活，包括纖維二糖(纖維素酶誘導物)的轉運吸收相關基因以及主要的纖維素酶相關轉錄因子的上調表達。
[0070]實施例6、高產多基因突變菌株CPL9 ( A3PGAcdt2Ancu05853Acrel)在纖維二糖及纖維素條件下的誘導產酶
6.1 雜交:以實施例1中CPL8 (A3^GAcdt2Ancu05853)(配型A)作為母本，以CRE-1 (NCU08807, FGSC 18633，配型a)作為父本進行雜交，方法見實施例1步驟1.1。
[0071]6.2提基因組DNA:方法見實施例1步驟1.2。
[0072]6.3 PCR驗證篩選突變體
上游引物hph5f，為了驗證潮霉素hph基因，序列為5 ’ -TGCAATAGGTCAGGCTCT-3 ’ ；下游引物NCU00130r，為了驗證潮霉素hph基因處在NCU 00130基因位點，序列為
5’ -GTAGTGTACAAACCCCAAGC-3，.’下游引物NCU04952r，為了驗證潮霉素hph基因處在NCU04952 基因位點，序列為 5’-AACACACACACACACACTGG-3’ ；下游引物 NCU08755r，為了驗證潮霉素hph基因處在NCU 08755基因位點，序列為5’ -GACAGTGGAGGTGAGAAAGG-3’ ；下游引物8114Vr,為了驗證潮霉素hph基因處在NCU08114基因位點，序列為5’ -GACGACCAGAACTAGGTAGG-3’ ；下游引物5853Vr，為了驗證潮霉素hph基因處在NCU05853基因位點，序列為5’ -GAGCAAGGTTATAGGACTGC-3’ ；下游引物8807Vr，為了驗證潮霉素hph基因處在NCU08807基因位點，序列為5’ -AGCCCTAACCAGTTACTACG-3’。PCR反應體系及反應條件見實施例1步驟I。結果在上游引物hph5f和下游引物NCU00130r的引導下經PCR擴增獲得了 1780bp目的條帶，該條帶表明NCU00130基因已經被潮霉素hph基因替代；在上游引物hph5f和下游引物NCU04952r的引導下經PCR擴增獲得了 1910bp目的條帶，該條帶表明NCU04952基因已經被潮霉素hph基因替代；在上游引物hph5f和下游引物NCU08755r的引導下經PCR擴增獲得了 1850bp目的條帶，該條帶表明NCU08755基因已經被潮霉素hph基因替代。在上游引物hph5f和下游引物8114Vr的引導下經PCR擴增獲得了 1857bp目的條帶，該條帶表明NCU08114基因已經被潮霉素hph基因替代；在上游引物hph5f和下游引物5853Vr的引導下經PCR擴增獲得了 1677bp目的條帶，該條帶表明NCU05853基因已經被潮霉素hph基因替代。在上游引物hph5f和下游引物8807Vr的引導下經PCR擴增獲得了 1854bp目的條帶，該條帶表明NCU08807基因已經被潮霉素hph基因替代。通過PCR方法擴增出同源重組的hph基因片段即表明已經成功敲除目的基因。通過篩選，獲得了 CPL9(Δ 3 β G Δ cdt2 Δ ncu05853 Δ crel), CPLlO ( Λ 2 β G Λ cdt2 Λ ncu05853)。
[0073]6.4 CPL9 ( A3PGAcdt2Ancu05853Acrel)在纖維二糖及纖維素條件下的誘導產酶分析
將以上構建得到CPL9突變菌株(A3PGAcdt2Ancu05853Acrel)和CPL7(A3^GAcdt2Ancu05853)首先分別在 2% (2g/100mL)蔗糖培養基(配方:50XVoger s鹽20mL，葡萄糖20g，定容體積到1L，高壓滅菌。)上25 °C培養48小時后，然后轉入2% (2g/100mL)的纖維二糖(CB)培養基25 °C繼續培養7d，樣品離心取上清液，測定蛋白濃度(Protein)和測定纖維素酶活(CMCase activity)。結果顯示，CPL9(Δ 3 β G Δ cdt2 Δ ncu05853 Δ crel)蛋白以及酶活都有顯著的提高(圖7和圖8)，該突變體可以顯著提升產酶和纖維素降解利用。
[0074]實施例7、高產多基因突變菌株CPLlO ( Λ 2 β G Λ cdt2 Λ ncu05853)在纖維二糖及纖維素條件下的誘導產酶
將實施例6和實施例1中構建得到的CPLlO ( Δ 2 β G Δ cdt2 Δ ncu05853) Δ2β6首先分別在2% (2g/100mL)蔗糖培養基(配方:50X Vogel, s鹽20mL，葡萄糖20g，定容體積到1L，高壓滅菌。)上25°C培養48小時后，然后轉入2% (2g/100mL)的纖維二糖(CB)或2%結晶纖維素(AviceI)培養基25°C繼續培養7d，定時取樣，測定蛋白濃度(Protein)。與A 2 β G相比較，無論在結晶纖維素還是纖維二糖條件下，CPL10( Λ 2 β G Λ cdt2 Δ ncu05853)蛋白產量都有顯著的提高(圖9)。此外，在纖維二糖誘導條件下，CPLlO中纖維素酶基因(NCU07340)和半纖維素酶相關轉錄因子(NCU06971)的表達水平都有顯著提高(圖10)。由此可知，CPLlO突變體相比Λ 2 β G能夠顯著提升產酶和纖維素降解利用。
【主權項】
1.用于生產纖維素酶或將生物質降解轉化為糖或其他化學品的多基因突變菌株，其特征在于，含有敲除、突變或弱化表達clpl (ncu05853)基因，能夠在纖維二糖以及纖維素誘導條件下高產纖維素酶系，以及生物質降解能力得到提升；為以下菌株之一: a.命名為CPL7(A3 0GAcdt2AncuO5853)的基因突變菌株，構建部分堿基突變或敲除或減弱纖維寡糖轉運類似蛋白NCU05853和纖維寡糖轉運蛋白⑶T-2 (NCU08114)以及β -葡萄糖苷酶基因NCUOO130、NCU04952和NCU08755的微生物菌株； b.命名為CPL9( Λ 3 β G Λ cdt2 Δ ncu05853 Δ crel)，構建部分堿基突變或敲除或減弱纖維寡糖轉運類似蛋白NCU05853和纖維寡糖轉運蛋白⑶T-2 (NCU08114)和β -葡萄糖苷酶基因NCU00130、NCU04952和NCU08755以及碳分解代謝物阻遏蛋白CRE-1 (NCU08807)的微生物菌株； c.命名為CPLlO( Λ 2 β G Λ cdt2 Δ ncu05853)，構建部分堿基突變或敲除或減弱纖維寡糖轉運類似蛋白NCU05853和纖維寡糖轉運蛋白⑶T-2 (NCU08114)以及β -葡萄糖苷酶基因NCUOO130和NCU08755的微生物菌株； d.命名為CPLlI( Λ 2 β G Λ cdt2 Δ ncu05853 Δ crel)，構建部分堿基突變或敲除或減弱纖維寡糖感應蛋白NCU05853和纖維寡糖轉運蛋白⑶T-2 (NCU08114)和β -葡萄糖苷酶基因NCU00130和NCU08755以及碳分解代謝物阻遏蛋白CRE-1 (NCU08807)的微生物菌株； 所述纖維寡糖轉運類似蛋白CLPl (NCU05853)和纖維寡糖轉運蛋白⑶T_2 (NCU08114)以及葡萄糖苷酶基因的核苷酸序列及其編碼蛋白的氨基酸殘基序列如下:1)纖維寡糖轉運類似蛋白CLPl (NCU05853)的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.1所示；NCU05853編碼蛋白的氨基酸殘基序列如序列表中SEQ ID N0.2所示；2)纖維寡糖轉運蛋白NCU08114的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.3所示；纖維寡糖轉運蛋白NCU08114編碼蛋白的氨基酸殘基序列如序列表中SEQ ID N0.4所示；3) β -葡萄糖苷酶基因NCU00130的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.5所示；β -葡萄糖苷酶基因NCU00130編碼蛋白的氨基酸殘基序列如序列表中SEQ ID N0.6所示；4) β -葡萄糖苷酶基因NCU04952的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.7所示；β -葡萄糖苷酶基因NCU04952編碼蛋白的氨基酸殘基序列如序列表中SEQ ID N0.8所示；5) β -葡萄糖苷酶基因NCU08755的核苷酸序列如序列表中SEQ IDN0.9所示；β -葡萄糖苷酶基因NCU08755編碼蛋白的氨基酸殘基序列如序列表中SEQ IDN0.10所示；6)碳分解代謝物阻遏蛋白CRE-1 (NCU08807)的核苷酸序列如序列表中SEQ IDN0.11所示；碳分解代謝物阻遏蛋白CRE-1 (NCU08807)編碼蛋白的氨基酸殘基序列如序列表中SEQ ID N0.12所示。2.一種利用組合敲除CLP1(NCU05853)以及其他基因(包括纖維寡糖轉運蛋白CDTl或CDT2;葡萄糖苷酶基因(一個或多個葡萄糖苷酶基因:NCU00130, NCU04952, NCU08755, NCU03641, NCU08054, NCU07487, NCU05577)和碳分解代謝物阻遏蛋白 CRE-1 (NCU08807)中的不同組合.獲得及促進微生物纖維素酶系分泌能力，獲得或促進微生物水解生物質纖維素或半纖維素的方法，可將纖維素水解為纖維寡糖，將半纖維素水解為木寡糖木糖阿拉伯糖等，得到的重組微生物菌株與出發菌株相比，重組菌株獲得或提高纖維素酶分泌能力及生物質水解能力。3.以權利要求1或2提及的多基因突變菌株Λ3β6Λcdt2 Δ ncu05853,Δ 2 β G Δ c d t 2 Δ ncu05853, Δ 3 β G Δ c d t 2 Δ ncu05853 Δ crel,Λ 2 β G Λ cdt2 Δ ncu05853 Δ crel為基礎菌，繼續改造(敲除或突變等)其它基因，得到的用于生產纖維素酶的工程菌。4.一種使微生物獲得或提高生物質轉化為化學品的方法，是利用權利要求1-3中所述組合突變體，獲得或提高微生物將生物質降解后進一步將降解物(多種碳水化合物)轉化為有機酸等化學品的方法。5.利用過量表達NCU05383等方法，抑制纖維二糖由微生物的胞外轉運至胞內，從而使微生物可以利用生物質為原料，生產積累纖維二糖及其衍生化學品。6.根據權利要求1-5所述應用，其特征在于:所述微生物包括但不限于脈孢菌屬(Neurospora)、曲霉屬(Aspergillus)、木霉屬(Trichoderma)、青霉屬(Penicillium)、鐮刀霉屬(Fusarium)、腐質霉屬(humicola)、孢殼霉屬(Thielavia)、毀絲霉屬(Mycel1phthora)或側抱霉屬(Sporotrichum)。
【專利摘要】本發明公開了高產纖維素酶和提升木質纖維素降解能力的基因工程菌及應用。本發明通過發現一個纖維寡糖轉運蛋白類似蛋白CLP1(NCU05853)的功能,進一步組合敲除clp1和三個β-葡萄糖苷酶基因NCU00130、NCU04952、NCU08755，兩個纖維寡糖轉運蛋白基因NCU00801（cdt-1）和NCU08114（cdt-2），以及一個碳分解代謝物阻遏蛋白CRE-1（NCU08807）獲得系列多基因突變菌株Δ3βGΔcdt2Δncu05853、Δ2βGΔcdt2Δncu05853、Δ3βGΔcdt2Δncu05853Δcre1和Δ2βGΔcdt2Δncu05853Δcre1，該組合突變菌株能夠在纖維二糖或木質纖維素為底物時提升纖維素酶產量和木質纖維素降解能力。本發明提供了一種可以促進纖維素酶生產和以木質纖維素為原料生產化學品的方法。
【IPC分類】C12P19/12, C12N9/42, C12R1/645, C12R1/885, C12P19/14, C12R1/77, C12R1/66, C12R1/80, C12N1/14
【公開號】CN105647811
【申請號】
【發明人】田朝光, 蔡鵬麗, 王邦, 冀京梟, 姜永生, 孫文良, 萬里, 馬國力, 林良才, 尤偉, 馬延和
【申請人】中國科學院天津工業生物技術研究所
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2014年11月10日