l IL-15、l_500ng/ml IL_12、1_500ng/ml IL-18和10_2000IU/ml IL-2。
[0021]本發明還提供了一種制備雙特異性嵌合抗原受體基因的自然殺傷細胞的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括:
[0022](I)獲得如上所述的穩定表達D1-CAR的病毒載體；
[0023](2)NK 細胞因子，包括 11^-15、11^-12、11^-18和11^-2;
[0024](3)鼠抗人CD16包被24孔板；
[0025](4)淋巴細胞培養基，包括RPMI 1640或無血清培養基；
[0026](5)淋巴細胞分離液；
[0027](6)生理鹽水；
[0028](7)使用說明書；
[0029]其中，所述使用說明書包括如上所述的方法。
[0030]本發明還提供了上述方法及其試劑盒制備NK細胞，可用于黑色素瘤、葡萄膜黑色素瘤和脈絡膜黑色素瘤的免疫治療。
【附圖說明】
[0031]圖1表示為構建的雙特異性嵌合抗原受體融合蛋白示意圖；
[0032]圖2表示為實施例二制備的D1-CAR慢病毒轉染NK細胞后培養到21天后其的表達水平；
[0033]圖3表示為蛋白印跡技術檢測實施例二制備的D1-CAR融合蛋白在D1-CAR慢病毒轉染NK細胞中表達水平；
[0034]圖4表示為實施例二制備的黑色素瘤患者D1-CAR慢病毒轉染NK細胞流式細胞檢測；
[0035]圖5表示為實施例二制備的晚期黑色素瘤和葡萄膜黑色素瘤患者來源D1-CAR慢病毒轉染NK細胞對A875的殺傷活性；
[0036]圖6表示為實施例二制備的晚期黑色素瘤和葡萄膜黑色素瘤患者來源D1-CAR慢病毒轉染NK細胞對MUM-2B的殺傷活性；
[0037]圖7表示為荷葡萄膜黑色素瘤MUM-2BSCID鼠模型NK細胞治療完之后腫瘤大小變化曲線。
【具體實施方式】
[0038]本發明發現特異結合SLAMF7以及FNv的雙特異嵌合抗原受體基因重組到病毒載體上并轉染人自然殺傷細胞，高表達該雙特異性嵌合抗原受體基因，可特異結合表達信號淋巴細胞激活分子家族成員7和纖連蛋白變異體的腫瘤細胞，并抑制自然殺傷細胞抑制性受體表達，避免了腫瘤細胞免疫逃避；同時激活第一信號和共刺激信號而引發抗腫瘤細胞毒性活性，體內體外試驗中激活了強烈地抗腫瘤應答。
[0039]對本發明涉及的一種雙特異性嵌合抗原受體基因修飾的自然殺傷細胞的制備方法進行具體說明。
[0040]本發明涉及一種雙特異性嵌合抗原受體基因修飾的自然殺傷細胞的制備方法，其特征在于，構建成含特異結合SLAMF7以及FNv的雙特異嵌合抗原受體基因重組到病毒載體上并轉染人自然殺傷細胞，高表達該雙特異性嵌合抗原受體基因，可特異結合表達信號淋巴細胞激活分子家族成員7和纖連蛋白變異體的腫瘤細胞，并抑制自然殺傷細胞抑制性受體表達，避免了腫瘤細胞免疫逃避；同時激活第一信號和共刺激信號而引發抗腫瘤細胞毒性活性，體內體外試驗中激活了強烈地抗腫瘤應答。
[0041 ]本發明所述雙特異嵌合抗原受體基因中SLAMF7以及FNv單鏈抗體特異結合惡性腫瘤細胞表達的SLAMF7以及FNv抗原，使得NK細胞產生抗腫瘤的靶向特異性，優選地，為靶向黑色素瘤、葡萄膜黑色素瘤和脈絡膜黑色素瘤等。
[0042]本發明所述的纖連蛋白變異體的特異嵌合抗原受體基因，包括纖連蛋白變異體的單鏈抗體并鏈接了特異結合抑制性受體基因啟動子的轉錄因子突變體(c-Myc突變體)的基因片段，抑制自然殺傷細胞表達抑制性受體，避免了腫瘤細胞免疫逃避，其高表達激活性受體特異結合腫瘤細胞表面配體而產生細胞毒性作用。所述轉錄因子c-Myc突變體，優選地，將該基因cl641位點突變為g，即亮氨酸(Leu362)突變為纈氨酸，可結合KIR基因上游啟動子并抑制了其轉錄。
[0043]本發明所述的含特異結合信號淋巴細胞激活分子家族成員7的特異嵌合抗原受體基因，包括特異結合信號淋巴細胞激活分子家族成員7的單鏈抗體并串聯了兩個共刺激分子胞內域(CD28和CD137)和CD3G胞內信號區的基因片段，可激活第一信號和共刺激信號，SP激活機體免疫應答而引發抗腫瘤細胞毒性活性和腫瘤凋亡作用。
[0044]同時所述雙特異性嵌合抗原受體基因之間鏈接了弗林蛋白酶切割位點，其在細胞內蛋白翻譯后可產生兩個獨立發揮功能的嵌合抗原受體。
[0045]本發明所述將人IFNy-信號肽-scFv(SLAMF7)-CD8a 鉸鏈區-CD28-CD137-CD3G 胞內區，以及ScFv(FNv)-1gD鉸鏈區-c-Myc突變體通過Furin切割位點和連接序列(Linker)連接在一起，形成重組基因序列，基因序列通過化學合成獲得，形成完整的雙特異性嵌合抗原受體基因的cDNA，S卩D1-CAR。
[0046]將兩個特異性嵌合抗原受體基因，即人IFNy -信號肽-scFV(SLAMF7)-⑶8a鉸鏈區-CD28-CD137-CD3G胞內區，以及ScFv(FNv)-1gD鉸鏈區-c-Myc突變體通過Furin切割位點和連接序列連接在一起，形成重組基因序列，序列通過化學合成獲得，形成完整的雙特異性嵌合抗原受體基因的cDNA，S卩D1-CAR;
[0047]將D1-CAR的目的DNA片段和pUC229載體Hind III/BamHI雙酶切后，在T4DNA連接酶作用下，將兩者于4°C、12小時連接反應制備克隆連接液，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5a后進行陽性克隆PCR鑒定和測序鑒定;PCR產物凝膠電泳檢測和測序鑒定符合D1-CAR大小和序列后，將測序正確的菌液轉接于1ml含相應抗生素的LB液體培養基中，37°C培養過夜，用北京天根生物無內毒素質粒小提中量試劑盒進行質粒抽提，抽提合格的重組質粒放置_80°C超低溫冰箱中長期保存；
[0048]將D1-CAR的目的DNA片段和pFLAG-CMV-2載體HindIII/BamH I雙酶切后，在T4DNA連接酶作用下，將兩者于37°C、12小時連接反應制備克隆連接液，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5a后進行陽性克隆PCR鑒定和測序鑒定；
[0049]取細胞狀態良好，處于對數生長期的293FT細胞，細胞計數后，按照每個1cm的培養皿6 X 16個細胞數接種于培養皿中，37°C，5%C02的培養箱中培養過夜;第二天轉染前移去培養液，換5ml Opt1-MEM培養液；取9yg包裝混合液和3yg慢病毒表達質粒加入1.5mlOpt1-MEM中，輕輕混勻，取36μ1 lipofectamine2000加入1.5ml Opt1-MEM中，輕輕混勻，室溫放置5min ；混合質粒溶液和I ipofectamine 2000稀釋液，置室溫20min ；混合液緩慢滴加至293FT細胞的培養液中，混勻，于37°C、5 %CO2細胞培養箱中培養;培養6h后棄去含有轉染混和物的培養基，加入1ml的PBS液清洗一次，輕柔晃動培養皿以洗滌殘余的轉染混和物后倒棄；緩慢加入含10%血清的細胞培養基20ml，于37°C、含5%⑶2培養箱內繼續培養48-72h；
[0050]根據細胞狀態，收集轉染后48h的293FT細胞上清液;于4°C，4000g離心lOmin，除去細胞碎片；以0.45μπι濾器過濾上清液于40ml超速離心管中；分別配平樣品，將帶有病毒上清液的超速離心管逐一放入至Beckman超速離心機內，設置離心參數為25000rpm，離心時間為2h，離心溫度控制在4°C;離心結束后，棄去上清，盡量去除殘留在管壁上的液體，加入病毒保存液，輕輕反復吹打重懸;經充分溶解后，高速離心lOOOOrpm，離心5min后，取上清熒光法測定滴度，病毒按照50μ1 2E+8TU/ml分裝，保存于-80°C超低溫冰箱。
[0051]本發明所述方法中自然殺傷細胞來源于自體靜脈血、自體骨髓、臍帶血和胎盤血等的單個核細胞。優選地，來源于癌癥患者手術一個月后、放化療一個月后采集的新鮮外周血或骨髓。
[0052]采集來源于患者自體外周血，經淋巴細胞分離液分離純化得到單個核細胞后，用RPMI 1640培養基重懸并稀釋到2-5\106細胞/1111，并補充1-500即/1111 IL-15、l_500ng/mlIL-12、l-500ng/ml IL-18、10-2000活性單位(IU)/ml IL-2和 10% 自體血清，每孔I.2ml加入到小鼠抗人CD 16包被的24孔板中，于37 °C、含5% CO2培養箱內繼續培養到第5天。第5天離心收獲NK細胞，并通過苔盼蘭計數。
[0053]第5天以3 X 16細胞/ml NK細胞加入到六孔培養板，每孔為2ml，于37°C、含5%CO2培養箱內培養過夜。第6天將20μ1 lE+7TU/ml重組D1-CAR慢病毒加入到人NK的六孔培養板中，體系為2ml，混勻，37 °C、5 %⑶2的培養箱中孵育8_12個小時后，更換完全培養液RPMI1640 4ml，所述完全培養液含l-500ng/ml IL-15、卜500ng/ml IL-12、l_500ng/ml IL-18、10-2000活性單位(IU)/ml IL-2和10%自體血清；當NK細胞生長密度達到6 X 16細胞/ml時，轉入75cm2培養瓶中生長，6孔對應I個培養瓶，補充完全培養液RPMI 1