)首先分別在2% (2g/100mL)蔗糖培養基(配方:50X Vogel’s鹽20mL，葡萄糖20g，定容體積到1L，高壓滅菌。)上25°C培養48小時后，然后轉入2%(2g/100mL)的微晶纖維素(AV)培養基25°C繼續誘導培養7d，樣品離心取上清液，測定蛋白濃度(Protein),跑 SDS-PAGE 和測定纖維素酶活(CMCase activity)。
[0059]2.2.1上清蛋白濃度測定
使用伯樂Bradford蛋白快速測試試劑盒檢測I到7d上清中的蛋白濃度,結果如圖3A所示。與野生型和Λ3β6相比，CPL7 ( A30GAcdt2AncuO5853)在第一天就有大量蛋白分泌。且蛋白濃度高于粗糙脈孢菌野生型菌株。
[0060]2.2.2 上清 SDS-PAGE 電泳檢測
根據蛋白濃度，選擇2d，3d和7d上清液進行4-12 % SDS-PAGE電泳檢測，結果如圖 4所示。上樣順序為 M:Maker，1: WT, 2: Δ 3 β G, 3: Δ3β GAcdtl (CPL2)，4: A3^GAcdt2 (CPL3)，5: Δ 3 β G Δ ncu05853 (CPL4)，6: Δ 3 β G Δ cdtl Δ cdt2(CPL5), 7: Δ3β GAcdtl Ancu05853 (CPL6)，8: Δ 3 β G Δ cdt2 Δ ncu05853 (CPL7)，9:Δ 3 β G Δ cdtl Δ cdt2 Δ ncu05853 (CPL8)。發現隨著時間的延長,蛋白條帶濃度逐漸加強，表明蛋白濃度逐漸增加。第二天泳道8的纖維素酶條帶明顯粗于其他菌株，表明纖維素酶高于其他菌株。泳道4中纖維素酶條帶隨著時間延長，條帶逐漸加粗，表明纖維素酶逐漸提聞。
[0061]2.2.3上清纖維素酶酶活檢測
選取Id, 3d, 5d和7d的上清進行纖維素酶酶活測定(CMCase activity),結果如圖3B所示。微晶纖維素誘導條件下，CPL7 ( Λ 3 β G Λ cdt2 Δ ncu05853)的纖維素酶酶活顯著高于野生型菌株(WT)。
[0062]
實施例 3、多基因突變菌株 CPL2 ( Λ3β GAcdtl)，CPL3 ( A3^GAcdt2), CPL4(A3^GAncu05853), CPL5 ( Δ 3 β G Δ cdtl Δ cdt2), CPL6 ( Δ 3 β G Δ cdtl Δ ncu05853),CPL7 ( A3PGAcdt2Ancu05853)和 CPL8 ( Δ 3 β G Δ cdtl Δ cdt2 Δ ncu05853)的纖維二糖轉運能力檢測實驗
將以上構建得到的多基因突變菌株CPL2 ( A3^GAcdtl),CPL3 ( Δ 3 β G Δ cdt2), CPL4(Λ 3 β G Λ ncu05853)，CPL5 ( Λ 3 β G Λ cdtl Λ cdt2)，CPL6 ( Λ 3 β G Λ cdtl Λ ncu05853), CPL7(A3PGAcdt2Ancu05853)和 CPL8( Λ 3 β G Λ cdtl Λ cdt2 Λ ncu05853)以及 Λ 3 β G 和野生型菌株FGSC2489(WT)首先分別在2 % (2g/100mL)蔗糖培養基(配方:50 X Vogel ’ s鹽20mL，葡萄糖20g，定容體積到1L，高壓滅菌。)上25°C培養48小時后，然后轉入2% (2g/100mL)的纖維二糖(CB)培養基25°C繼續培養7d，樣品離心取上清液，測定上清中纖維二糖殘留。
[0063]結果如圖5A所示，與對照Λ3β6相比，CPL3( A3@GAcdt2)纖維二糖轉運速率明顯低于A30G，CPL7 ( A30GAcdt2AncuO5853)轉運纖維二糖的速率明顯加快，快于對照菌Λ 3 β G。表明CPL7 ( Δ 3 β G Λ cdt2 Λ ncu05853)蛋白分泌和纖維素酶酶活提高是源于誘導物纖維二糖的轉運速率提高，進入胞內起誘導作用的增強。結果顯示通過敲除NCU05853可以提聞粗糖脈抱囷的纖維—糖轉運速率，進而提聞纖維素酶的提聞，因此NCU05853對于粗糙脈孢菌纖維二糖的轉運有抑制作用。由此可知，NCU05383也可以用于利用生物質積累(生產)纖維二糖的過程中。
[0064] 實施例4、多基因突變菌株CPL4 ( A3PGAncu05853) 和CPL7(Δ 3 β G Δ cdt2 Δ ncu05853)的纖維二糖轉運蛋白基因表達情況分析
將以上構建得到的多基因突變菌株CPL4 ( A3^GAncu05853), CPL5(Δ3β GAcdtl Acdt2)和 CPL7 ( Δ 3 β G Δ cdt2 Δ ncu05853)以及 Δ3β6 首先分別在 2%(2g/100mL)鹿糖培養基(配方:50X Vogel’ s鹽20mL,葡萄糖20g,定容體積到1L,高壓滅菌。)上25°C培養16小時后，然后轉入2% (2g/100mL)的纖維二糖(CB)培養基25°C繼續培養4 h,菌絲抽濾,液氮速凍用于RNA的提取。使用Invitrogen公司Trizol試劑提取RNA, DNase I處理去除基因組DNA,使用b1-rad公司RNA反轉錄試劑盒iScript cDNA合成試劑盒進行RNA反轉錄為cDNA,反轉錄體系為:4 μ I 5X iScript react1n mix,I μ L iScript reverse transcriptase, 500 ng RNA,并用雙蒸水補足至 20 yL,反應的程序為:25° C, 5 min ；42° C, 30 min ；85° C, 5 min。之后使用b1-rad公司的兩步法qRT-PCR 試劑盒 IQ SYBR Green Supermix 在 Mastercycler? ep realplex (B1Rad)上進行纖維寡糖轉運蛋白基因⑶T-1，⑶T-2和NCU5853基因的表達。qRT-PCR體系為:10 μ LIQTM SYBR? Green Supermix,0.5 μ L 10 μ M Forward primer,0.5 μ L 10 μ M Reverseprimer, I μ L cDNA,并用雙蒸水補足至20 μ L ;擴增程序為:95°C預變性15 min后進入39個擴增循環(95 °C變性15 s，55°C退火30 s, 72 °C延伸30 S)，之后72°C延伸5 min ;融解曲線為:50°C -90°C，5s。檢測引物對序列為:ActinRT-F:5，-TGATCTTACCGACTACCT-3’ 和ActinRT-R:5’-CAGAGCTTCTCCTTGATG-3 ；801RT-F:5’-CGAGACTGAGGAGATGAG-3’和 801RT-R:5’-GTATTGAAGTAACCGAGACC-3’ ； 8114RT-F:5’- CTTTATCTGGGTGTTCGG -3’和 8114RT-R:5’ - GTTCGCATAAGTATTGAGC -3’ ; 5853RT-F:5’ - GCCCTGACCTACACCTAC -3’ 和 5853RT-R:5’- GCCAAACGACCAAAGAGC -3’。qRT-PCR檢測結果如圖 5B 所示，CPL4( Λ 3 β G Λ ncu05853)和CPL7( Λ 3 β G Λ cdt2 Δ ncu05853)突變體菌株的纖維寡糖轉運蛋白基因表達顯著增高，尤其是高產纖維素酶菌株CPL7 ( A3^GAcdt2Ancu05853)中纖維寡糖轉運蛋白基因cdt-1的表達。
[0065]
實施例5、高產多基因突變菌株CPL7 ( A30GAcdt2AncuO5853)在纖維二糖條件下的轉錄組分析
將高產多基因突變菌株CPL7 ( Λ 3 β G Λ cdt2 Δ ncu05853)以及對照菌株CPL4(A33GAncu05853)和 Δ3β6 分別接種到 2%(2g/100mL)蔗糖培養基(配方:50X Vogel’s鹽20mL，葡萄糖20g，定容體積到1L，高壓滅菌。)上25 °C培養16小時后，然后轉入2%(2g/100mL)的纖維二糖(CB)培養基25°C繼續培養4 h，菌絲抽濾，液氮速凍用于RNA的提取。使用Invitrogen公司Trizol試劑提取RNA，DNase I處理去除基因組DNA。獲得RNA進行轉錄組測序。
[0066]轉錄組測序在華大基因測序公司(深圳總部)Illumina HiSeqTM 2000的平臺完成。在依據華大二代測序數據處理標準流程(WWW.genomics, cn)去接頭和低質量數據過濾后，測序讀段以最多2個錯配的容忍性，用Tophat (版本2.0.Sb)軟件比對到粗糙脈孢霉0R74A的基因組(第12版)上。比對結果儲存在SAM文件中以供后續分析使用。運用HTSeq 統計唯一比對到轉錄本(第 7 版，www.broadinstitute.0rg/annotat1n/genome/neurospora/MultiHome.html)外顯子區域的讀段數,并基于此數值，通過基因長度和測序深度歸一化處理，得到每個基因的表達值RPKM (每百萬測序讀段中某基因單位千堿基長度的讀段數)。不同樣本之間的基因差異分析使用GFOLD和DEGseq軟件。定義GFOLD大于等于I (即歸一化的表達差異大于等于2倍數)且DEGseq中費舍爾精確檢驗和似然比檢驗的P值小于10 4的兩基因之間表達有顯著差異。本研究中產生的所有轉錄組測序數據(包括Λ 3 β G，CPL4和CPL7菌株分別用2%纖維二糖誘導4小時)均以獲取號GSE60004存儲在NCBI 的 Gene Express1n Omnibus (GEO, www.ncb1.nlm.nih.gov/geo/)上。菌株 Δ3β6蔗糖誘導4小時的轉錄組數據來自GEO (獲取號GSE36719)。
[0067]如圖6Α所示，轉錄組數據分析顯示，與對照菌株Λ3β6相比，CPL4和CPL7中上調等于和大于2倍的基因有1309個。與在2%纖維二糖條件下的纖維素酶生產保持一致，CPL7的基因表達譜顯著不同于對照菌株Λ 3 β G和CPL4.聚類分析顯示這1309個基因屬于兩個大的分類。
[0068]第一類(Cl)有804個基因，與對照菌株A3i3G相比，它們在CPL7中都有很高的表達，并且部分在CPL4中有高的表達。通過funcat分析，如圖6B所示，在這804個基因中，225個基因富集在了碳復合物和碳水化合物代謝(多糖代謝相關)這個大的分類中。它包括主要的纖維素酶基因(NCU07340, NCU09680, NCU00762, NCU07190, NCU05121, NCU05057,和NCU04854)，主要的半纖維素酶基因和輔助功能基因(NCU08760, NCU02916, NCU02240,NCUO1050,和NCU00206)。如圖6C所示，這些基因在CPL7中有很高的表達。如圖6D所示，在這804個基因中，纖維素酶和半纖維素酶相關的轉錄因子(CLR-1，CLR-2和XLR-1)基因的表達上調了上百倍。除了這些基因之外，與前面的qRT-PCR分析結果一致的是纖維寡糖轉運蛋白基因cdt-1 (NCU00801)也包括在這804個基因中，如圖6E所示。與對照菌Δ3β6相比，cdt-1在CPL7中的表達上調了 86倍，NCU00809，一個同樣也具有纖維寡糖轉運能力的MFS轉運蛋白的基因表達也明顯上調。這些都支持了由于ncu05853的敲除，解除了 CPL7中的纖維二糖的轉運抑制的觀點。
第二大類有505個基因，這些基因在Λ3β G的蔗糖條件下有明顯上調表達，部分在CPL7在纖維二糖條件下有上調表達。Funcat分析顯示著505個基因的功能更多的是與生長相關，富集在蛋白合成，與蛋白結合和輔因子需求相關的結構，能量和代謝的幾個分類中。
[0069]綜上分析，通過轉錄組范圍的基因表達譜分析，我們可以看到在CPL7突變體菌株中整個纖維素酶誘導和表達機制都被激