-2和 10% 自體血清)，于37°C、含5%⑶2培養箱內培養過夜。第6天將20μ1 lE+7TU/ml重組D1-CAR慢病毒加入到人NK的六孔培養板中，體系為2ml，混勻，37 °C、5 % ω2的培養箱中孵育8-12個小時后，更換完全培養液RPMI 16404ml，所述完全培養液含50ng/ml IL_15、20ng/ml IL_12、20ng/ml IL-18、lOOIU/ml IL-2和10%自體血清；當NK細胞生長密度達到6 X 16細胞/ml時，將NK細胞轉移到1.5L培養袋中生長75cm2培養瓶，補充完全培養液RPMI 1640到10ml培養體系；于37°C、含5%C02培養箱內培養到第21天，期間根據NK細胞密度和培養基顏色變化補充完全培養基RPMI 1640(含50ng/ml IL_15、20ng/ml IL_12、20ng/ml IL-18、100IU/ml IL-2和 10% 自體血清)。
[0086]圖2為D1-CAR慢病毒轉染NK細胞后培養到21天后其的表達水平。在通過熒光定量PCR試劑盒按照使用說明書(美國Invitrogen公司)檢測，培養到第21天的NK細胞通過熒光定量PCR技術檢測，轉染了D1-CAR病毒轉染晚期黑色素瘤和葡萄膜黑色素瘤患者的NKs其表達D1-CAR基因分別高于未轉染的NKs為68.9和59.5倍。CAR-mNK為D1-CAR慢病毒轉染的黑色素瘤患者來源NK細胞，CAR-uNK為D1-CAR慢病毒轉染的葡萄膜黑色素瘤患者來源NK細胞，Blank-mNK為空白慢病毒轉染的黑色素瘤患者來源NK細胞，Blank_uNK為空白慢病毒轉染的葡萄膜黑色素瘤患者來源NK細胞，mNK為黑色素瘤患者來源NK細胞，uNK為葡萄膜黑色素瘤患者來源NK細胞。
[0087]實施例三
[0088]雙特異性嵌合抗原受體基因修飾的自然殺傷細胞蛋白印跡和流式細胞檢測
[0089]取實施例二制備的晚期黑色素瘤、葡萄膜黑色素瘤患者和正常健康人來源第15天培養獲得的NK細胞各I X 106，通過超聲破碎后進行蛋白凝膠電泳。根據目的蛋白的分子量，配制10%分離膠，濃縮膠濃度為5%。待檢測蛋白樣品上樣量:20yg/孔。電泳條件:濃縮膠恒壓90V，約20分鐘；分離膠恒壓120V，通過標準分子量預染蛋白來確定電泳停止時間。濕轉法，轉膜條件:300mA恒流;0.45μπι孔徑PVDF膜，轉膜時間80分鐘。轉膜完成后麗春紅染色試劑對膜進行染色，觀察轉膜效果。封閉:將膜完全浸沒于5 % (mg/mL)牛血清白蛋白(BSA)的轉膜緩沖液(含體積比3 %吐溫-20，TBST)中，室溫下水平搖床孵育I小時。一抗孵育:5 %(mg/mL)BSA-TBST稀釋鏈霉親和素標記的山羊抗小鼠IgG(H+L) 1:2000，購自上海碧云天生物技術有限公司；4 °C水平搖床孵育過夜。次日，洗膜:TBST洗3次，每次10分鐘。化學發光底物ECL滴加到膜的蛋白面，反應3-5分鐘;膠片曝光:10秒-5分鐘(曝光時間隨不同光強度而調整)，顯影2分鐘，定影。
[0090]膠片用掃描儀掃描為大于300DPI的TIF格式圖片，使用QuantityOne分析軟件(B1-Rad公司)進行灰度分析，圖3為蛋白印跡技術檢測D1-CAR融合蛋白在D1-CAR慢病毒轉染晚期黑色素瘤和葡萄膜黑色素瘤患者來源的NK細胞，以及D1-CAR融合蛋白大腸桿菌中表達水平(陽性對照)，即western blotting結果圖，在兩例患者中均出現兩條帶，其中一條為SLAMF7-CAR，約為482氨基酸殘基，分子量約為53kD ；另一條為FNv-CAR，約383氨基酸殘基，分子量約為42kD。第I條帶為D1-CAR慢病毒轉染晚期黑色素瘤NK細胞，第2條帶為D1-CAR慢病毒轉染晚期萄膜黑色素瘤NK細胞，第3條帶為D1-CAR融合蛋白大腸桿菌中表達，條帶分子量約為95kD，即SLAMF7-CAR和FNv-CAR分子量之和。
[0091]取實施例二制備的晚期黑色素瘤、葡萄膜黑色素瘤患者和正常健康人來源第15天培養獲得的I X 16NK細胞，進行流式抗體染色檢測分析。NK細胞第一組分別為20yL鼠抗人CD16-FITC、20yL 鼠抗人 CD56-PE 和 20yL 鼠抗人 CD3-PerCP;第二組分別為 20yL 鼠抗人 NKG2D-FITC、20yL鼠抗人NKp46-PE和20yL鼠抗人KIR3DLl-PerCP;同型對照組為20yL mlgGl-FITC、20yL mlgGl-PE和20yL mlgGl-PerCP;放置4°C冰箱染色30分鐘后用PBS洗滌3次，然后在FACS Cal ibur儀器(美國BD公司)上機檢測和分析。
[0092]圖4為實施例二制備的黑色素瘤患者D1-CAR慢病毒轉染NK細胞流式細胞檢測，該NK細胞⑶16和⑶56陽性率為94.44 %，⑶3陽性率為3.4%；激活性受體NKG2D和NKp46陽性率分別為93.04 %和75.84%；抑制性受體KIR3DL1陽性率為8.13%。實施例二制備的葡萄膜黑色素瘤患者和正常人D1-CAR慢病毒轉染NK細胞⑶16和⑶56陽性率均超過85%以上，CD3陽性率低于10% ;激活性受體NKG2D和NKp46陽性率分別高于75%以上;抑制性受體KIR3DL1陽性率低于10%以下。而未轉染的NK細胞⑶16和⑶56陽性率均也超過85%以上，CD3陽性率也低于10%;激活性受體NKG2D和NKp46陽性率也分別高于65%以上;但抑制性受體KIR3DL1卻高表達，陽性率超過50 %以上。
[0093]實施例四
[0094]雙特異性嵌合抗原受體基因修飾的自然殺傷細胞體外殺瘤試驗
[0095]分別以黑色素瘤細胞系A875和葡萄膜黑色素瘤細胞系MUM-2B為靶細胞，以實施例二中制備的D1-CAR慢病毒轉染NK細胞作為效應細胞，按效靶比40:1、20:1、10:1、5:1和2.5:1分別加入96孔培養板中，然后置于37°C、5%C02條件下培養4h，均設3個復孔。采用LDH細胞毒實驗法測定NK活性:吸取上清液50yL，置于96孔板中，加入LDH基液50yL，室溫避光30min，加入50yL終止液終止反應，490nm波長處測吸光度(OD)值。按下列公式分別計算PC-3和MCF-7細胞的殺傷率:殺傷率=(實驗組OD值-效應細胞自然釋放組OD值-靶細胞自然釋放組OD值)/(靶細胞最大釋放組OD值-靶細胞自然釋放組OD值)X 100%。
[0096]圖5為晚期黑色素瘤和葡萄膜黑色素瘤患者來源D1-CAR慢病毒轉染NK細胞對A875的殺傷活性，隨著效靶比提高，細胞毒性活性也不斷提高，D1-CAR慢病毒轉染黑色素瘤患者NK細胞殺傷A875殺傷毒性顯著高于未轉染的NK細胞，P值為0.016，而與D1-CAR慢病毒轉染葡萄膜黑色素瘤患者NK細胞相比較無差異。圖6為晚期黑色素瘤和葡萄膜黑色素瘤患者來源D1-CAR慢病毒轉染NK細胞對MUM-2B的殺傷活性，隨著效靶比提高，細胞毒性活性也不斷提高，D1-CAR慢病毒轉染葡萄膜黑色素瘤患者NK細胞殺傷MUM-2B殺傷毒性顯著高于未轉染的NK細胞，P值為0.021，而與D1-CAR慢病毒轉染黑色素瘤患者NK細胞相比較無差異。
[0097]實施例五
[0098]雙特異性嵌合抗原受體基因修飾的自然殺傷細胞體內殺瘤實驗中的作用
[0099]24只8周SCID裸鼠腹部側翼皮下注射5 X 16葡萄膜黑色素瘤系MUM-2B，飼養7天后，隨機分為A、B、C和D 4組，每組6只:A組為實施例二制備的D1-CAR慢病毒轉染葡萄膜黑色素瘤患者NK細胞治療組;B組為實施例二制備的空白慢病毒轉染葡萄膜黑色素瘤患者NK細胞治療組;C組為實施例二制備的未轉染的葡萄膜黑色素瘤患者NK細胞治療組;D組為生理鹽水安慰劑組。A組在D1-CAR慢病毒轉染葡萄膜黑色素瘤患者NK細胞培養到第14天和第16天尾靜脈注射2X 14細胞/克，B組在空白慢病毒轉染葡萄膜黑色素瘤患者NK細胞培養到第
14天和第16天尾靜脈注射2 X 14細胞/克，C組在未轉染葡萄膜黑色素瘤患者NK細胞培養到第14天和第16天尾靜脈注射2X 14細胞/克，D組與A、B和C治療組同時間，尾靜脈注射同體積的生理鹽水，各lmL。治療后分別于7d、14d、21d、28d和35d拉頸處死，取荷前列腺癌MUM-2BSCID鼠模型腫瘤組織，計算鼠模型荷瘤大小。
[0100]圖7荷葡萄膜黑色素瘤MUM-2BSCID鼠模型NK細胞治療完之后腫瘤大小變化曲線，生理鹽水組D和CAR-uNK治療組A、Blank-uNK治療組B與uNK治療組C相比，治療組A、治療組B與治療組C中葡萄膜黑色素瘤腫瘤大小縮少，但治療組A與治療組B與治療組C相比葡萄膜黑色素瘤腫瘤大小縮少更為明顯，P值分別為0.004和0.006，表明D1-CAR慢病毒轉染葡萄膜黑色素瘤患者NK細胞弓I發了強大的體內殺瘤活性。
【主權項】
1.一種雙特異性嵌合抗原受體基因修飾的自然殺傷細胞的制備方法，其特征在于，構建成含特異結合信號淋巴細胞激活分子家族成員7(Signaling Lymphocytic Activat1nMolecule Family ,Member 7，SLAMF7)以及纖連蛋白變異體(f ibronectin variant，FNv)的雙特異性嵌合抗原受體(double chimeric antigen