receptor，Di_CAR)基因重組到病毒載體上并轉染人自然殺傷細胞(Natural killer cells,NK)； 所述雙特異性嵌合抗原受體(D1-CAR)基因的cDNA構建在病毒載體中，并轉染NK細胞，再將NK細胞培養到第21天，獲得D1-CAR-NK細胞;通過熒光定量PCR技術檢測，轉染了D1-CAR病毒載體的NKs其表達D1-CAR基因高于未轉染的NKs為50倍以上； 所獲得的自然殺傷細胞，高表達該雙特異性嵌合抗原受體基因，可特異結合表達信號淋巴細胞激活分子家族成員7和纖連蛋白變異體的腫瘤細胞，并抑制自然殺傷細胞抑制性受體表達，阻止了腫瘤細胞免疫逃避，同時激活第一信號和共刺激信號而引發抗腫瘤細胞毒性活性，體內體外試驗抗腫瘤具有很強殺傷毒性;其高表達其特異標志物CD16+/CD56+，陽性率高于80%以上，激活性受體陽性率超過80%以上，而抑制性受體陽性率低于10%以下。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述纖連蛋白變異體的特異嵌合抗原受體基因，包括纖連蛋白變異體的單鏈抗體并鏈接了特異結合抑制性受體基因啟動子的轉錄因子突變體(c-Myc突變體)的基因片段。3.根據權利要求1-2任一項所述的方法，其特征在于，所述的含特異結合信號淋巴細胞激活分子家族成員7的特異嵌合抗原受體基因，包括特異結合信號淋巴細胞激活分子家族成員7的單鏈抗體并串聯了兩個共刺激分子胞內域和CD3G胞內信號區的基因片段;所述兩個共刺激分子為⑶28和⑶137。4.根據權利要求1至3中任一項所述的方法，其特征在于，所述雙特異性嵌合抗原受體基因之間鏈接了弗林蛋白酶切割位點，其在細胞內蛋白翻譯后可產生兩個獨立發揮功能的嵌合抗原受體。5.根據權利要求1至4中任一項所述的方法，其特征在于，所述自然殺傷細胞來源于自體靜脈血、自體骨髓、臍帶血和胎盤血等的單個核細胞。6.一種雙特異性嵌合抗原受體基因修飾的自然殺傷細胞的制備方法，其特征在于， 將兩個特異性嵌合抗原受體基因，即人IFN γ -信號肽-scFV(SLAMF7)-⑶8a鉸鏈區-CD28-CD137-CD3G胞內區，以及ScFv(FNv)-1gD鉸鏈區-c_Myc突變體通過Furin切割位點和連接序列連接在一起，形成重組基因序列，序列通過化學合成獲得，形成完整的雙特異性嵌合抗原受體基因的cDNA JPD1-CAR; 將D1-CAR的目的DNA片段和pUC229載體Hind III/BamHI雙酶切后，在T4DNA連接酶作用下，將兩者于4°C、12小時連接反應制備克隆連接液，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5a后進行陽性克隆的PCR鑒定和測序鑒定;PCR產物凝膠電泳檢測和測序鑒定符合D1-CAR大小和序列后，將測序正確的菌液轉接于1ml含相應抗生素的LB液體培養基中，37°C培養過夜，用北京天根生物無內毒素質粒小提中量試劑盒進行質粒抽提，抽提合格的重組質粒放置_80°C超低溫冰箱中長期保存； 將D1-CAR的目的DNA片段和pFLAG-CMV-2載體Hind III/BamH I雙酶切后，在T4 DNA連接酶作用下，將兩者于37°C、12小時連接反應制備克隆連接液，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5a后進行陽性克隆的PCR鑒定和測序鑒定； 取細胞狀態良好，處于對數生長期的293FT細胞，細胞計數后，按照每個1cm的培養皿6X 16個細胞數接種于培養皿中，37°C，5%C02的培養箱中培養過夜;第二天轉染前移去培養液，換5ml Opt1-MEM培養液;取9yg包裝混合液和3yg慢病毒表達質粒加入1.5ml Opt1-MEM中，輕輕混勻，取36μ1 lipof ectamine2000加入1.5ml Opt1-MEM中，輕輕混勻，室溫放置5min ；混合質粒溶液和I ipofectamine 2000稀釋液，置室溫20min ；混合液緩慢滴加至293FT細胞的培養液中，混勻，于37 °C,5% CO2細胞培養箱中培養;培養6h后棄去含有轉染混和物的培養基，加入I Oml的PBS液清洗一次，輕柔晃動培養皿以洗滌殘余的轉染混和物后倒棄；緩慢加入含10 %血清的細胞培養基20ml，于37°C、含5 % CO2培養箱內繼續培養48_72h ； 根據細胞狀態，收集轉染后48h的293FT細胞上清液;于4°C，4000g離心1min，除去細胞碎片；以0.45μπι濾器過濾上清液于40ml超速離心管中；分別配平樣品，將帶有病毒上清液的超速離心管逐一放入至Beckman超速離心機內，設置離心參數為25000rpm，離心時間為2h，離心溫度控制在4°C;離心結束后，棄去上清，盡量去除殘留在管壁上的液體，加入病毒保存液，反復吹打重懸；經充分溶解后，高速離心lOOOOrpm，離心5min后，取上清熒光法測定滴度，病毒按照50μ1 2Ε+8 TU/ml分裝，保存于-80°C超低溫冰箱； 所述雙特異性嵌合抗原受體基因的cDNA(D1-CAR)構建在病毒載體中，并轉染NK細胞，再將NK細胞培養到第21天，獲得D1-CAR-NK細胞;通過熒光定量PCR技術檢測，轉染了D1-CAR病毒載體的NKs其表達D1-CAR基因高于未轉染的NKs為50倍以上； 所獲得自然殺傷細胞，其高表達其特異標志物CD16+/CD56+，陽性率高于80 %以上，激活性受體陽性率超過80%以上，而抑制性受體陽性率低于10%以下。7.根據權利要求1至6中任一項所述的方法，其特征在于， 采集來源于患者自體外周血，經淋巴細胞分離液分離純化得到單個核細胞后，用RPMI1640培養基重懸并稀釋到2-5 X 16細胞/ml，并補充l-500ng/ml IL-15、l_500ng/ml IL-12、l-500ng/ml IL-18、10_2000IU/ml IL-2和 10% 自體血清，每孔I.2ml加入到小鼠抗人⑶16包被的24孔板中，于37°C、含5^^02培養箱內繼續培養到第5天;第5天離心收獲NK細胞，并通過苔盼蘭計數。 第5天以3 X 16細胞/ml NK細胞加入到六孔培養板，每孔為2ml，于37 °C、含5 % CO2培養箱內培養過夜；第6天將20μ1 1Ε+7 TU/ml重組D1-CAR慢病毒加入到人NK的六孔培養板中，體系為2ml，混勻，37°(:、5^^02的培養箱中孵育8-12個小時后，更換完全培養液RPMI 16404ml，所述完全培養液優選含l-500ng/ml IL-15、l_500ng/ml IL-12、卜500ng/ml IL-18、10-2000活性單位(IU)/ml IL-2和10%自體血清；當NK細胞生長密度達到6 X 16細胞/ml時，轉入75cm2培養瓶中生長，6孔對應I個培養瓶，補充完全培養液RPMI 1640到50ml培養體系；于37°C、含5 % CO2培養箱內培養到第15-21天，期間根據NK細胞密度和培養基顏色變化補充含10-2000IU/ml IL-2和10%自體血清新鮮完全培養液RPMI 1640，并擴瓶到175cm2培養瓶中或轉移到I.5L培養袋中生長； 培養到第21天的NK細胞通過熒光定量PCR技術檢測，轉染了D1-CAR病毒載體的NKs其表達D1-CAR基因高于未轉染的NKs為50倍以上；蛋白印跡技術檢測其D1-CAR融合蛋白表達水平，可表達80卩￥(51^1^7)氣厶1? 53kDa和scFv(FNv)-CAR 42kDa的融合蛋白。8.根據權利要求1至7中任一項所述的方法，其特征在于，所述方法中培養獲得自然殺傷細胞，高表達其特異標志物⑶16+/⑶56+陽性率高于85%以上，激活性受體陽性率超過80%以上，而抑制性受體陽性率低于10%以下，所述的自然殺傷細胞引發抗體依賴性的細胞毒性活性，體內體外試驗具有很強抗腫瘤殺傷毒性。9.一種制備雙特異性嵌合抗原受體基因的自然殺傷細胞的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括； (1)獲得權利要求1-8任一項所述的穩定表達D1-CAR的病毒載體； (2)NK細胞因子，包括幾-15、幾-12、幾-18和11^-2; (3)鼠抗人⑶16包被24孔板； (4)淋巴細胞培養基，包括RPMI1640或無血清培養基； (5)淋巴細胞分離液； (6)生理鹽水； (7)使用說明書； 其中，所述使用說明書包括權利要求1-8中任一項所述的方法。10.權利要求1-9中任一項所述雙特異性嵌合抗原受體基因修飾的自然殺傷細胞的用途。
【專利摘要】本發明提供了一種雙特異性嵌合抗原受體基因修飾的自然殺傷細胞的制備方法，其中包括如下特征：構建成含特異結合信號淋巴細胞激活分子家族成員7以及纖連蛋白變異體的雙特異嵌合抗原受體基因重組到病毒載體上并轉染人自然殺傷細胞，高表達該雙特異性嵌合抗原受體基因，可特異結合表達信號淋巴細胞激活分子家族成員7和纖連蛋白變異體的腫瘤細胞，并抑制自然殺傷細胞抑制性受體表達，阻止了腫瘤細胞免疫逃避；同時激活第一信號和共刺激信號而引發抗腫瘤細胞毒性活性，在體內體外試驗抗腫瘤具有很強殺傷毒性；本發明還提供了一種含通過上述方法而得到的自體自然殺傷細胞制備的試劑盒，可獲得高表達該雙特異性嵌合抗原受體基因并引發強大的抗腫瘤效應。
【IPC分類】A61K35/17, C12N5/10, C12N15/86, A61P35/00, C12N15/62
【公開號】CN105647873
【申請號】
【發明人】陳建勛, 黃啟明
【申請人】紫程瑞生會(北京)生物技術發展有限公司
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年3月14日