體的AKC-016-G22 株進行的新穎肌肉肌醇衍生物的生產。
[0194] 將含有氨芐青霉素（100mg/L)的LB培養基100mL裝入到500mL容量的試管中，利用 白金耳從培養AKC-016-G22株的微板上進行菌落的植菌，在37°C于180rpm進行3~5小時的 培養，直至0D(600nm)為0.5左右，將其作為主培養所用的前培養液。
[0195] 在10L容量的罐狀培養裝置(丸菱生物工程株式會社制造）中加入含有15g/L的葡 萄糖以及l〇〇mg/L的氨芐青霉素的下述合成培養基(表6)3L，添加60mL的前培養液進行主培 養。培養條件如下:培養溫度32°C ;培養pH 6.0〔下限〕；堿添加28 % (重量/容量)氨水;攪拌 850rpm;通氣1 vvm。適當添加作為原料的葡萄糖補料溶液(表7)以使培養液中的葡萄糖濃度 為0~5g/L。
[0196] [表 6]
[0197] 合成接羔甚鉑成
[0198] 總量
1 L
[0199] 使用8~1(0!1，將?!1調整為6.7
[0200] [表 7]
[0201]葡萄糖補料溶液
[0202] /Lli'
丄 ·*>
[0203] 在培養時間69.5小時后，將上述培養液的一部分在4 °C進行10，000g X 10分鐘離心 分離，回收上清。將上清利用將KS-G(保護柱）、Sugar KS-801和Sugar KS-802(均為商品名， 昭和電工株式會社制造)聯結的HPLC(移動相:水、柱溫度:70 °C、流速：lmL/min、檢測器:RI) 進行分析，結果肌肉肌醇濃度為l〇2g/L。
[0204] 另一方面，本發明的新穎肌肉肌醇衍生物（l-4-(H3-D-吡喃葡萄糖肌肉肌醇)通過 使用Shodex Asahipak MfeP-50 4E(商品名、昭和電工株式會社制造）的HPLC(移動相：水/ 乙腈=25/75、柱溫度:40°C、流速:0.8mL/min、檢測器:RI)進行分析，保留時間為17.4分鐘 (需要說明的是，在該分析中，肌肉肌醇的保留時間為13分鐘），在上述上清中以0.3g/L的濃 度含有。
[0205] 3-b)新穎的肌肉肌醇衍生物的分離
[0206] 使用大型離心機以8,800rpm對如上所述得到的培養液1000mL進行20分鐘離心，之 后進一步使用小型離心機以13,000rpm離心5分鐘。使用0.45μπι的過濾器(MILLIP0RE社 Omnipore膜型號JHWP09025 )，通過減壓過濾由所得到的上清中過濾出固體物質。向過濾器 過濾后的濾液l〇〇〇mL中添加活性炭SHIRASAGI A(商品名、日本EnviroChemicals社制造） 5g，利用攪拌器攪拌30分鐘。使用0.45μπι的過濾器，通過減壓過濾由該濾液中濾出活性炭。 在活性炭處理后的濾液中添加陽離子交換樹脂（〇1^311〇社制造411^61'1;^6 11?12013!1+型） 500mL，利用攪拌器攪拌30分鐘。使用0.45μπι的過濾器，通過減壓過濾由該濾液中濾出陽離 子交換樹脂。向陽離子交換處理后的濾液中添加陰離子交換樹脂（Organo社制造 AmberliteIRA96SB 0H-型）500mL，利用攪拌器攪拌30分鐘。使用0.45μπι的過濾器，通過減壓 過濾從該濾液中濾出陰離子交換樹脂。
[0207] 對于陰離子交換處理后的濾液1000mL，在70°C、100mbar條件下蒸發器蒸餾除去 水，4倍濃縮成250mL。自然冷卻至室溫后保存在4°C，使肌肉肌醇析出，之后減壓過濾濾出肌 肉肌醇。在189mL濾液的組成中，肌肉肌醇為5.83%、本發明的肌肉肌醇衍生物為0.131 % (均為W/V)。在室溫下向該濾液中添加乙醇189mL，進一步使肌肉肌醇析出，之后減壓過濾濾 出肌肉肌醇。在373mL濾液的組成中，肌肉肌醇為1.41%、本發明的肌肉肌醇衍生物為 0.067%。進一步使用蒸發器（70°(：、100 11*&〇由濾液中蒸餾除去乙醇，得到肌肉肌醇為 8.46%、本發明的肌肉肌醇衍生物為0.401 %的水溶液62mL。在室溫進一步向其中添加乙醇 186mL，使肌肉肌醇析出后，減壓過濾濾出肌肉肌醇。在244mL濾液的組成中，肌肉肌醇為 0.33 %、本發明的肌肉肌醇衍生物為0.100 %。使用蒸發器(70°C、1 OOmbar)，從濾液中蒸餾 除去乙醇和水，得到肌肉肌醇為3.30%、本發明的肌肉肌醇衍生物為0.998%的溶液24mL。 [0208]由于在上述溶液中確認到屬于與肌肉肌醇和本發明的肌肉肌醇衍生物不同的物 質（結構未鑒定)且難以從兩者中分離出的2種以上的雜質的存在，因而對各種精制方法進 行了研究，結果酶處理為有效的。即，相對于上述的肌肉肌醇和本發明的肌肉肌醇衍生物的 混合液500yL添加150mM 8丨8-1^8(?!17.0)緩沖液30(^1^、以及1001^/1111^-葡萄糖苷酶 (Sigma-Aldrich社制造，來自嗜熱脂肪芽胞桿菌)200yL，使用溫浴箱(AS ONE SI-300C)，在 反應溫度40 °C、1，200rpm攪拌下進行22小時反應。反應后，通過HPLC分析確認到上述雜質之 一被分解。其后將反應液利用99°C的干浴器(SIBATA制BI-1200)加熱5分鐘，使酶失活。對反 應后的濾液進行離心分離，之后使用0.45μπι的過濾器對上清進行過濾。將濾液冷凍干燥后， 加入水制成5mL的水溶液。向該濾液500yL中進一步添加150mM Bis-Tris(pH7.0)緩沖液300 yL、以及100UN/mLf3-葡萄糖苷酶(Oriental酵母工業株式會社制造，來自杏仁)200yL，使用 溫浴箱，在反應溫度40 °C、1，200rpm攪拌下進行0.5小時的短時間反應。反應后，通過HPLC分 析確認到另一雜質被分解。其后將反應液利用99°C的干浴器加熱5分鐘，使酶失活。離心分 離后，使用〇. 45μπι的過濾器對上清進行過濾。將濾液冷凍干燥后，加入水制成含有本發明的 肌肉肌醇衍生物約0.99%的水溶液(2.5mL)。
[0209]使用通過上述酶分解精制后的水溶液，設1次采樣量為1 OyL，進行200次的HPLC分 取。分取時的HPLC條件如下：
[0210] 柱：Shodex Asahipak NH2P-50 4E、
[0211] 移動相:水/乙腈= 25/75
[0212] 流速:0.8mL/min [0213]溫度：40°C [0214]檢測器:RI
[0215]自動采樣器:島津SIL-20A型總量試樣注入式
[0216]利用蒸發器(70°C、100mbar)從HPLC分取后的樣品中蒸餾除去乙腈，進一步還通過 冷凍干燥蒸餾除去水，得到本發明肌肉肌醇衍生物的干燥固體物質(產率:19mg)。
[0217] 3-c)新穎的肌肉肌醇衍生物的結構確定
[0218] 通過下述NMR分析對實施例3-b)中分取的化合物進行結構確定。
[0219] 裝置：Avance 600(Bruker Biospin社制造）
[0220] 探針:低溫探針(13C高靈敏度）
[0221] 測定溫度：18°C (為了防止試樣劣化以及在匪R時使水信號移動，全部為291K (18°〇)
[0222] 溶劑:D20(ALDRICH 社制造）
[0223] 內部標準:TSP
[0224] 咕觀測頻率:600.13MHz
[0225] 13C 觀測頻率：150.92MHz
[0226] 測定結果和峰的歸屬如下。需要說明的是，表中，峰編號的"GH-Γ表示葡萄糖殘基 的1位氫。另外，"ΙΗ-Γ表示肌肉肌醇殘基的1位氫。其它也是同樣的。
[0227][化8]
[0232] [表 9]
[0233] 表9:13C-NMR
[0234]
[0235] 另外，峰的歸屬通過COSY、CH-COSY、HMBC、二維J分解NMR確認。
[0236] 3-d)新穎肌肉肌醇衍生物的酶分解
[0237] 將實施例3_b)中分取的化合物利用屬于曲霉屬霉來源的β_葡糖苷酶的纖維二糖 酶(SIGMA社)進行分解。具體地說，將該化合物以6mg/ml的濃度溶解在400yL的150mM Bis-Tris緩沖液(pH = 7.0)中。向該溶液中加入25U/mL的纖維二糖酶100yL，在40°C培養直至22 小時（1200rpm、震蕩培養箱Μ · BR022、TAITEC社），使其反應。在反應第0小時、第3小時、第22 小時對反應液進行采樣，利用HPLC(柱：Shodex Asahipak NH2P-50 4E(商品名）、移動相： 水/乙腈= 25/75、流速:0.8mL/min、柱溫度:40°C、檢測器:RI)確認反應狀況。
[0238] 根據圖6所示的結果，在從反應開始的第3小時，本發明的肌肉肌醇衍生物大部分 發生分解，生成相應量的葡萄糖與肌肉肌醇。此外，在反應開始22小時后，本發明的肌肉肌 醇衍生物完全分解。由此判斷出，本發明的肌肉肌醇衍生物容易被葡糖苷酶分解。并且， 由該酶實驗也可確認到本發明肌肉肌醇衍生物的結構確定的的正確性。
[0239] 工業實用性
[0240] 本發明可用于肌肉肌醇及其衍生物的工業發酵生產。
【主權項】
1. 一種肌肉肌醇衍生物的制造方法，其包括下述工序： 1) 準備轉化體的工序，該轉化體為不表達內源性肌醇-1-憐酸合成酶的微生物的轉化 體，其至少含有W能夠在該轉化體內表達的方式導入的編碼肌醇-1-憐酸合成酶的外來基 因，并且具有對該轉化體內的功能性肌醇單憐酸酶的過剩生產或肌醇單憐酸酶的活化進行 誘導的基因重組或變異；W及 2) 在適于所述轉化體的生長和/或維持的條件下，使該轉化體與能夠由該轉化體轉換 為肌肉肌醇衍生物的碳源進行接觸的工序， 所述肌肉肌醇衍生物為下述結構式所表示的化合物： [化1]2. 如權利要求1所述的制造方法，其中，所述不表達內源性肌醇-1-憐酸合成酶的微生 物為原核生物。3. 如權利要求1或2所述的制造方法，其中，所述不表達內源性肌醇-1-憐酸合成酶的微 生物為具有內源性肌醇單憐酸酶基因的微生物。4. 如權利要求1或2所述的制造方法，其中，所述不表達內源性肌醇-1-憐酸合成酶的微 生物為選自由大腸桿菌、芽胞桿菌屬細菌、棒狀桿菌屬細菌、發酵單胞菌屬細菌組成的組中 的細菌。5. 如權利要求4所述的制造方法，其中，所述細菌為大腸桿菌。6. 如權利要求1或2所述的制造方法，其中，所述肌醇單憐酸酶的過剩生產是通過對所 述微生物導入外來肌醇單憐酸酶基因而誘導的。7. 如權利要求1或2所述的制造方法，其中，所述碳源包含可在所述轉化體內轉換為葡 萄糖-6-憐酸的化合物。8. 如權利要求7所述的制造方法，其中，所述碳源為選自由D-葡萄糖、薦糖、寡糖、多糖、 淀粉、纖維素、米慷、廢糖蜜W及含有D-葡萄糖的生物物質組成的組中的1種W上。9. 如權利要求1或2所述的制造方法，其中，該方法進一步包括W下工序： 分離肌肉肌醇衍生物的工序，該肌肉肌醇衍生物是在與所述碳源的接觸下進行生長 和/或維持的所述轉化體的培養物中累積得到的。
【專利摘要】本發明提供肌肉肌醇和肌肉肌醇衍生物的制造方法。本發明的目的在于，針對適于應用基因重組技術與合成生物學方法的大腸桿菌等不具有內源性肌肉肌醇生物合成通路的宿主微生物，賦予顯著得到改善的肌肉肌醇生產能力。在本發明中，使下述轉化體中的肌醇單磷酸酶活性增強，該轉化體是在不具有內源性肌肉肌醇生物合成通路的宿主微生物內導入肌肉肌醇生物合成通路而得到的。FERM BP-1151220121026
【IPC分類】C12R1/19, C12P19/46
【公開號】CN105647997
【申請號】
【發明人】小西一誠, 今津晉一, 佐藤真弓
【申請人】旭化成化學株式會社
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2012年11月9日