640到50ml培養體系；于37°C、含5 % CO2培養箱內培養到第15-21天，期間根據NK細胞密度和培養基顏色變化補充含10-2000IU/ml IL-2和10%自體血清新鮮完全培養液RPMI 1640，并擴瓶到175cm2培養瓶中或轉移到I.5L培養袋中生長。
[0054]培養到第21天的NK細胞通過熒光定量PCR技術檢測，轉染了D1-CAR病毒載體的NKs其表達D1-CAR基因高于未轉染的NKs為50倍以上。蛋白印跡技術檢測其D1-CAR融合蛋白表達水平，可表達80?￥(51^1^7)氣41? 53kDa和scFv(FNv)-CAR 42kDa的融合蛋白。
[0055]本發明所述方法中來源30ml外周血單個核細胞誘導培養獲得自然殺傷細胞，增殖倍數達1000倍以上，培養到21天自然殺傷細胞數達3 X 19以上。
[0056]本發明所述方法中培養獲得的自然殺傷細胞，高表達其特異標志物⑶16+/⑶56+，陽性率高于80%以上，激活性受體陽性率超過80%以上，而抑制性受體陽性率低于10%以下，所述的自然殺傷細胞引發抗體依賴性的細胞毒性活性，體內體外試驗具有很強抗腫瘤殺傷毒性。
[0057]本發明使用的NK細胞激活培養器為使用小鼠抗人CD16單克隆抗體包被的培養板，包括48孔板、24孔板、12孔板、6孔板和培養瓶，優選地為24孔板。
[0058]本發明使用的細胞培養基為淋巴細胞無血清培養基或RPMI1640培養基加入含1-500ng/ml IL-15、l_500ng/ml IL-12、l_500ng/ml IL-18、10-2000活性單位(IU)/ml IL-2和10 % (體積比)自體血清或胎牛血清，優選地，細胞培養基為淋巴細胞無血清培養基，如CellGro SCGM、A頂_V、X_VIV0和GT-T551 等，含有含l_500ng/ml IL-15、l_500ng/ml IL-12、l-500ng/ml IL-18和10_2000IU/ml IL-2。
[0059]本發明還提供了一種制備雙特異性嵌合抗原受體基因的自然殺傷細胞的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括:
[0060](I)獲得如上所述的穩定表達D1-CAR的病毒載體；
[0061](2)NK 細胞因子，包括 IL-15、IL-12、IL-18 和 IL-2;
[0062]⑶鼠抗人CD 16包被24孔板；
[0063](4)淋巴細胞培養基，包括RPMI 1640或無血清培養基；
[0064](5)淋巴細胞分離液；
[0065](6)生理鹽水；
[0066](7)使用說明書；
[0067]其中，所述使用說明書包括如上所述的方法。
[0068]作為本發明NK細胞增殖培養中使用的細胞培養板、細胞培養皿、培養瓶、細胞培養袋，可例舉為75cm2細胞培養瓶、175cm2細胞培養瓶、225cm2細胞培養瓶、IL或2L細胞培養袋等細胞培養用器材(容器)，均可用于本發明，優選細胞培養袋。
[0069]本發明的制造方法中對NK細胞進行凍存，對凍存液無特殊限制，但優選例如為50 %小牛血清、40 %細胞培養液和1 % 二甲基亞砜，其中細胞培養液更優選為NK細胞培養液。
[0070]在培養基中可以添加血清或血漿進行培養。它們在培養基中的添加量不受特殊限制，如大于O容量％至20容量％，且可以根據不同的培養階段而改變血清或血漿的用量，優選為5% (體積比)。例如，可以階段性減少血清或血漿濃度來使用。另外，作為血清或血漿的來源，可以是自己(意味著與所培養的細胞來源相同)或非自己(意味著與所培養的細胞的來源不同)中的任一種，從安全性的觀點出發，優選自己來源的血清或血漿。另外，也可以添加如人血清白蛋白之類經分離純化的血清成分。
[0071 ]本發明的自體NK細胞增殖的制備使用上述各種成分及培養基來實施。本發明中使用的培養培養條件也沒有特殊限制，可以使用通常的細胞培養中使用的條件。例如，可在37°C、5%C02等條件下培養。還可以實施如下等操作:間隔適當的時間添加新鮮培養基來稀釋細胞培養液，或更換培養基，或更換細胞培養用器材等。
[0072]本發明還提供NK細胞在臨床應用中多次的抗腫瘤治療，更好地在生物體內發揮抗腫瘤免疫應答，達到很好的治療效果。此外，上述NK細胞還具有如下優點，多次NK細胞治療將更好地引發NK細胞殺瘤活性，阻止了腫瘤細胞免疫逃逸，激活機體自身免疫應答，產生高效、長效地抗腫瘤免疫效應，因此非常利于患者療效的提高和生存期的延長。
[0073]以下，結合實施例對本發明做更具體的描述，但本發明不限于此。
[0074]實施例一
[0075]重組D1-CAR基因構建及其慢病毒的制備
[0076]將人IFNy-信號肽-scFv(SLAMF7)-CD8a鉸鏈區-CD28-CD137-CD3G胞內區，以及ScFv(FNv)-1gD鉸鏈區-c-Myc突變體通過Furin切割位點和連接序列的基因片段構成，C-Myc突變體的第362個亮氨酸突變為纈氨酸，S卩c-Myc-L/V，見圖1，即D1-CAR融合蛋白示意圖。
[0077]將人IFNy-信號肽-scFv(SLAMF7)-CD8a鉸鏈區-CD28-CD137-CD3G胞內區，以及scFv(FNv)-1gD鉸鏈區-c-Myc突變體通過Fur in切割位點和連接序列(Linker)連接在一起，形成重組基因序列，基因序列通過化學合成獲得，形成完整的雙特異性嵌合抗原受體基因^cDNAJPD1-CAR;
[0078]將D1-CAR的目的DNA片段和pUC229載體Hind III/BamHI雙酶切后，在T4DNA連接酶作用下，將兩者于4°C、12小時連接反應制備克隆連接液，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5a后進行陽性克隆PCR鑒定和測序鑒定;PCR產物凝膠電泳檢測和測序鑒定符合D1-CAR大小和序列后，將測序正確的菌液轉接于1ml含相應抗生素的LB液體培養基中，37°C培養過夜，用北京天根生物無內毒素質粒小提中量試劑盒進行質粒抽提，抽提合格的重組質粒放置_80°C超低溫冰箱中長期保存;所述D1-CAR大小約為2607bp;
[0079]將D1-CAR的目的DNA片段和pFLAG-CMV-2載體HindIII/BamH I雙酶切后，在T4DNA連接酶作用下，將兩者于37°C、12小時連接反應制備克隆連接液，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5a后進行陽性克隆PCR鑒定和測序鑒定；
[0080]取細胞狀態良好，處于對數生長期的293FT細胞，細胞計數后，按照每個1cm的培養皿6 X 16個細胞數接種于培養皿中，37°C，5%C02的培養箱中培養過夜;第二天轉染前移去培養液，換5ml Opt1-MEM培養液；取9yg包裝混合液和3yg慢病毒表達質粒加入1.5mlOpt1-MEM中，輕輕混勻，取36μ1 lipofectamine2000加入1.5ml Opt1-MEM中，輕輕混勻，室溫放置5min ；混合質粒溶液和I ipofectamine 2000稀釋液，置室溫20min ；混合液緩慢滴加至293FT細胞的培養液中，混勻，于37°C、5 %CO2細胞培養箱中培養;培養6h后棄去含有轉染混和物的培養基，加入1ml的PBS液清洗一次，輕柔晃動培養皿以洗滌殘余的轉染混和物后倒棄;緩慢加入含10 %血清的細胞培養基20ml，于37°C、含5 % CO2培養箱內繼續培養72h。[0081 ] 根據細胞狀態，收集轉染后48h的293FT細胞上清液;于4°C，4000g離心lOmin，除去細胞碎片；以0.45μπι濾器過濾上清液于40ml超速離心管中；分別配平樣品，將帶有病毒上清液的超速離心管逐一放入至Beckman超速離心機內，設置離心參數為25000rpm，離心時間為2h，離心溫度控制在4°C;離心結束后，棄去上清，盡量去除殘留在管壁上的液體，加入病毒保存液，輕輕反復吹打重懸;經充分溶解后，高速離心lOOOOrpm，離心5min后，取上清熒光法測定滴度，病毒按照50μ1 2E+8TU/ml分裝，保存于-80°C超低溫冰箱，即制備成了 D1-CAR慢病毒。
[0082]實施例二
[0083]雙特異性嵌合抗原受體基因修飾的自然殺傷細胞的制備
[0084]采集晚期黑色素瘤和葡萄膜黑色素瘤患者30ml(與其簽署知情同意書)，加入等量I X PBS稀釋，沿離心管管壁輕輕疊加于淋巴細胞分離液上，形成明顯界面，室溫下2000rpm離心2011^11，吸取界面層的？81(:，用1\?83(?!1值為7.4)洗滌兩次。苔盤蘭計數后，用1^111640培養基重懸并稀釋到3 X 16細胞/ml，用RPMI 1640培養基重懸并稀釋到3 X 16細胞/ml，并補充50ng/ml IL_15、20ng/ml IL_12、20ng/ml IL-18、100IU/ml IL-2和 10% 自體血清，每孔1.2ml加入到小鼠抗人⑶16包被的24孔板中，于37°C、含5%⑶2培養箱內繼續培養到第5天。第5天離心收獲NK細胞，并通過苔盼蘭計數。
[0085]第5天以3 X 16細胞/ml NK細胞加入到六孔培養板，每孔為2ml RPMI1640培養基(含50ng/ml IL_15、20ng/ml IL_12、20ng/ml IL-18、100IU/ml IL