G, 3: Δ3β GAcdtl (CPL2)，4: A3^GAcdt2 (CPL3)，5: Δ 3 β G Δ ncu05853 (CPL4)，6: Δ 3 β G Δ cdtl Δ cdt2(CPL5), 7: A3^GAcdtl Ancu05853 (CPL6)，8: Δ 3 β G Δ cdt2 Δ ncu05853 (CPL7)，9:Δ 3 β G Δ cdtl Δ cdt2 Δ ncu05853 (CPL8)。發現隨著時間的延長,蛋白條帶濃度逐漸加強，表明蛋白濃度逐漸增加。第二天泳道8的纖維素酶條帶明顯粗于其他菌株，表明纖維素酶高于其他菌株。泳道4中纖維素酶條帶隨著時間延長，條帶逐漸加粗，表明纖維素酶逐漸提聞。
[0057]2.1.3上清纖維素酶酶活檢測
選取Id, 3d, 5d和7d的上清進行纖維素酶酶活測定(CMCase activity),結果如圖2B所示。纖維二糖誘導條件下，野生型粗糙脈孢菌(WT)盡管有蛋白分泌但無纖維素酶酶活。與Λ 3 β G相比，CPL3和CPL7都有很高的纖維素酶酶活。與SDS-PAGE檢測一致，CPL3隨著時間延長，酶活逐漸提高，CPL7則是在纖維二糖誘導第一天就有大量的纖維素酶酶活。
[0058]
2.2微晶纖維素(Avicel)誘導產纖維素酶實驗
將以上構建得到的多基因突變菌株CPL2 ( A3^GAcdtl),CPL3 ( Δ 3 β G Δ cdt2), CPL4(Λ 3 β G Λ ncu05853)，CPL5 ( Λ 3 β G Λ cdtl Λ cdt2)，CPL6 ( Λ 3 β G Λ cdtl Λ ncu05853), CPL7(A33GAcdt2Ancu05853)和 CPL8 ( Δ 3 β G Δ cdtl Δ cdt2 Δ ncu05853)以及 Λ 3 β G 和野生型菌株FGSC2489 (WT