用lac系、trp系、TAC或TRC系、λ噬菌體的主要操 縱子和啟動子區域、fd包覆蛋白質的調節區域、針對糖酵解系酶(例如，3-磷酸甘油酸激酶、 甘油醛-3-磷酸脫氫酶）、谷氨酸脫羧酶A、絲氨酸羥甲基轉移酶的啟動子等。除了啟動子和 終止子序列以外，可作為其它調節元件的示例舉出的序列為選擇標記、擴增信號、復制起點 等。適宜的調節序列例如記載于"Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185"'Academic Press( 1990)中。
[0118] 上述說明的表達盒嵌入到例如由質粒、噬菌體、轉座子、IS元件、噬粒、粘粒、或者 線狀或環狀DNA等構成的載體中，使其插入到宿主微生物中。優選質粒和噬菌體。這些載體 在宿主微生物中可自體復制，也可通過染色體復制。適宜的質粒例如為：大腸桿菌的 pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHSl、pKK223-3、pDHE19.2、pHS2、 口卩1^236、？]\?1^4、？1^200、？1]1?290、？預-111113-81八 8七11或？8(1(：1;桿菌的？1^110、？(：194或 PBD214;棒狀桿菌屬的pSA77或pAJ667等。除它們以外，能夠使用的質粒等還記載于 "Cloning Vectors"、Elsevier、1985中。表達盒向載體中的導入可通過包括利用適當的限 制酶切割、克隆化以及連接的慣用方法進行。
[0119] 如上述那樣構建出具有本發明的表達盒的載體后，作為將該載體導入到宿主微生 物中時能夠適用的方法，例如使用共沉淀、原生質體融合、電穿孔、逆轉錄病毒轉染等慣用 的克隆化法和轉染法。它們的示例記載于"分子生物學的最新實驗計劃（Current Protocols in Molecular Biology)''，F .Ausubel 等，Publ · Wiley Inter science,New York，1997;或 Sambrook 等，"分子克隆：實驗室手冊"，第 2 版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor，NY，1989中。
[0120] 本發明人令人吃驚地發現，在不具有內源性肌肉肌醇生物合成通路的宿主微生物 內導入肌肉肌醇生物合成通路而得到的轉化體中，肌醇單磷酸酶活性具有重大作用。如上 所述，在迄今為止的任一研究中，均未對肌醇單磷酸酶活性予以特別關注。但是，出人意料 地，通過增強肌醇單磷酸酶活性，這樣的轉化體的肌肉肌醇生產能力大幅提高。此外，這樣 的轉化體以實質量生產出了本發明的肌肉肌醇衍生物。
[0121] 因而，本發明的一個方式包括:在由上述編碼肌醇-1-磷酸合成酶的外來基因轉化 得到的宿主微生物細胞中進行肌醇單磷酸酶的過剩生產。
[0122] 對于本發明中謀求的肌醇單磷酸酶，除了對肌醇-1-磷酸顯示出高底物特異性外， 還顯示出了可作用于廣泛的底物的磷酸單酯水解酶活性，從而包括實質上能夠水解肌醇-1-磷酸的蛋白質。作為代表性的肌醇單磷酸酶，例如已知有肌醇-1-單磷酸酶，大量生物來 源的該基因（suhB基因）在基因庫登錄號ZP_04619988、YP_001451848等中公布。特別是大 腸桿菌來源的的suhB基因（序列編號3:AAC75586(MG1655))的使用在以大腸桿菌為宿主細 胞的情況下較為方便。
[0123] 本領域技術人員容易理解，在肌醇-1-磷酸合成酶基因中記載的變異、修飾和密碼 子最佳化及表達盒、啟動子等調節序列和質粒等以及基于此的轉化的說明對于本發明的所 有肌醇單磷酸酶基因是適用的。從而可知，本發明中的肌醇單磷酸酶的過剩生產可通過利 用外來肌醇單磷酸酶基因的表達盒對上述宿主微生物進行轉化而達成。
[0124] 進一步認為，大量微生物細胞表達本發明中謀求的肌醇單磷酸酶活性（即，具有編 碼肌醇單磷酸酶活性的內源性基因）。因而，本發明中的肌醇單磷酸酶的過剩生產還可通過 進行下述操作而誘導：增加內源性肌醇單磷酸酶基因的拷貝數;在內源性肌醇單磷酸酶基 因的調節區域導入變異;利用高表達誘導性外來調節區域置換內源性肌醇單磷酸酶基因的 調節區域；以及使內源性肌醇單磷酸酶基因的調節區域缺失。具體地說，為了達成肌醇單磷 酸酶的過剩表達，可通過進行下述操作來達成:利用含有內源性肌醇單磷酸酶基因或含有 在該內源性基因的編碼化區域添加了適當的調節區域而得到的表達盒的構建體對上述宿 主微生物進行轉化，使該轉化體內的該肌醇單磷酸酶基因的拷貝數與原來的宿主細胞相比 實質上增加;對于具有內源性肌醇單磷酸酶基因的原來的宿主細胞，通過公知的基因重組 技術實施染色體的變異、添加和缺失;或者使用誘變劑等在染色體中隨機導入變異。可以使 用公知的SDS-PAGE分析法等對肌醇單磷酸酶的過剩生產進行確認。
[0125] 進一步地，用于增強肌醇單磷酸酶活性的本發明的其它方式包括:在由上述編碼 肌醇-1-磷酸合成酶的外來基因轉化得到的宿主微生物細胞中誘導肌醇單磷酸酶的活化。 為進行該目的，可示例出下述的方法:1)在內源性肌醇單磷酸酶基因中導入變異;2)置換內 源性肌醇單磷酸酶基因的一部分或全部;3)使內源性肌醇單磷酸酶基因的一部分缺失;4) 使降低肌醇單磷酸酶活性的其它蛋白質減少;和/或5)使降低肌醇單磷酸酶活性的化合物 的生成減少。
[0126] 關于用于增強上述肌醇單磷酸酶活性的1)~5)的方法，具體地說，通過在對肌醇 單磷酸酶的基因實施變異、添加或缺失后對該基因所編碼的肌醇單磷酸酶的活性進行評 價，從而得到肌醇單磷酸酶活性得到增強的肌醇單磷酸酶。
[0127] 對于如上所述得到的轉化體、例如利用具有外來肌醇-1-磷酸合成酶基因的表達 盒和肌醇單磷酸酶基因的表達盒的載體(各表達盒可以配置在不同或相同載體上)進行轉 染而得到的轉化體，為了進行本發明肌肉肌醇和肌肉肌醇衍生物生產，可在適于上述轉化 體的生長和/或維持的條件下進行培養和維持。來源于各種宿主微生物細胞的轉化體所用 的適宜的培養基組成、培養條件、培養時間對于本領域技術人員為已知的。
[0128] 培養基可以為含有1種以上的碳源、氮源、無機鹽、維生素以及必要時的微量元素 或維生素等微量成分的天然、半合成、合成培養基。但是，不消說所使用的培養基必須適當 滿足所要培養的轉化體的營養要求。進一步地，為了使上述轉化體與能夠由該轉化體轉換 為肌肉肌醇和肌肉肌醇衍生物的碳源進行接觸，本發明的培養基應該含有可最終作為肌肉 肌醇生產的底物使用的碳源、即可在轉化體內轉換為葡萄糖-6-磷酸的化合物。碳源可以為 D-葡萄糖、蔗糖、寡糖、多糖、淀粉、纖維素、米糠、廢糖蜜，進而可以為含有D-葡萄糖的生物 物質。作為適宜的生物物質，可示例出玉米分解液或纖維素分解液。此外，在轉化體表達有 用附加形狀的情況下、例如在具有針對抗生素的耐性標記的情況下，培養基可以含有相應 的抗生素。由此使發酵中的雜菌所致的污染風險降低。
[0129] 在宿主微生物無法同化上述的纖維素或多糖類等碳源的情況下，可通過實施在該 宿主微生物中導入外來基因等公知的基因工程方法使其適應于使用這些碳源的肌肉肌醇 生產中。作為外來基因，可以舉出例如纖維酶基因或淀粉酶基因等。
[0130] 培養可以為分批式也可以為連續式。并且，在任一情況下，均可為在適當的培養時 刻補給所追加的上述碳源等的形式。此外，培養應在維持適宜的溫度、氧濃度、pH等的條件 下繼續進行。來源于一般的微生物宿主細胞的轉化體的適宜培養溫度通常為15°C~45°C、 優選為25°C~37°C的范圍。宿主微生物為好氧性的情況下，為了確保發酵中的適當的氧濃 度，需要進行振蕩(燒瓶培養等）、攪拌/通氣(發酵罐培養等）。這些培養條件可由本領域技 術人員容易地設定。
[0131] 由上述培養物精制肌肉肌醇的方法對于本領域技術人員是公知的。在為原核微生 物宿主細胞的轉化體的情況下，肌肉肌醇在培養上清中或菌體內存在，必要時可由培養菌 體進行提取。在由培養菌體提取的情況下，例如，可對培養物進行離心分離、將上清與菌體 分離，利用均質器并同時利用表面活性劑、有機溶劑、酶等破壞菌體。作為由培養上清以及 必要時還由菌體提取液精制肌肉肌醇的方法，可以舉出：在實施了利用通過pH調整等進行 的蛋白質沉淀的除蛋白處理、通過利用活性炭的雜質吸附進行的去除、通過利用離子交換 樹脂等的離子性物質的吸附進行的去除之后，將干燥得到的固體從例如水-乙醇系中進行 再結晶。當然也可根據制品的目的純度省去部分工序、或者實施色譜法等追加精制工序，這 自不言說。
[0132] 另外，還可進一步從在適當條件下進行培養得到的上述培養物中得到本發明的新 穎的肌肉肌醇衍生物。代表性的本發明的肌肉肌醇衍生物被稱為l-4-〇-i3_D-吡喃葡萄糖肌 肉肌醇，具有下述結構。
[0133] [化 3]
[0134]
[0135] 上述的肌肉肌醇衍生物通過將本發明的轉化體在能夠生成比較大量的肌肉肌醇 (例如約30g/L~120g/L的程度)的培養基內進行培養來生產是有利的。即，對于本發明的轉 化體，與本發明的肌肉肌醇衍生物相比，其通常生產更大量的肌肉肌醇。但是，如下述的實 施例所示，根據添加在培養基中的葡萄糖的量的不同，本發明的轉化體不僅可生產更大量 的肌肉肌醇，而且還可生產肌肉肌醇衍生物，因而這樣的培養條件也適于得到本發明的肌 肉肌醇衍生物。
[0136] 本發明的肌肉肌醇衍生物可通過按照肌肉肌醇中的上述方法由培養物中進行粗 精制。例如，可通過對培養上清進行活性炭處理、接著利用離子交換樹脂（陽離子交換樹脂 和陰離子交換樹脂)進行處理來對本發明的肌肉肌醇衍生物進行粗精制。
[0137] 但是，由于上述粗精制物含有本發明的肌肉肌醇衍生物與肌肉肌醇這兩者，因而 在本發明的肌肉肌醇衍生物的分離中，需要從中分離出肌肉肌醇。例如，在上述粗精制的培 養液含有大量的肌肉肌醇的情況下，可通過對該粗精制液進行減壓濃縮使肌肉肌醇的一部 分析出，通過過濾等去除。進而，向該濾液中添加乙醇時，可使殘余的肌肉肌醇析出（析晶）。 因而，在適當地反復進行基于乙醇的析晶時，可得到所期望純度的本發明的肌肉肌醇衍生 物。或者可在進行析晶的同時或單獨通過色譜法、例如通過使用SUGAR KS-801和SUGAR KS-802以及Shodex Asahipak NH2P-50 4E(均為商品名，昭和電工株式會社制造）的制備型 HPLC等分別得到本發明的肌肉肌醇衍生物與肌肉肌醇。
[0138] 還確認到本發明的肌肉肌醇衍生物可由具有β1-4鍵的水解能力的β-葡糖苷酶容 易地分解，生成相應摩爾數的葡萄糖與肌肉肌醇。在利用葡糖苷酶等對本發明的肌肉肌 醇衍生物進行酶分解時，例如可向由水或緩沖液（乙酸緩沖液、磷酸緩沖液等）制備的本發 明的肌肉肌醇衍生物的溶液中添加適當量的酶，利用適于該酶反應的條件和時間對該溶液 進行培養。能夠在這樣的目的中有利地使用的葡糖苷酶有市售，它們均可使用，例如可利 用曲霉屬的霉來源的纖維二糖酶(SIGMA社）。所添加的酶量可參考廠家指示同時基于本發 明的肌肉肌醇衍生物在溶液中的濃度等來適當確定。此外，反應時的pH通常為pH 4.0~9.0 的范圍，但必要時可以為所使用的酶的最佳pH。另外，反應時的溫度也可為所使用的酶的最 佳溫度范圍，例如可為約20°C~50°C左右的范圍。關于反應時間，可定量追蹤本發明肌肉肌 醇衍生物的分解率，使其為大致全部的本發明肌肉肌醇衍生物轉換為肌肉肌醇的時刻。
[0139] 需要說明的是，如上所述，對于本發明的轉化體，由于在典型的培養條件下其在生 產肌肉肌醇的同時還以顯著少于肌肉肌醇的量生產本發明的肌肉肌醇衍生物，因而不消 說，可直接利用上述酶對該轉化體的培養物進行處理、或者在以活性炭處理程度對該培養 物進行粗精制后進行酶處理，從而將本發明的肌肉肌醇衍生物轉換為肌肉肌醇，由此進一 步提高肌肉肌醇的生產率。或者可以在分離出本發明的肌肉肌醇衍生物之后利用葡糖苷 酶進行處理，得到肌肉肌醇。此時，本發明的肌肉肌醇衍生物對于能夠利用肌